一种用于啮齿类动物异位心脏瓣膜移植的简化模型

摘要

本方案描述了一种在肾包膜下移植主动脉瓣瓣叶的简单高效方法，可用于研究心脏瓣膜的同种异体反应性。

摘要

临床上迫切需要能够随儿童生长的心脏瓣膜替代物。心脏瓣膜移植作为一种新型移植方式被提出，有望提供具有体细胞生长能力且无需抗凝治疗的持久性心脏瓣膜。然而，心脏瓣膜移植的免疫生物学特性尚未得到充分研究，因此亟需建立动物模型以探索这种新型移植方式。既往已有报道将主动脉瓣异位移植至腹主动脉的鼠类模型，但该方法技术难度高且成本昂贵。为应对这一挑战，研究人员在啮齿类动物中建立了肾包膜下移植模型，作为一种更实用、更简便的研究心脏瓣膜移植免疫生物学的方法。在该模型中，取单个主动脉瓣瓣叶并植入肾包膜下间隙。肾脏易于暴露，且移植组织被牢固地置于血供丰富的包膜下空间内，该空间可容纳多种尺寸的组织。此外，由于单只大鼠可提供三个主动脉瓣瓣叶，而单个肾脏可提供多个移植位点，因此特定研究所需的实验大鼠数量显著减少。本文详细描述了该移植技术，为深入研究心脏瓣膜移植的移植免疫学迈出了重要一步。

引言

先天性心脏病是人类最常见的先天性残疾，每年影响每1,000名活产婴儿中的7例¹。与成人患者可常规植入各种机械瓣膜和生物瓣膜不同，目前儿科患者尚无理想的瓣膜置换选择。这些传统植入物无法在患儿体内生长，因此随着儿童的成长，必须通过多次高风险的再次手术将心脏瓣膜植入物更换为尺寸更大的型号，受影响的儿童一生中往往需要接受多达五次或更多的开胸手术^2,3。研究表明，与年长儿童相比，婴儿在术后免于再次干预或死亡的生存率显著更低，其中60%的植入人工心脏瓣膜的婴儿在初次手术后3年内即面临再次手术或死亡的风险⁴。因此，迫切需要开发一种能够在儿科患者体内生长并长期维持功能的心脏瓣膜。

几十年来，实现可生长心脏瓣膜替代物的尝试主要集中在组织工程和干细胞领域。然而，迄今为止，这些瓣膜在临床转化方面尚未取得成功^5,6,7,8。为解决这一问题，提出了一种更具创新性的手术方法——心脏瓣膜移植，以实现具有自我修复能力并可避免血栓形成的可生长心脏瓣膜替代物。该方法并非移植整个心脏，而是仅移植心脏瓣膜，使其能够在受体儿童体内随生长而发育，类似于传统的心脏移植或Ross肺动脉自体移植^9,10,11。术后，受体儿童将接受免疫抑制治疗，直至移植的瓣膜不再需要继续生长，此时可将其更换为成人尺寸的机械假体瓣膜。然而，心脏瓣膜移植移植物的移植生物学特性仍尚未被探索。因此，需要动物模型来研究这种新型移植方式。

既往已有多种大鼠模型被用于将主动脉瓣异位移植至腹主动脉的研究^{12,13,14,15,16,17,18}。然而，这些模型操作极为复杂，通常需要经验丰富的外科医生才能成功实施。此外，这些模型成本高昂且耗时较长¹⁹。为此，研究人员建立了一种新型大鼠模型，旨在提供一种更为简便的动物模型，用于研究心脏瓣膜移植的免疫生物学特性。该模型通过切除单个主动脉瓣瓣叶，并将其植入肾包膜下间隙实现。肾脏特别适合用于研究移植排斥反应，因其具有丰富的血管化结构，并可充分接触循环中的免疫细胞^20,21。尽管已有其他研究利用肾包膜下模型研究胰腺、肝脏、肾脏和角膜等同种异体移植物的移植生物学特性^{22,23,24,25,26,27}，但本研究首次报道了将心脏组织移植至该部位的方法。本文详细描述了该移植技术，为深入研究心脏瓣膜移植的移植免疫学提供了重要的技术进步。

方案

本研究经动物研究委员会批准，遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》。

1. 动物模型（大鼠）信息

1. 所有手术操作均使用手术显微镜（参见材料表），放大倍数最高可达20倍。
2. 根据实验需要，移植时可采用同系（如Lewis-Lewis）或同种异体（如Lewis-布朗挪威）大鼠品系。
3. 选用适合实验目的、年龄在5至7周之间、体重为100至200克的大鼠。

2. 脱毛、皮肤准备和麻醉

1. 所有操作均需在无菌条件下进行。
   注意：该步骤应在专用的手术空间内并在无菌条件下完成。
2. 将大鼠放入麻醉诱导舱中，使用含5%异氟烷的氧气进行麻醉诱导。整个手术过程中以含3.5%异氟烷的氧气维持麻醉状态。
3. 供体手术时，使用毛发剪从脐部至胸骨切迹区域去除大鼠体毛；受体手术时，则在腋后线的手术区域从肋缘至骨盆范围剪除毛发。随后，使用外科消毒剂对皮肤进行消毒处理。
4. 手术开始前需确认大鼠达到适宜的外科麻醉深度。用镊子用力夹压大鼠脚趾以检验麻醉深度；若大鼠出现疼痛退缩反应，应根据需要调整麻醉剂量。
5. 整个手术过程中需持续临床监测呼吸频率及麻醉深度；根据需要调整异氟烷浓度，以维持呼吸频率在55–65次/分钟。

3. 供体手术

1. 按照步骤2所述准备并麻醉大鼠。使用解剖剪从剑突向胸骨切迹方向切开皮肤。在胸骨两侧剪断肋骨，进行胸骨切除术，直至充分暴露心脏。
2. 通过左心房注射 100 U/100 g 肝素对大鼠进行肝素化处理。
3. 处死供体 通过 放血处死
4. 切除胸腺以更好地显露大血管。随后，将心脏连同升主动脉整块切除，直至无名动脉水平。

4. 主动脉瓣瓣叶的制备

1. 心脏切除术后，立即将供体心脏置于无菌培养皿中，并在冰冻的冷保存缓冲液中进行解剖（参见材料表）。
2. 使用镊子和Vannas弹簧剪，解剖供体心脏，直至仅保留主动脉根部，并在主动脉瓣近端保留1 mm的心室袖状组织。
3. 沿左冠状窦与无冠状窦之间的瓦氏窦做纵向切口，打开主动脉瓣，以观察全部三个瓣叶。
   注意：切口应贯穿整个瓦氏窦，实际尺寸取决于大鼠的大小。
4. 逐个切除主动脉瓣瓣叶。具体操作为：用钝头镊子夹住瓣叶边缘，使用Vannas弹簧剪从一个交界处向下剪至瓣环，再向下一个交界处剪切，以完整切除瓣叶。
   注意：应特别注意仅夹持瓣叶边缘，以尽量减少对瓣膜内皮细胞的损伤。
5. 在切除瓣叶后，将样本保存于冰冻的保存缓冲液中，直至准备移植到受体大鼠体内。所有瓣叶应在冷保存4小时内完成移植。

5. 受体操作

1. 按照步骤2所述准备并麻醉大鼠。 使用维持在36–38 °C的加热垫进行手术。
2. 所有受体大鼠在术前及术后每6–12小时根据需要皮下注射布托啡诺（0.03 mg/kg），以缓解疼痛。
3. 将大鼠置于右侧卧位，以便接触左肾。
   注：由于左肾相对于右肾位置更偏尾侧，因此优先选择左肾。
4. 使用剪刀沿腰部纵向切开皮肤约1英寸。
   注：切口必须小于肾脏的大小，以提供足够的张力，防止肾脏在操作过程中回缩至腹腔内。
5. 同样地，切开下方的腹壁。
6. 将肾脏外置
   1. 用拇指和食指在背侧和腹侧施加轻柔压力，同时使用弯头镊子将肾脏的尾极通过腹壁和皮肤切口提起。以类似方式将肾脏的头端外置。
   2. 或者，可通过夹住肾周脂肪并轻轻向上牵拉的方式将肾脏外置。
      注：注意避免直接夹持肾脏或肾血管。
   3. 一旦肾脏被外置，应持续滴加温生理盐水保持其湿润。
7. 创建肾包膜下腔隙。
   1. 使用一对钝头镊子轻压肾包膜，使肾包膜与下方实质清晰分离。同时使用另一对钝头镊子小心夹住包膜，轻轻向上牵拉，形成包膜上的小孔。
      注：由于包膜较为脆弱，建立切口所需力量极小。
   2. 继续使用钝头镊子扩大切口，直至形成约2 mm的空间，以容纳主动脉瓣瓣叶。
   3. 在用一对镊子提起切口边缘的同时，将钝头探针插入肾包膜下方，扩展出一个略大于瓣叶的浅表包膜下腔隙。
8. 将主动脉瓣移植至包膜下腔隙。
   1. 从低温保存中取出主动脉瓣瓣叶，并置于手术区域。
   2. 在提起纤维包膜边缘的同时，使用钝头镊子将主动脉瓣瓣叶推进包膜下腔隙。
      注：确保组织远离切口，使其牢固固定于包膜下方。操作时应避免损伤下方实质或进一步撕裂纤维包膜。
   3. 肾包膜上的切口可保持开放。
9. 通过对切口边缘施加反向牵引，轻柔地将肾脏推回其解剖位置。
10. 使用连续无菌缝线关闭腹壁切口，皮肤则使用缝合钉闭合。
11. 术后护理
    1. 手术后，将大鼠置于清洁笼具中，并放置于加热垫上，确保可自由获取食物和水。
    2. 每日监测动物状况，评估伤口常规愈合情况以及疼痛或不适的迹象。术后7–10天拆除缝合钉。

6. 用于分析的组织采集

1. 在移植后的选定时间点，通过放血法处死动物。具体操作：在5%异氟烷氧气混合气体麻醉下，行正中腹切口，并横断腹主动脉。
2. 游离肾脏，用剪刀切断肾动脉、肾静脉和输尿管以切除肾脏。
   注意：操作时避免夹持含有移植叶状组织的区域。
3. 将肾脏置于福尔马林中固定过夜，包埋于石蜡中，并进行所需染色的切片。切片时应使肾包膜朝向前方，肾实质朝向后方。

结果

为大鼠模型提供了实验设计的图示说明（图1）。此外，还展示了从供体心脏中分离的主动脉根部以及为植入准备的单个主动脉瓣瓣叶。 图2接下来，展示了主动脉瓣瓣叶在肾包膜下植入位置的代表性图像 图3A 以及在受体大鼠体内第3、7和28天图3B-D），表明定位和回收移植组织的简便性。

在同系动物异位移植后，主动脉瓣瓣叶仍保持其天然结构，表明该模型可作为比较同种异体移植免疫反应的基线。具体而言，苏木精和伊红（H&E）染色组织学结果显示，同系移植7天后的瓣叶结构完整，无水肿性肿胀迹象（图4A）。通过α-平滑肌肌动蛋白（aSMA）和CD31的免疫组织化学染色进一步证实了瓣叶的结构完整性（图...

讨论

重要性与潜在应用
尽管机械瓣膜和生物瓣膜在需要瓣膜置换的成年患者中已常规使用，但这些瓣膜缺乏生长潜力，因此在儿科患者中效果不理想。心脏瓣膜移植是一种实验性手术，旨在为患有先天性心脏病的新生儿和婴儿提供可生长的心脏瓣膜替代物。然而，与传统心脏移植的移植免疫生物学不同，这种新型移植的移植免疫生物学机制仍研究甚少。本文介绍了一种独特的肾包膜下主动脉瓣瓣叶移植的大鼠模型，为研究心脏瓣膜移植的移植免疫生物学迈出了重要一步。

肾包膜下腔为研究心脏瓣膜移植免疫生物学提供了理想环境。移植组织被稳定地置于血供丰富的部位，可与循环免疫细胞充分接触²⁰。此外，既往已有成功应用肾包膜下模型检测胰腺、肝脏、肾脏及其他细胞类型同种异体移植物排斥反应的报道^{22,23,24,25...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠，USP	Baxter	NDC 0338-0048-04
4-0 聚乳酸-910	Ethicon	J415H
7.5% 聚维酮碘	CareFusion	29904-004
70% 乙醇	Fisher Scientific	BP82031GAL
麻醉诱导室	Harvard Apparatus	75-2030	适用于大鼠的密闭式诱导室
麻醉机	Harvard Apparatus	75-0238	带被动废气清除功能的移动式麻醉系统
麻醉面罩	Harvard Apparatus	59-8255	大鼠专用麻醉面罩
棕色挪威大鼠（BN/Crl）	Charles River	品系编号 091	雄性，5–7 周龄，体重 100–200 g
盐酸丁丙诺啡，0.3 mg/mL	PAR Pharmaceutical	NDC 42023-179-05	按 0.03 mg/kg 剂量皮下注射
电动剃毛剪	WAHL	79434
电热垫	Harvard Apparatus	72-0492	维持在 36–38 °C
肝素	Sagent Pharmaceuticals	NDC 25021-400-10	左心房注射，100 U/100 g
胰岛素注射器，1 mL	Fisher Scientific	14-841-33
弯头虹膜镊	World Precision Instruments	15917
直头虹膜镊	World Precision Instruments	15916
异氟烷，USP	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25	以 5% 异氟烷与氧气混合进行诱导，维持麻醉时使用 3.5% 异氟烷与氧气混合
Lewis 大鼠（LEW/Crl）	Charles River	品系编号 004	雄性，5–7 周龄，体重 100–200 g
显微镊	World Precision Instruments	500233	Dumont #5
显微剪	World Precision Instruments	501930	弹簧式 Vannas 剪
持针器	World Precision Instruments	500226	Ryder 持针器
手术显微镜	AmScope	SM-3BZ-80S	3.5x – 90x 体视显微镜
培养皿	Fisher Scientific	FB0875714
凡士林眼膏	Dechra	NDC 17033-211-38
皮肤缝合钉	Ethicon	PXR35	Proximate 35
无菌棉签	Puritan	25-806 1WC
无菌纱布块	Fisher Scientific	22-037-902
手术剪	World Precision Instruments	1962C	Metzenbaum 手术剪
威斯康星大学缓冲液（Servator B）	S.A.L.F S.p.A.	6484A1	4 °C 保存