一种用于啮齿类动物异位心脏瓣膜移植的简化模型

摘要

本方案描述了一种在肾包膜下移植主动脉瓣瓣叶的简单高效方法，可用于研究心脏瓣膜的同种异体反应性。

摘要

临床上迫切需要能够随儿童生长的心脏瓣膜替代物。心脏瓣膜移植作为一种新型移植方式被提出，有望提供具有体细胞生长能力且无需抗凝治疗的持久性心脏瓣膜。然而，心脏瓣膜移植的免疫生物学特性尚未得到充分研究，因此亟需建立动物模型以探索这种新型移植方式。既往已有报道将主动脉瓣异位移植至腹主动脉的鼠类模型，但该方法技术难度高且成本昂贵。为应对这一挑战，研究人员在啮齿类动物中建立了肾包膜下移植模型，作为一种更实用、更简便的研究心脏瓣膜移植免疫生物学的方法。在该模型中，取单个主动脉瓣瓣叶并植入肾包膜下间隙。肾脏易于暴露，且移植组织被牢固地置于血供丰富的包膜下空间内，该空间可容纳多种尺寸的组织。此外，由于单只大鼠可提供三个主动脉瓣瓣叶，而单个肾脏可提供多个移植位点，因此特定研究所需的实验大鼠数量显著减少。本文详细描述了该移植技术，为深入研究心脏瓣膜移植的移植免疫学迈出了重要一步。

引言

先天性心脏病是人类最常见的先天性残疾，每年影响每1,000名活产婴儿中的7例¹。与成人患者可常规植入各种机械瓣膜和生物瓣膜不同，目前儿科患者尚无理想的瓣膜置换选择。这些传统植入物无法在患儿体内生长，因此随着儿童的成长，必须通过多次高风险的再次手术将心脏瓣膜植入物更换为尺寸更大的型号，受影响的儿童一生中往往需要接受多达五次或更多的开胸手术^2,3。研究表明，与年长儿童相比，婴儿在术后免于再次干预或死亡的生存率显著更低，其中60%的植入人工心脏瓣膜的婴儿在初次手术后3年内即面临再次手术或死亡的风险⁴。因此，迫切需要开发一种能够在儿科患者体内生长并长期维持功能的心脏瓣膜。

几十年来，实现可生长心脏瓣膜替代物的尝试主要集中在组织工程和干细胞领域。然而，迄今为止，这些瓣膜在临床转化方面尚未取得成功^5,6,7,8。为解决这一问题，提出了一种更具创新性的手术方法——心脏瓣膜移植，以实现具有自我修复能力并可避免血栓形成的可生长心脏....

方案

本研究经动物研究委员会批准，遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。

1. 动物模型（大鼠）信息

1. 所有手术操作均使用手术显微镜（参见材料表），放大倍数最高可达20倍。
2. 根据实验需要，移植时可采用同系（如Lewis-Lewis）或同种异体（如Lewis-布朗挪威）大鼠品系。
3. 选用适合实验目的、年龄在5至7周之间、体重为100至200克的大鼠。

2. 脱毛、皮肤准备和麻醉

1. 所有操作均需在无菌条件下进行。
   注意：该步骤应在专用的手术空间内并在无菌条件下完成。
2. 将大鼠放入麻醉诱导舱中，使用含5%异氟烷的氧气进行麻醉诱导。整个手术过程中以含3.5%异氟烷的氧气维持麻醉状态。
3. 供体手术时，使用毛发剪从脐部至胸骨切迹区域去除大鼠体毛；受体手术时，则在腋后线的手术区域从肋缘至骨盆范围剪除毛发。随后，使用外科消毒剂对皮肤进行消毒处理。
4. 手术开始前需确认大鼠达到适宜的外科麻醉深度。用镊子用力夹压大鼠脚趾以检验麻醉深度；若大鼠出现疼痛退缩反应，应根据需要调整麻醉剂量。
5. 整个手术过程中需持续临床监测呼吸频率及麻醉深度；根据需要调整异氟烷浓度，以维持呼吸频率在55–65次/分钟。

结果

为大鼠模型提供了实验设计的图示说明（图1）。此外，还展示了从供体心脏中分离的主动脉根部以及为植入准备的单个主动脉瓣瓣叶。 图2接下来，展示了主动脉瓣瓣叶在肾包膜下植入位置的代表性图像 图3A 以及在受体大鼠体内第3、7和28天图3B-D），表明定位和回收移植组织的简便性。

在同系动物异位移植后，主动脉瓣瓣叶仍保持其天然结构，表明该模型可作为比较同种异体移植免疫反应的基线。具体而言，苏木精和伊红（H&E）染色组织学结果显示，同系移植7天后的瓣叶结构完整，无水肿性肿胀迹象（图4A）。通过α-平滑肌肌动蛋白（aSMA）和CD31的免疫组织化学染色进一步证实了瓣叶的结构完整性（图.......

讨论

重要性与潜在应用
尽管机械瓣膜和生物瓣膜在需要瓣膜置换的成年患者中已常规使用，但这些瓣膜缺乏生长潜力，因此在儿科患者中效果不理想。心脏瓣膜移植是一种实验性手术，旨在为患有先天性心脏病的新生儿和婴儿提供可生长的心脏瓣膜替代物。然而，与传统心脏移植的移植免疫生物学不同，这种新型移植的移植免疫生物学机制仍研究甚少。本文介绍了一种独特的肾包膜下主动脉瓣瓣叶移植的大鼠模型，为研究心脏瓣膜移植的移植免疫生物学迈出了重要一步。

肾包膜下腔为研究心脏瓣膜移植免疫生物学提供了理想环境。移植组织被稳定地置于血供丰富的部位，可与循环免疫细胞充分接触²⁰。此外，既往已有成功应用肾包膜下模型检测胰腺、肝脏、肾脏及其他细胞类型同种异体移植物排斥反应的报道^{22,23,24,25.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠，USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 聚乳酸-910	Ethicon	J415H
7.5% 聚维酮碘	CareFusion	29904-004
70% 乙醇	Fisher Scientific	BP82031GAL
麻醉诱导室	Harvard Apparatus	75-2030	适用于大鼠的密闭式诱导室
麻醉机	Harvard Apparatus	75-0238	带被动废气清除功能的移动式麻醉系统
麻醉面罩	Harvard Apparatus	59-8255	大鼠专用麻醉面罩
棕色挪威大鼠（BN/Crl）	Charles River	品系编号 091	雄性，5–7 周龄，体重 100–200 g
盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	按 0.03 mg/kg 剂量皮下注射
电动剃毛剪	WAHL	79434
电热垫	Harvard Apparatus	72-0492	维持在 36–38 °C
肝素	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	左心房注射，100 U/100 g
胰岛素注射器，1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
弯头虹膜镊	World Precision Instruments	15917
直头虹膜镊	World Precision Instruments	15916
异氟烷，USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	以 5% 异氟烷与氧气混合进行诱导，维持麻醉时使用 3.5% 异氟烷与氧气混合
Lewis 大鼠（LEW/Crl）	Charles River	品系编号 004	雄性，5–7 周龄，体重 100–200 g
显微镊	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
显微剪	World Precision Instruments	501930	弹簧式 Vannas 剪
持针器	World Precision Instruments	500226	Ryder 持针器
手术显微镜	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x – 90x 体视显微镜
培养皿	Fisher Scientific	FB0875714
凡士林眼膏	Dechra	NDC 17033-211-38
皮肤缝合钉	Ethicon	PXR35	Proximate 35
无菌棉签	Puritan	25-806 1WC
无菌纱布块	Fisher Scientific	22-037-902
手术剪	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum 手术剪
威斯康星大学缓冲液（Servator B）	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	4 °C 保存