完全麻醉的A型血友病小鼠尾静脉横断出血模型

摘要

在麻醉小鼠中改良的尾静脉横断（TVT）出血模型是一种用于评估血友病出血的敏感体内方法。该优化后的TVT出血模型以失血量和出血时间作为终点指标，改进了其他模型，并避免将死亡作为终点指标。

摘要

尾部出血模型是血友病研究中的重要工具，尤其用于评估促凝血效应。由于尾静脉横断（TVT）存活模型对临床相关剂量的FVIII具有较高的敏感性，因此在许多研究中被优先采用；而其他已建立的模型（如尾夹模型）则需要更高剂量的促凝血化合物。为避免将存活作为实验终点，我们开发了一种TVT模型，以失血量和出血时间作为终点指标，并在整个实验过程中实施完全麻醉。简言之，将麻醉后的小鼠置于37°C温盐水中浸没尾部，并通过右侧尾静脉给予待测化合物。5分钟后，使用模板引导横断左侧尾静脉，随后将尾部放回盐水中，在接下来的40分钟内持续监测并记录所有出血事件，同时收集血液。若在损伤后10分钟、20分钟或30分钟时未见出血，则用湿润纱布轻轻擦拭切口两次以轻柔挑战血凝块。40分钟后，通过测定盐水中血红蛋白的含量来量化失血量。该方法快速且相对简便，可产生稳定且可重复的出血结果。与TVT存活模型相比，该方法更加人道，且不降低对药理干预的敏感性。此外，该模型可同时使用雄性和雌性动物，从而减少所需繁育的动物总数，符合3R原则。出血模型的一个潜在局限在于止血过程具有随机性，可能影响模型的可重复性。为克服这一问题，通过人工破坏血凝块确保在监测期间对凝块进行挑战，防止初级（血小板介导）止血过早终止出血。该模型的建立丰富了出血损伤模型的种类，为以标准化且人道的方式表征促凝血效应提供了新的选择。

引言

动物模型对于理解血友病的发病机制以及开发和测试治疗方案与疗法至关重要。凝血因子VIII基因敲除小鼠（F8-KO）是研究A型血友病广泛使用的模型^1,2。这些小鼠重现了该疾病的关键特征，并已被广泛用于开发治疗方法，例如重组FVIII产品^3,4,5和基因治疗策略^6,7。

有多种出血损伤模型可用于评估不同止血化合物在体内的药理作用。in vivo。其中一种凝血模型是小鼠尾静脉横断存活模型^{8,9,10,11,12,13,}

方案

本方案中所述所有操作均已获得诺和诺德公司动物福利委员会以及丹麦动物实验监察局、丹麦食品农业与渔业部的批准。优化后的40分钟方法在设计中包含了麻醉和给药时间（图1）。本操作需使用10至16周龄的雄性和雌性血友病小鼠。

1. 研究前的准备工作

1. 配制正确浓度的给药溶液。
2. 启动水浴并加热至 37 °C。用生理盐水（0.9% NaCl）填充用于血液采集的 15 mL 离心管。
3. 在实验开始前至少 15 分钟，将装有生理盐水的 15 mL 管放入已预热的底板孔中。
4. 对小鼠进行标识并记录其体重。尽量避免不必要的抓取，以免造成应激反应而影响实验结果。
5. 在通风橱内提前准备好工作台，确保所有物品触手可及：纸巾、尾部固定器、纱布、注射器、手术刀、秒表和血流记录纸。
6. 将尾部标记和切割块放置在加热板上——低温的模块会导致静脉收缩，从而影响出血。

2. 麻醉

1. 在通风橱内进行异氟烷麻醉操作。
2. 将气体挥发器初始设置为5%异氟烷，载气为30% O₂/70% N₂O，气体流速1 L/min，在麻醉舱内通气。确保麻醉舱充分充气（约5分钟，具体时间取决于舱体体积和气体流速）。
   ....

结果

为评估优化模型的适用性，在遗传背景为 C57BL 的 F8-KO 小鼠中开展了一项研究，给予 commercially available 重组因子 VIII 替代疗法（rFVIII）；测试了四种不同剂量：1 IU/kg、5 IU/kg、10 IU/kg 和 20 IU/kg。此外，我们在 F8-KO 小鼠中测试了相应的载体（阴性）对照，并以 C57BL 小鼠作为野生型（WT）组作为阳性对照组，以评估模型中的反应范围。

根据优化后的实验方案，与对照组相比，rFVIII治疗组的失血量显著减少。此外，与对照组相比，5 IU/kg、10 IU/kg和20 IU/kg治疗组的出血时间也有所缩短（图2）。在野生型小鼠中，总失血量范围为201.8–841.9 nmol Hgb（95% CI），而对照组小鼠的失血量范围为5335–7148 nmol Hgb（95% CI）。根据约1000 nmol Hgb相当于125 µL全血的换算关系，对照组小鼠的平均出血量为780.25 µL，而20 IU/kg组为89.95 µL。因此，20 IU/kg剂量可使出血完全恢复.......

讨论

与尾静脉切开（TVT）存活法相比，这种优化的尾静脉横断（TVT）方法具有多项优势。实验动物在整个研究过程中均处于完全麻醉状态，这不仅使小鼠操作更为简便，也提升了动物福利。此外，与TVT存活模型不同，该方法无需过夜观察，且可在40分钟内精确测量失血量并记录确切的出血时间。在清醒动物中长时间出血可能导致失血性死亡，引发动物疼痛与痛苦，甚至造成应激反应，进而可能增加实验数据的变异性¹⁴。失血量和出血时间已被成功地表征并验证为有效的实验终点指标，可替代以死亡或濒死时间为终点的传统方法。由于采用切割块导板进行TVT操作，实际的尾部损伤部位明确且标准化，确保切口具有良好的可重复性，降低了手术难度和技术差异。因此，该模型具有更高的稳健性，可减少所需实验动物数量。此外，已有数据表明，雄性和雌性小鼠均可用于该模型，符合3R原则，从而减少所需繁育的动物总数。结合这些观察结果还发现，在高出血组中，雌性小鼠出血量略少且个体间变异略大，但在低出血组中无此差异。较低的失血量可能与雌性小鼠体型较小、相对于同龄雄性血液总量较少有关。

血友病患者通常发生内出血，主要累.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#11 手术刀片	Swann-Morton	503
15 mL 离心管	Greiner Bio-One，奥地利	188271
连接至 300 µL 精密（胰岛素）注射器的 30 G 针头，用于给药	BD Micro-Fine + U-100 胰岛素注射器	320830
Advate	Takeda，日本		重组八因子替代疗法（rFVIII）
70% 乙醇酒精棉片	Hartmann，Soft-Zellin	999 979
离心机	Omnifuge 2.0 RS，Heraus Sepatech
切割模板（不锈钢）	自行制备，欢迎联系作者获取精确图纸		补充图 2：尺寸规格：20 mm × 40 mm × 10 mm（长 × 宽 × 高）；凹槽：深度 3 mm，宽度 3 mm；半径 1.5 mm
红细胞（RBC）裂解液	Lysebio，ABX Diagnostics	906012
纱布
血液分析仪	Sysmex	CT-2000iv
带支架的加热灯	Phillips	IR250
带恒温器的加热垫	CMA	型号 150
血红蛋白标准品和质控品 — 8.81 mmol/L，批次依赖	HemoCue，丹麦	HemoCue 校准品，707037	标准品和质控品由两支不同的 HemoCue 校准品制备。其数值依据国际血红蛋白参考方法（ICSH）确定。
异氟烷麻醉系统，配备管路、面罩和诱导箱	Sigma Delta Dameca
异氟烷	Baxter	26675-46-7
带照明的放大镜	Eschenbach
测量模板（铝制）	自行制备，欢迎联系作者获取精确图纸		补充图 1：尺寸规格：20 mm × 40 mm × 10 mm（长 × 宽 × 高）；凹槽：深度 2.5 mm，宽度 2.5 mm；半径 1.25 mm
微量移液器及吸头	Finnpipette
分光光度计	Molecular Devices Corporation，加利福尼亚州，美国	SpectraMax 340 分光光度计
Prism 软件	GraphPad，加利福尼亚州圣迭戈，美国	版本 9.0.1
0.9% NaCl 生理盐水	Fresenius Kabi，瑞典	883264
TVT 尾部切割专用尾部标记块
尾部固定器
真空液体抽吸装置	Vacusafe comfort，IBS
水浴锅及恒温器	TYP 3/8 Julabo