方法文章

在微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头的人类运动单元

DOI：

10.3791/62959

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2021年9月7日

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1Department of Neurosciences, Experimental Neurology, and Leuven Brain Institute, KU Leuven - University of Leuven, 2VIB Bio Imaging Core, KU Leuven - University of Leuven, 3Department of Development and Regeneration, Stem Cell and Developmental Biology, KU Leuven - University of Leuven, 4Department of Neurology, University Hospitals Leuven

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们描述了一种在市售微流控装置中生成人类运动单位的方法，该方法通过共培养人诱导多能干细胞来源的运动神经元与人原代中血管母细胞来源的肌管细胞，从而形成功能性活跃的神经肌肉接头。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经肌肉接头（NMJs）是下运动神经元轴突与肌肉之间形成的特化突触，介导肌肉收缩的启动。在运动神经元疾病中，例如肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA），神经肌肉接头发生退变，导致肌肉萎缩和进行性瘫痪。由于缺乏可转化的研究模型，神经肌肉接头退变的潜在机制尚不明确。本研究旨在建立一种多功能且可重复的 体外 具有功能性神经肌肉接头（NMJs）的人体运动单元模型。因此，将人诱导性多能干细胞（hiPSC）来源的运动神经元与人原代中血管母细胞（MAB）来源的肌管在市售的微流控装置中进行共培养。利用流体隔离的微区室结构，可在允许细胞通过微沟槽接触的同时，维持各自细胞特异性的微环境。通过施加趋化性与体积梯度，促进运动神经元的神经突经由微沟槽生长，从而增强与肌管的相互作用并诱导NMJs的形成。这些NMJs通过免疫细胞化学方法鉴定，表现为运动神经元突触前标志物突触素（SYP）与肌管上突触后乙酰胆碱受体（AChR）标志物α-银环蛇毒素（Btx）的共定位，并利用扫描电子显微镜（SEM）进行形态学表征。通过在运动神经元去极化后检测肌管内的钙信号反应，验证了NMJs的功能性。利用标准微流控装置与干细胞技术构建的运动单元模型，可为未来研究健康与疾病状态下NMJs的功能提供有力工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经肌肉接头（NMJs）通过释放神经递质介导脊髓下运动神经元与骨骼肌纤维之间的通信1。在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等运动神经元疾病中，神经肌肉接头发生退化，导致与肌肉的通信中断2,3,4,5,6,7。这使得患者逐渐丧失肌肉功能，最终因膈肌等重要肌群进行性萎缩而需要依赖轮椅，并需呼吸机维持生命。目前尚不清楚这些疾病中神经肌肉接头严重丧失的确切潜在机制。已有许多研究利用转基因动物模型，使我们对神经肌肉接头退行性变的发病机制有了一定认识5,6,8,9,10,11。然而，要全面理解其病理过程并对抗去神经化，建立一个可完全访问的人类研究系统至关重要。

在此方案中，介绍了一种相对简便的方法，通过使用市售的微流控装置共培养由人诱导多能干细胞（hiPSC）分化的运动神经元和由人原代肌源性祖细胞（MAB）分化的肌管，从而生成人神经肌肉接头（NMJ）。利用微流控技术对神经元的胞体与轴突进行极化及流体隔离的方法，自“Campenot”室首次被描述以来已有报道。12 20世纪70年代末以来，微流控技术不断发展，已开发出多种微流控设计，包括商业化产品。本方案所用装置包含两个腔室，每个腔室由两个通过通道相连的孔组成13两个腔室呈对称分布，并通过多个微通道相连。这些微通道的尺寸可促进神经突的生长，同时借助毛细管静水压实现两个腔室之间的流体隔离。13,14利用该系统，可在不同区室中分别培养运动神经元和肌细胞，并使用各自特定的培养基，同时通过微沟道中神经突的延伸实现与肌细胞的物理连接。该模型具有完全可及性和可调节性 体外 人类运动单位系统，可用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）和脊髓性肌萎缩症（SMA）等疾病中神经肌肉接头的早期病理变化。

方案

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所有受试者均提供了书面知情同意书，同意提供样本用于诱导多能干细胞（iPSC）的生成和MAB的收获。该研究方案已获得鲁汶大学医院医学伦理委员会（编号 S5732-ML11268）以及英国主要研究伦理委员会的批准，属于StemBANCC项目的一部分。本实验方案中使用的所有试剂和设备均列于材料表中，且应使用无菌物品。除非另有说明，培养基在使用前应加热至室温（RT）。有关共培养方案的概览，请参见图1。

1. 由iPSCs分化产生运动神经元前体细胞

  1. 按照先前研究改编的运动神经元分化方案1516，进行至第10天神经前体细胞（NPCs）阶段。根据该方案的时间安排，分化起始于星期一（第0天），至星期四达到第10天NPCs状态。
  2. 将第10天NPCs以每管2 × 106–4 × 106个细胞的密度，使用无血清替代物加10%二甲基亚砜（DMSO）进行冻存。
    警告：DMSO具有毒性，操作时须在通风橱中佩戴个人防护装备。
    ​注：预计第10天NPCs在解冻后约有50%细胞保持活性。在此“第10天NPCs”阶段暂停运动神经元分化方案，并将NPCs冻存，以便大量储备后续使用，从而将共培养方案的总时长从28天缩短至19天。

2. 人类MABs的分离与培养

注意：MABs 是血管相关性间充质干细胞，本实验中取自一位 58 岁健康供体的活检组织。也可使用其他商业来源。此处简要说明获取 MABs 的实验方案。如需更多信息，请参阅详细方案17。所有 MAB 培养基在使用前应加热至 37 °C。

  1. 将活检组织切碎，并在包被了胶原蛋白（来自小牛皮）的6 cm培养皿中，使用生长培养基（表 1）孵育2周。每4天更换一次培养基。
    1. 制备胶原蛋白包被时，将100 mg胶原蛋白溶解于20 mL 0.1 M乙酸中。胶原蛋白溶解较慢，因此将混合物置于摇床上，室温过夜。次日，加入80 mL去离子水（ddH2O），定容至100 mL。
      警告：乙酸具有毒性；操作时应在通风橱内并佩戴个人防护装备。
      注意：小牛皮来源的胶原蛋白包被最多可重复使用5次。4 °C保存。
    2. 用胶原蛋白完全覆盖培养皿或培养瓶的表面，盖好后在超净台内室温孵育20分钟。20分钟后，将胶原蛋白溶液回收至新容器中，盖上空的培养皿/瓶，在超净台内室温静置10分钟。
    3. 将培养皿/瓶转移至培养箱中，过夜（或至少6小时）孵育（37 °C，5% CO2）。接种细胞前，用不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤5次。
  2. 14天后，通过FACS（荧光激活细胞分选）对MABs进行人源碱性磷酸酶分选17，随后进行进一步扩增。将MABs维持在胶原蛋白包被的T75培养瓶中，使用生长培养基培养，每2天更换一次培养基（每瓶10 mL）。
  3. 当细胞融合度达到70%时，进行MABs的冻存、传代或接种至实验装置。
    注意：MABs在细胞间接触后会因自发融合而丧失成肌潜能。扩增MABs时，确保融合度不超过70%。一个70%融合的T75培养瓶约含有600,000–800,000个细胞，可按每管100,000个细胞进行冻存。每管细胞日后可解冻并接种至T75培养瓶中进行扩增。
  4. 传代MABs时，先用7 mL DPBS轻柔洗涤一次，然后加入7 mL MAB解离液，在37 °C、5% CO2条件下孵育3分钟以解离细胞。
    1. 加入7 mL生长培养基中和MAB解离液，轻柔刮取细胞，并将细胞悬液转移至50 mL离心管中。再用额外5 mL生长培养基轻柔冲洗培养瓶，以收集可能残留的MABs。
    2. 将细胞悬液在300 × g条件下离心3分钟，随后可直接接种至新的胶原蛋白包被T75培养瓶中进行扩增，或使用含10% DMSO的无血清替代物进行冻存，或计数后接种至微流控装置。
      ​注意：为扩增细胞，每周进行1–2次传代，最大传代次数为13代。解离后的MABs在显微镜下观察呈圆形且体积较大。

3. 预组装微流控装置的准备——第9天

注意：本方案改编自微流控设备制造商的神经元设备方案，并已针对预组装设备和硅胶设备的使用进行了调整。此处，预组装设备用于免疫细胞化学（ICC）和活细胞钙瞬变记录，而硅胶设备用于扫描电镜（SEM）。本方案的时间线遵循运动神经元分化方案的时间线。

  1. 在接种细胞的前一天准备微流控装置，因为包被需要过夜孵育。根据运动神经元实验方案，这应在星期三进行。向一个10 cm的培养皿中加入约10 mL的70%-100%乙醇。使用镊子将装置从运输容器中转移至培养皿中进行消毒。
  2. 将装置浸入乙醇中10秒，然后用镊子将其转移至一张纸上，在超净工作台中晾干约30分钟。翻转装置数次，确保两面均充分干燥。装置干燥后，使用镊子将每个装置转移至单独的10 cm培养皿中以便操作
    警告：乙醇具有毒性；操作时应在通风橱内佩戴个人防护装备
  3. 用多聚-L-鸟氨酸（PLO）（100 µg/mL）在DPBS中对装置进行包被，并在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
    1. 使用P200移液器将100 µL PLO的DPBS溶液加入顶部孔中，尽可能靠近通道开口处，观察液体从顶部孔经通道流向底部孔。随后，向底部孔中加入100 µL PLO的DPBS溶液。
    2. 在微沟槽的另一侧重复上述操作，最后在装置的一侧额外加入100 µL PLO溶液，以在装置两侧形成体积梯度，从而包被微沟槽（例如，右侧200 µL，左侧300 µL）。孵育3小时后，用DPBS洗涤装置3次，每次5分钟。如有需要，可使用抽吸系统。
      注意：在整个包被或细胞培养过程中，务必避免通道内产生气泡。即使微小气泡也会在短时间内膨胀，从而阻碍包被、细胞接种或培养基在通道中的流动。若在包被过程中液体在通道中停滞，应从两侧直接将PLO溶液重新注入通道。若仍有气泡存在，可用200 µL DPBS冲洗通道，并按照上述步骤3.3.1–3.3.2重复包被过程。若在细胞接种后出现气泡，则无法挽救该装置，因为冲洗通道会损伤细胞。
  4. 用层粘连蛋白（laminin）（20 µg/mL）在Neurobasal培养基中对装置进行包被，并在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。包被操作步骤与PLO包被的步骤3.3.1–3.3.2相同。
  5. 次日，使用P200移液器，将枪头置于与通道开口相对的孔中，移除孔中的层粘连蛋白包被液。向所有孔中加入DPBS，并将装置置于室温下的超净工作台中，保持含有DPBS的状态，以备细胞接种。
    ​注意：自此步骤起，切勿直接从通道中移除液体（如层粘连蛋白包被液、DPBS、培养基、固定液等），以免引起气泡形成。在接种细胞前，务必在显微镜下检查装置。

4. 硅胶微流控装置的制备 - 第9天

  1. 在接种细胞的前一天准备硅胶微流控装置，因为包被需要过夜孵育。根据运动神经元实验方案，这应在星期三进行。
    1. 向一个10 cm的培养皿中加入约10 mL的70%–100%乙醇。使用镊子将装置从运输容器中转移至培养皿中进行消毒。将装置在乙醇中浸没10秒，然后用镊子将其转移至6孔板的一个孔中，在超净台中晾干约30分钟。将装置侧放，以确保所有表面均可干燥。
    2. 将SEM膜裁剪至与装置相同大小（每边留出几毫米）。按照步骤4.1.1所述重复消毒步骤。然后用镊子将其转移至一个10 cm培养皿中晾干。一个培养皿中可放置两到三张SEM膜。
  2. 用PLO（100 µg/mL）在DPBS中对装置和SEM膜进行包被，并在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。
    1. 向6孔板中每个装置的孔内加入1 mL含PLO的DPBS溶液。确保装置漂浮在PLO溶液表面，且通道和微沟槽面朝下浸入液体中。向每个10 cm培养皿中加入10 mL含PLO的DPBS溶液，并用镊子将SEM膜压入液体中。
      注：SEM膜通常会漂浮在包被液表面。在组装装置与膜之前，应将SEM膜翻转，使接触过PLO的表面与装置的通道和微沟槽面相接触。
    2. 3小时后，用DPBS对装置和SEM膜清洗两次，每次5分钟，随后再用无菌水清洗一次，持续5分钟。必要时可使用抽吸系统。将每张SEM膜转移至单独的10 cm培养皿中以便操作。
      注：装置和SEM膜在组装前必须完全干燥。最后用无菌水清洗可去除DPBS可能残留的盐结晶，避免影响后续组装。
  3. 在超净台内的显微镜下操作。使用镊子将硅胶装置的通道和微沟槽面朝下，以90°角垂直放置于SEM膜上，确保所有边缘对齐。轻轻按压装置，确保不仅外缘密封，且孔、通道和微沟槽周围也完全密封。
    注：已键合区域在显微镜下呈灰色，未键合区域则呈透明。应确保所有区域均密封良好且无气泡，以防止培养过程中装置脱落。若存在杂质或盐结晶阻碍贴合，需用无菌水重新清洗SEM膜和装置，并干燥后重试贴合步骤。若因按压过重导致微沟槽变形，应将装置从SEM膜上完全取下并重新尝试贴合。装置贴合后，在包被和更换培养基时需格外小心。
  4. 在超净台内的显微镜下操作。用层粘连蛋白（20 µg/mL）在Neurobasal培养基中对装置进行包被，并在37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。
    注：过夜孵育可使硅胶装置硬化，并进一步增强其与SEM膜的结合。
    1. 使用P200移液器将100 µL层粘连蛋白溶液加入上部孔中，尽量靠近通道开口处，观察液体从上孔经通道流向底部孔的过程。检查孔和通道周围是否有泄漏。
    2. 随后，向底部孔中加入100 µL层粘连蛋白溶液，并检查是否泄漏。在微沟槽的另一侧重复此操作，最后在装置的一侧额外加入100 µL溶液，以在装置两侧形成体积梯度，从而包被微沟槽（例如，右侧200 µL，左侧300 µL）。
      注：若发现泄漏，应去除层粘连蛋白包被，拆解装置与SEM膜，并用无菌水清洗两者。待其干燥后，从步骤4.3开始重新操作。
    3. 次日，使用P200移液器将包被液从与通道开口相对的孔中吸出。向所有孔中加入DPBS，并将含有DPBS的装置置于室温下的超净台中，准备接种细胞。
      ​注：自此步骤起，切勿直接从通道中移除液体（如层粘连蛋白包被液、DPBS、培养基、固定液等），以免产生气泡。接种细胞前务必在显微镜下检查装置。

5. 微流控装置中NPC的铺板 - 第10天

注意：根据运动神经元分化方案15，第10天NPCs的接种在星期四进行。

  1. 使用新鲜解离的第10天神经前体细胞（NPCs）15，或每10 mL第10天运动神经元培养基（表2 和 表3）解冻1–2管冻存的NPCs，并加入ROCK抑制剂（10 µL/mL）溶液，以100 × g 离心4分钟。
  2. 将细胞沉淀重悬于500–1000 µL含ROCK抑制剂（10 µL/mL）溶液的第10天运动神经元培养基中，采用任意常用计数方法对活细胞进行计数。
    注意：如下所述，务必根据最佳接种体积，将NPCs重悬于适量培养基中。
  3. 使用P200移液器从装置微沟道一侧的两个孔中吸除DPBS，并在60–100 µL第10天运动神经元培养基中接种250,000个NPCs至每个装置。
    1. 在右上孔中，将30–50 µL细胞悬液（125,000个细胞）以45°角靠近通道开口处加入，然后用移液器枪头轻轻将剩余液体沿孔底拖向孔中心。
    2. 暂停数秒，待细胞悬液流经通道后，在下方孔中重复此操作（30–50 µL，含125,000个细胞）。使用笔在接种侧标记“NPC”或类似标识，以便在无显微镜条件下快速识别装置方向。
    3. 将装置置于37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟，以促进细胞贴壁，随后向两个接种孔各补充第10天运动神经元培养基至200 µL/孔，再次于37 °C、5% CO2条件下孵育。
      注意：每个孔最大容量为200 µL。在两个孔及通道中均接种细胞可形成稳定的培养结构，降低换液过程中细胞脱落的风险。也可仅在通道中接种较少细胞，但此方式会使培养物在每次换液时更易受到通道内液体流动的影响。
  4. 使用P200移液器从微沟道另一侧（与新接种NPCs相对的一侧）的两个孔中吸除DPBS，每孔加入200 µL第10天运动神经元培养基，并在上孔与下孔之间稍等数秒，使培养基流经通道。随后，在装置周围的10 cm培养皿中加入6 mL DPBS，以防止孵育过程中培养基蒸发。
    注意：培养期间如需要，可随时在装置周围补充DPBS。
  5. 在第11天（星期五）、第14天（星期一）和第16天（星期三）对装置的两个腔室进行完全的运动神经元培养基更换（表2 和 表3）。在换液当天添加新鲜的培养基补充物。
    注意：自此之后，所有换液操作均使用P200移液器进行。移液器枪头应始终置于远离通道的孔边缘处，切勿直接从通道中移除液体。操作时注意避免硅胶装置脱落。添加或移除培养基时应缓慢进行，以防细胞脱落。
    1. 将P200移液器枪头置于通道开口对侧的孔壁底部边缘，小心吸除含NPCs的两个孔中的全部培养基；随后将P200移液器枪头置于通道开口对侧的孔壁顶部边缘，缓慢向顶部孔中加入50–100 µL新鲜运动神经元培养基。
    2. 暂停数秒，待培养基流经通道后，向底部孔中加入50–100 µL运动神经元培养基。重复此操作直至两个孔中均达到200 µL/孔。另一侧无细胞的腔室同样重复上述步骤。

6. 微流控装置中 MAB 的接种 - 第17天

  1. 在将MABs接种到微流控装置前约7天（运动神经元分化第10天），解冻MABs，并将其接种于经胶原蛋白包被的T75培养瓶中的生长培养基（表1）中，以实现充分的细胞扩增。参见第2节。
  2. 在运动神经元分化第17天（星期四），按照步骤2.4所述方法消化MABs，将细胞沉淀重悬于约500 µL生长培养基中，并使用任意常用的计数方法对活细胞进行计数。
    注意：如下文所述，务必使用适量培养基重悬MABs，以确保最佳接种体积。
  3. 使用P200移液器移除装置中微沟道未接种侧的运动神经元培养基，用DPBS轻轻洗涤，然后每台装置接种200,000个MABs，接种体积为60–100 µL生长培养基。
    1. 在右上孔中，以45°角将30–50 µL细胞悬液（含100,000个细胞）接种至靠近通道开口处，然后用移液器吸头沿孔底轻轻拖动剩余液体至孔中央。暂停数秒，使细胞流入通道后，再在下方孔中重复此操作（30–50 µL，含100,000个细胞）。
    2. 将装置置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育5分钟，以促进细胞贴壁，随后向两个新接种MABs的孔中补充生长培养基至终体积200 µL/孔。再次置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育。
      ​注意：在第17天，装置的运动神经元侧无需更换培养基。根据先前发表的运动神经元分化方法15，培养基更换操作改在第18天（星期五）进行。

7. 建立体积梯度与化学趋化梯度以促进运动神经元神经突向MAB室生长

  1. 在第18天，使用第18天运动神经元培养基（200 µL/孔）对运动神经元侧进行完全换液。遵循步骤5.5.1–5.5.2中所述的换液操作说明。在装置的MAB区域启动MAB分化（表2 和 表4）。
    1. 加入预热的MAB分化培养基（表4）前，先用DPBS小心清洗MAB区域一次，培养基中需添加0.01 µg/mL人聚集蛋白（agrin）（200 µL/孔）。
      注意：MAB细胞将在一周时间内融合并形成多核肌管。
  2. 在第21天，根据运动神经元分化方案（星期一），建立化学趋向性和体积梯度（表2 和 表3）。
    1. 向肌管区域（先前定义为MAB区域）每孔加入200 µL含30 ng/mL脑源性神经营养因子（BDNF）、胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）和睫状神经营养因子（CNTF）、人聚集蛋白（0.01 µg/mL）以及层粘连蛋白（laminin）（20 µg/mL）的运动神经元基础培养基；向运动神经元区域每孔加入不含生长因子的运动神经元基础培养基（100 µL/孔）。
  3. 从第21天起每隔一天重复步骤7.2，直至运动神经元分化第28天。周末无需换液。

神经分化过程示意图；NPC和MAB铺板；运动神经元形成；趋化梯度分析。
图1：微流控装置中运动单位实验方案的示意图。 根据运动神经元分化方案的时间线22，展示从第0天到第28天的分化时间进程及共培养总体流程。运动神经元由iPSCs的分化始于第0天，并在随后的10天内按既定方法进行15。第9天，对装置进行灭菌并用PLO-层粘连蛋白包被。MAB细胞在T75培养瓶中解冻扩增。第10天，将运动神经元-NPC接种于装置一个区室（浅灰色）的两个孔及通道中，并继续培养一周以促进其向运动神经元分化。第17天，将MAB细胞接种于另一区室（深灰色）的两个孔及通道中。第18天，开始诱导MAB向肌管分化。第21天，建立体积与趋化梯度，以促进运动神经元的神经突通过装置中的微沟槽发生极化。运动神经元区室每孔加入100 µL不含生长因子的运动神经元基础培养基（浅绿色区室），而肌管区室每孔加入200 µL含30 ng/mL生长因子的运动神经元基础培养基（深绿色区室）（表2 和 表3）。此后维持该体积与趋化梯度继续培养7天，直至第28天进行分析。明场图像显示了在预组装微流控装置中培养的细胞在第0天、第11天、第18天和第28天的形态。比例尺：100 µm。本图经Stoklund Dittlau, K. 等人18修改。细胞插图经Smart Server Medical Art22修改。请点击此处查看此图的放大版本。

8. 固定与免疫细胞化学染色

注意：所有步骤均需小心操作，以防止神经元培养物脱落。在后续步骤中，切勿从通道中移除液体。

  1. 在通风橱或超净工作台中进行固定：固定前，先用DPBS小心清洗装置中的所有孔一次。在超净工作台中，使用含4%多聚甲醛（PFA）的DPBS溶液于室温下固定15–20分钟（每孔100 µL）。
    注意：PFA具有毒性，操作时需在通风橱内佩戴个人防护装备。
    1. 小心将100 µL固定液加入装置的上孔，等待数秒，使溶液流经通道后，再向底部孔中加入100 µL。另一侧重复相同操作。孵育结束后，吸除PFA溶液，并用DPBS轻柔洗涤3次，每次5分钟。每孔留取200 µL DPBS用于保存，并用封口膜密封10 cm培养皿，于4 °C保存至进行免疫细胞化学（ICC）实验。
      注意：确保装置在保存期间不会干燥。
  2. 在ICC实验的第一天，将细胞与含0.1% Triton X-100的DPBS通透液（每孔100 µL）在室温下孵育20分钟。吸除通透液后，加入含5%正常驴血清的0.1% Triton X-100/DPBS溶液（每孔100 µL），室温孵育30分钟。
  3. 吸除5%正常驴血清溶液，将装置与一抗（见材料表）在含2%正常驴血清的0.1% Triton X-100/DPBS溶液中孵育，并于4 °C过夜孵育。
    1. 建立体积梯度：在微沟道的一侧每孔加入100 µL抗体溶液，另一侧每孔加入150 µL（每个装置共500 µL）。
      注意：可在微沟道两侧使用不同的抗体。若如此操作，则在加一抗或二抗时不应建立跨微沟道的体积梯度，以维持各腔室间的流体隔离。若无梯度，微沟道中的神经突将无法被有效染色。
  4. 次日（ICC实验的第二天），吸除一抗溶液，并用含0.1% Triton X-100的DPBS溶液小心洗涤装置3次，每次5分钟。
    注意：对于容易脱落的细胞培养样本，可将3次5分钟的洗涤替换为1次30分钟的洗涤。
  5. 自此步骤起需避光操作，因为二抗（见材料表）对光敏感。将细胞与二抗在含2%正常驴血清的0.1% Triton X-100/DPBS溶液中于室温孵育1小时。按照步骤8.3.1所述建立体积梯度。孵育结束后，吸除二抗溶液，并用DPBS洗涤3次，每次5分钟。
  6. 用DPBS中的DAPI（每孔100 µL）于室温下标记核DNA 20分钟，随后用含0.1% Triton X-100的DPBS溶液洗涤3–4次，每次5分钟。吸除所有孔中的0.1% Triton X-100/DPBS溶液，让培养物干燥数秒后，每孔加入一滴荧光封片剂进行封片。
    注意：将装置水平放置至少24小时，以使封片剂充分固化。24小时后，可将装置置于载玻片盒中于4 °C保存。
  7. 使用倒置显微镜进行z轴层扫成像。
    1. 为成像神经肌肉接头（NMJs），使用40倍物镜定位经肌管特异性抗体（见材料表）标记的肌管，并进行z轴层扫记录，以确保同时捕获神经元和肌管组织的图像。若肌管过大无法容纳于单幅图像中，应采集多幅图像。
    2. 为定量分析NMJs，通过每组z轴层扫图像手动计数神经元突触前标志物与乙酰胆碱受体（AChR）标志物之间的共定位数量，并将共定位数归一化至该z轴层扫图像中肌管的数量。

9. 扫描电镜样品的固定与装置制备

注意：更换液体时，务必保留少量液体以覆盖培养物，避免细胞塌陷。本方案使用高毒性物质，整个操作过程必须佩戴个人防护装备，并在通风橱内进行。

  1. 固定与拆解：配制新鲜的2.5%戊二醛（GA）溶于0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.6）中，用0.2 µm滤膜过滤，并加热至37 °C。
    注意：戊二醛和二甲胂酸钠具有毒性，应在通风橱中佩戴个人防护装备操作。
    1. 用DPBS轻轻洗涤装置一次，以去除培养基和细胞碎片，然后在室温下用GA溶液预固定15分钟。
    2. 用解剖刀小心地沿装置边缘切割SEM片，同时用镊子固定装置。切割时确保不使装置脱落。借助镊子将装置和SEM片转移至一个3 cm的培养皿中，并将该3 cm培养皿放入10 cm培养皿中以便操作。
    3. 预固定15分钟后，用镊子小心地将装置从SEM片上取下。从装置的一个角开始分离，并沿对角线方向缓慢移除至对角。观察细胞从装置上脱落的过程。
    4. 向3 cm培养皿中加入足量GA溶液，完全覆盖SEM片，并在室温下继续固定至总时长2小时，或在4 °C下过夜固定。
      注意：使用镊子轻轻将SEM片推入GA溶液下方，避免接触任何有细胞的表面。
  2. 继续按照标准SEM流程操作。简要步骤如下：先用四氧化锇孵育，随后用梯度乙醇进行脱水。将SEM片插入盖玻片 holder 中进行临界点干燥，并安装到带有碳导电胶的支持 stub 上进行镀膜。使用扫描电子显微镜在5 kV加速电压和7 mm工作距离下进行成像。

10. 使用活细胞钙成像评估神经肌肉接头功能

  1. 准备设备：用含有 30 ng/mL BDNF、GDNF 和 CNTF 的第 18 天运动神经元基础培养基，以每孔 200 µL 的量更换肌管室；用不含生长因子的运动神经元基础培养基，以每孔 200 µL 的量更换运动神经元室（表 2 和 表 3）。
    1. 将 Fluo-4 AM 染料用 Fluo-4 染料溶剂稀释后加入肌管室，终浓度为 5 µM，并将装置置于黑暗条件下，在 37 °C、5% CO2 环境中孵育 25 分钟。在孵育期间，将氯化钾用不含生长因子的运动神经元基础培养基稀释，终浓度为 450 mM。
      注：Fluo-4 AM 是一种钙离子指示剂，与钙结合后荧光强度会增强。此后操作需避光进行，因为该染料对光敏感。
    2. 孵育 25 分钟后，用含有 30 ng/mL BDNF、GDNF 和 CNTF 的第 18 天运动神经元基础培养基（每孔 200 µL）更换肌管室培养基，用不含生长因子的运动神经元基础培养基（每孔 100 µL）更换运动神经元室培养基，以重新建立趋化性和体积梯度。
    3. 为阻断神经肌肉接头（NMJs），在肌管室培养基中添加终浓度为 19 µM 的乙酰胆碱受体竞争性拮抗剂氯化筒箭毒碱五水合物。
      警告：氯化筒箭毒碱五水合物具有毒性，须在通风橱中佩戴个人防护装备操作。
  2. 使用配备有调节至 37 °C、5% CO2 培养箱的倒置共聚焦显微镜进行记录。
    1. 使用 10 倍物镜，通过明场通道定位肌管室中的肌管。调节 488 通道的激光功率、增益和偏移，使 Fluo-4 荧光清晰标记出单个肌管。
      注：代表性结果通过将软件 A1 设置中的滑块调节至激光功率 5%、增益 60（HV）、偏移 0 获得。
  3. 设置记录时间为 1 分钟，间隔为 1 秒。先记录 5–10 秒以获取基线值，随后立即用氯化钾溶液刺激运动神经元。
    1. 在记录开始 5–10 秒后，缓慢向运动神经元室的一个孔中加入 25 µL 氯化钾溶液，使终浓度达到 50 mM。
      注：避免过快加入氯化钾溶液，否则会在通道内产生波动，导致记录中出现伪影。
  4. 在运动神经元刺激下对肌管室进行两次记录，每次之间暂停 2 分钟；随后直接向肌管室加入 25 µL 氯化钾溶液进行刺激，以评估不依赖于运动神经元去极化的肌管直接活性。
  5. 进行定量分析时，使用记录软件手动圈选每个肌管，并分析 1 分钟时间内的 Fluo-4 荧光强度变化。为确定钙离子内流的增加量，用氯化钾刺激后的峰值减去平均基线值（即刺激前前 10 秒的平均值）。代表性结果使用软件中的时间测量工具获得。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在微流控装置中生成神经肌肉接头
为了在商用微流控装置中构建具有功能性神经肌肉接头（NMJ）的人类运动单位，采用了由人诱导多能干细胞（iPSC）分化的运动神经元和由人肌源性祖细胞（MAB）分化的肌管细胞。起始细胞材料的质量至关重要，尤其是MAB融合形成肌管的能力，对本实验方案的成功尤为关键。MAB在体外培养中易于维持，但在将其应用于微流控装置之前，必须评估每一批细胞的融合能力（补充图1A,B）18。任何一批在分化10天后未能形成肌管的细胞均不应使用。在补充图1B中，融合指数通过计算每张图像中所有细胞核内，位于表达肌管标志物的肌管中的细胞核所占百分比来确定。我们发现，在共培养体系中生成神经肌肉接头时，约8%的融合指数已足够满足实验需求。

始终需要从纯化的iPSCs培养物开始进行运动神经元分化。输入的细胞越纯，获得的结果也越纯。该运动神经元分化方案所生成的运动神经元培养物中，通常有85%–95%的细胞表达运动神经元标志物（补充图1C,D）18。剩余的细胞通常为未分化的前体细胞，在某些情况下可能发生大量增殖，从而对培养物的质量产生不利影响。为了获得本方案的最佳结果，应在将第10天的运动神经元-NPCs接种到装置之前，评估其运动神经元分化效率。此外，可在第11天进行NPC质量检测，以评估NPC标志物Olig2的表达情况（补充图1E,F）。

最初，运动神经元-NPCs 和 MABs 在第 10 天同时接种。此处，MAB 的分化于第 11 天开始。第 14 天实施的体积和生长因子梯度使我们能够在第 21 天评估神经肌肉接头（NMJ）的形成，从而将实验周期缩短了一周。有趣的是，我们通过免疫细胞化学（ICC）观察到了典型的 NMJ 形成特征（补充图 2A）。然而，在运动神经元分化的这一早期阶段，我们尚无法通过活细胞钙成像获得功能性信号输出（数据未显示）。我们推断，尽管 NMJ 的形态学特征已具潜力，但运动神经元尚未成熟到足以与肌管形成功能性 NMJ 连接。这与我们此前的观察结果一致：通过膜片钳电生理分析记录到的运动神经元自发性动作电位，仅在运动神经元分化至第 35 天时才出现15。

此外，我们尝试通过在微流控装置中将运动神经元培养成熟2周（第24天）后再接种MABs，以延长运动神经元的成熟过程以及共培养体系的稳定性。然而，观察到大量运动神经元的神经突自发穿过微沟道，导致MABs的黏附受到抑制（补充图2B）。由于通道内缺乏肌管形成，我们未能在第36天识别出神经肌肉接头，因此采用了28天的实验方案（图1）。

鉴定、定量与形态学表征 体外 神经肌肉接头
在完成28天的实验方案后（图1），可获得完全功能性的神经肌肉接头（NMJs）。两者 体内 和 体外，通过突触前标记物与突触后标记物的共定位，可对神经肌肉接头（NMJs）进行免疫组织化学或免疫细胞化学表征。本研究采用神经丝重链（NEFH）与SYP组合作为突触前标记物，从而能够追踪从运动神经元胞体延伸至最远端神经突的单个神经突。在肌肉侧，α-银环蛇毒素（Btx）被广泛用作乙酰胆碱受体（AChRs）的突触后标记物，本研究同样采用了该标记物。添加聚集蛋白（agrin）和层粘连蛋白（laminin）可促进AChRs在肌膜上的聚集19,20,21，从而更易于鉴定乙酰胆碱受体（AChRs） 体外 同样增加了存在的乙酰胆碱受体（AChRs）和神经肌肉接头（NMJs）的数量18.

为了以无偏倚的方式定位并计算神经肌肉接头（NMJ），需通过肌球蛋白重链（MyHC）阳性来识别每条肌管，并使用倒置共聚焦显微镜在40倍放大倍数下以z轴层扫方式成像。对于非常长的肌管，需采集多个z轴层扫图像。在图像分析过程中，通过人工逐层计数每个z轴层扫中NEFH/SYP与Btx的共定位数量，并将共定位数量归一化为该z轴层扫中所存在的肌管数量（图2A-C）18。并非所有肌管都具有神经肌肉接头，这一点在有神经支配的肌管定量结果中可见（图2D）。因此，必须采用无偏倚的记录方法，即对所有肌管进行成像，而不考虑是否存在Btx信号。

可以识别出两种形态类型 体外 系统。NMJ 可表现为单接触点 NMJ，即神经突仅在一个相互作用点接触一个 AChR 簇；或表现为多接触点 NMJ，即神经突展开并以更大的表面积与 AChR 簇发生接触。这两种形态均可通过免疫细胞化学方法鉴定（图2A)18 以及扫描电子显微镜（SEM）图2B)18，同样可以被定量（图2C)18总体而言，多个接触点通过大范围的肌肉嵌入促进了更广泛的连接，表明神经肌肉接头（NMJ）的形成更为成熟。相比之下，单个接触点的神经肌肉接头由于培养体系处于早期发育阶段，被认为成熟度较低。

功能评估 体外 神经肌肉接头
为了评估神经肌肉接头的功能，采用了活细胞钙瞬变记录技术（图3)18利用微流控装置的流体隔离系统，在运动神经元胞体侧施加高浓度（50 mM）氯化钾刺激，同时记录加载了钙离子敏感性染料Fluo-4的肌管中钙离子内流情况图3A)。运动神经元激活后几乎立即可通过特征性的波形变化观察到肌管中的钙离子内流，这证实了运动神经元-神经突与肌管之间存在功能性连接（图3A- C)18未观察到自发性钙波或自发性肌管收缩，但在氯化钾直接刺激下可观察到肌管收缩。通过向肌管区加入竞争性乙酰胆碱受体拮抗剂氯化筒箭毒碱五水合物（DTC）进一步验证了连接的特异性图3A)，从而抑制了钙离子内流（图3C）。该结果证实了运动神经元与肌管之间的连接形成了功能完整的神经肌肉接头（NMJs）。为了评估通过神经肌肉接头刺激激活的肌管数量，使用氯化钾直接刺激肌管区，以确定该区域内全部可激活肌管的数量。约70%的肌管可通过运动神经元刺激并经氯化钾激活而产生反应。图3D)18.

这些结果证实，在28天的共培养方案中，通过将诱导多能干细胞来源的运动神经元与肌源性祖细胞来源的肌管共培养，可实现神经肌肉接头的最佳形成、数量、形态及功能。

神经肌肉接头（NMJ）分析：荧光显微镜、电子显微照片、定量图表。
图 2：微流控装置中的神经肌肉接头（NMJ）形成。（A）在第28天，预组装微流控装置中NMJ形成的共聚焦显微图像。通过轴突前标志物（NEFH 和 SYP）与肌管上 MyHC 染色共定位的乙酰胆碱受体（AChR）标志物（Btx）的共定位（箭头所示），识别NMJ。NMJ在形态学上表现为神经突与AChR簇之间形成的单个或多个接触点。DAPI标记细胞核。比例尺：25 µm。插图为NMJ的放大图像，插图比例尺：10 µm。（B）第28天硅基微流控装置中NMJ形态的扫描电镜（SEM）图像。箭头显示神经突嵌入肌管。比例尺：2 µm。插图为NMJ的放大图像，插图比例尺：1 µm。（C）每根肌管上NMJ总数，以及每根肌管上具有单个和多个接触点的NMJ数量的定量分析。图表数据表示四次生物学重复实验的均值 ± 均值标准误。统计学显著性通过Mann-Whitney检验确定，* p < 0.05。（D）受神经支配肌管百分比的定量分析。图表数据表示四次生物学重复实验的均值 ± 均值标准误。本图经 Stoklund Dittlau, K. 等人18 修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

神经肌肉接头研究：微流控装置、钙离子荧光、活动图、饼图。
图 3：神经肌肉接头功能的验证。（A）在第28天，使用预先组装的微流控装置对神经肌肉接头（NMJ）功能进行活细胞瞬时钙成像的示意图，分别显示在使用筒箭毒碱（DTC）阻断NMJ前后的情况22。浅绿色区域中的运动神经元用50 mM氯化钾（KCl）刺激，通过神经突触引发细胞内运动神经元反应。这会诱发肌管中钙离子（Ca2+）内流，肌管位于深绿色区域并用钙敏感性染料Fluo-4标记。（B）KCl刺激运动神经元后，肌管在刺激前、荧光强度峰值及刺激后的Fluo-4荧光显微图像，显示了肌管内钙离子浓度升高的波动过程。插图显示受神经支配的活跃肌管的放大图像。比例尺：100 µm；插图比例尺：200 µm。（C）运动神经元经KCl刺激（箭头）后，肌管中典型的钙离子内流曲线，证实了神经肌肉接头的功能性。肌管1-3显示出通过运动神经元-肌管神经支配产生的特征性钙信号曲线，而肌管A-C DTC则显示在使用DTC阻断神经肌肉接头后的曲线。（D）受运动神经元刺激而激活的肌管占总活跃肌管数量的比例。本图经Stoklund Dittlau, K. 等人18修改。细胞示意图经Smart Server Medical Art22修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

补充图1：运动神经元验证、MAB融合指数及NPC质量控制。（A）MAB来源的肌管在启动分化后第10天的共聚焦图像。肌管使用肌管标志物标记：结蛋白（desmin）、肌球蛋白重链（MyHC）、成肌调节因子（myogenin，MyoG）和肌联蛋白（titin）。细胞核用DAPI染色。比例尺，100 µm。（B）启动分化后第10天MAB融合指数的定量分析。在饥饿处理后，MAB融合形成多核肌管，并对表达肌管标志物（AB+）的细胞进行定量。图中数据表示三次生物学重复实验的平均值±标准误。（C）iPSC来源的运动神经元在分化第28天的共聚焦图像，使用运动神经元标志物NEFH、胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）和Islet-1，以及泛神经元标志物βIII-微管蛋白（βIII-tubulin，Tubulin）进行标记。细胞核用DAPI染色。比例尺，75 µm。（D）表达运动神经元及泛神经元标志物（AB+）的细胞数量的定量分析。图中数据表示三次生物学重复实验的平均值±标准误。（E）iPSC来源的神经前体细胞（NPC）在运动神经元分化第11天的共聚焦图像，使用NPC标志物Olig2和泛神经元标志物βIII-微管蛋白（Tubulin）进行标记。细胞核用DAPI染色。比例尺，50 µm。（F）表达Olig2和βIII-微管蛋白（AB+）的NPC数量的定量分析。图中数据表示三次生物学重复实验的平均值±标准误。本图经Stoklund Dittlau, K. 等人18修改。 请点击此处下载该文件。

补充图 2：共培养方案的优化（A）在运动神经元分化的第 21 天，于第 10 天与 NPCs 同时接种 MABs 后的神经肌肉接头（NMJ）形成的共聚焦图像。NMJ 通过突触前标志物（NEFH 和 SYP）与突触后乙酰胆碱受体标志物（Btx）在 MyHC 染色的肌管上的共定位（箭头所示）来识别。比例尺（左），10 µm；比例尺（右），5 µm。（B）第 24 天肌管通道的明场图像，显示自发的运动神经元神经突延伸阻碍了 MABs 的附着。比例尺，100 µm。请点击此处下载该文件。

试剂储存浓度终浓度
IMDM1x80%
胎牛血清15%
青霉素/链霉素5000 U/mL0.5%
L-谷氨酰胺50x1%
丙酮酸钠100 mM1%
非必需氨基酸100x1%
胰岛素-转铁蛋白-硒100x1%
bFGF（新鲜添加）50 μg/mL5 ng/mL

表1：MAB生长培养基. 培养基在4 °C下可保存2周。bFGF需在使用当天新鲜添加。

试剂储存浓度终浓度
DMEM/F1250%
Neurobasal 培养基50%
青霉素/链霉素5000 U/mL1%
L-谷氨酰胺50x0.5 %
N-2 补充剂100x1%
不含维生素 A 的 B-2750x2%
β-巯基乙醇50 mM0.1%
抗坏血酸200 μM0.5 μM

表2：运动神经元基础培养基. 培养基在4 °C下可保存4周。

天数试剂储存浓度终浓度培养室
第10/11天Smoothened激动剂10 mM500 nM双室
视黄酸1 mM0.1 μM
DAPT100 mM10 μM
BDNF0.1 mg/mL10 ng/mL
GDNF0.1 mg/mL10 ng/mL
第14天DAPT100 mM20 μM双室
BDNF0.1 mg/mL10 ng/mL
GDNF0.1 mg/mL10 ng/mL
第16天DAPT100 mM20 μM双室
BDNF0.1 mg/mL10 ng/mL
GDNF0.1 mg/mL10 ng/mL
CNTF0.1 mg/mL10 ng/mL
第18天BDNF0.1 mg/mL10 ng/mL运动神经元室
GDNF0.1 mg/mL10 ng/mL
CNTF0.1 mg/mL10 ng/mL
第21天起BDNF0.1 mg/mL30 ng/mL肌管室
GDNF0.1 mg/mL30 ng/mL
CNTF0.1 mg/mL30 ng/mL
Agrin50 μg/mL0.01 μg/mL
Laminin1 mg/mL20 μg/mL
第21天起无添加物运动神经元室

表3：运动神经元培养基添加剂. 添加剂需在使用当天新鲜加入运动神经元基础培养基中。

天数试剂储存浓度终浓度培养室
第18天DMEM/F1297%MAB
丙酮酸钠100 mM1%
马血清2%
Agrin50 μg/mL0.01 μg/mL

表4：MAB分化培养基. 培养基在4 °C下可保存2周。Agrin需在使用当天新鲜添加。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种相对易于使用的方法，可在不到30天的时间内在市售的微流控装置中生成具有功能性神经肌肉接头（NMJ）的人类运动神经元单位。文中阐述了如何通过免疫细胞化学（ICC）和扫描电镜（SEM）等标准技术对NMJ进行形态学评估，以及如何通过活细胞钙成像进行功能评估。

该方案的一大优势在于采用了干细胞技术。这使得神经肌肉接头（NMJ）可以在健康和疾病状态下进行评估，且不受供体特征的影响。该模型在肌萎缩侧索硬化症（ALS）研究中已显示出成功和益处，我们此前已鉴定出由于 FUS 基因突变导致的神经突生长、再生以及神经肌肉接头数量减少等新型表型18。利用该模型，可进一步将研究扩展至病因尚不明确的散发性ALS，通过使用散发性ALS患者的诱导多能干细胞（iPSCs）进行研究。这相较于传统的动物模型具有优势，后者依赖于突变基因的转基因过表达来模拟人类疾病23,24。此外，我们完全基于人类细胞的系统有望重现人类特有的生理特征及疾病表现。先前的研究已揭示了啮齿类动物与人类在神经肌肉接头形态上的差异25，提示在利用啮齿类动物研究人类神经肌肉接头病理时需谨慎。尽管该系统是一种相对简单的体外（in vitro）体系，缺乏体内（in vivo）模型的复杂性，但已有研究表明，微流控装置中所呈现的神经肌肉接头形态与人类截肢样本中的神经肌肉接头相似25。此外，该模型允许在神经肌肉接头形成和成熟过程中对其进行评估，可能揭示出在人类尸检样本中缺失、无法识别或被忽视的早期疾病表型。

MABs 提供了一种生成肌管的有效方法，尽管其存活时间仅限于10天，这是该体系的一个缺点。肌管的存活依赖于其与培养表面的贴附，而肌纤维的自发性收缩可能会破坏这种贴附。超过10天后，大多数肌管会脱落，导致神经肌肉接头（NMJ）培养体系无法继续使用。理想情况下，肌管也应由诱导多能干细胞（iPSCs）产生。然而，由于融合指数存在较大差异26，目前的实验方案已被证明难以重复27,28,29,30。

通过使用市售的微流控装置，我们构建了一个完全可及的标准化系统。其他神经肌肉接头模型也存在31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42然而，这些方法通常依赖于单一腔室，缺乏不同细胞类型之间的区室化和流体隔离，或者依赖于定制的培养装置，这会降低实验的可及性以及潜在的可重复性。本实验方案所用的微流控装置可购买带有不同长度微沟槽的产品，从而允许进行轴突运输等进一步分析。43,44 或轴突切断术18,45,46 研究。隔室间的流体隔离进一步实现了对运动神经元或肌管的分区药物处理，这在治疗开发中具有优势。越来越多专注于微流控技术的公司涌现，提供了大量设备设计和功能选择，进一步提升了该技术的可及性。 体外 研究

综上所述，我们建立了一种可靠的、多功能且简便的方法，用于培养具有功能性神经肌肉接头的人类运动单位。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.V.D.B. 拥有组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂用于治疗腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth disease）的专利（专利号：US-2013227717-A1），是 Augustine Therapeutics 的科学联合创始人，并担任该公司科学顾问委员会成员。其他作者声明无竞争利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者感谢来自LiMoNe、分子神经生物学研究组（VIB-KU Leuven）的Nikky Corthout和Sebastian Munck在活细胞钙瞬变荧光记录方面的建议。本研究得到了比利时和卢森堡富布赖特委员会、KU Leuven（C1和"Opening the Future"基金）、VIB、科技创新署（IWT；SBO-iPSCAF）、"弗拉芒科学基金会"（FWO-Vlaanderen）、Target ALS、比利时肌萎缩侧索硬化症协会（A Cure for ALS）、比利时政府（由比利时联邦科学政策办公室发起的Interuniversity Attraction Poles Program P7/16）、Thierry Latran基金会以及"比利时神经肌肉疾病协会"（ABMM）的支持。T.V.和J.B.获得了FWO-Vlaanderen颁发的博士研究生奖学金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
α-bungarotoxin (Btx) Alexa fluor 555Thermo Fisher ScientificB35451抗体 (1:1000)
乙酸CHEM-Lab NVCL00.0116.1000包被组分。H226，H314。P280
Aclar 33C 片材（SEM 片材）Electron Microscopy Sciences50425-25厚度：7.8 mil
聚集蛋白（重组人蛋白）R&D systems6624-AG-050培养基添加剂
Alexa fluor IgG (H+L) 488 驴抗兔Thermo Fisher ScientificA21206抗体 (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 驴抗山羊Thermo Fisher ScientificA21432抗体 (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 555 驴抗小鼠Thermo Fisher ScientificA31570抗体 (1:1000)
Alexa fluor IgG (H+L) 647 驴抗小鼠Thermo Fisher ScientificA31571抗体 (1:1000)
抗坏血酸SigmaA4403培养基组分
βIII-微管蛋白（Tubulin）Abcamab7751抗体 (1:500)
β-巯基乙醇Thermo Fisher Scientific31350010培养基组分。H317。P280。
B-27（不含维生素A）Thermo Fisher Scientific12587-010培养基组分
BDNF（脑源性神经营养因子）Peprotech450-02B生长因子
bFGF（重组人碱性成纤维细胞生长因子）Peprotech100-18B生长因子
胆碱乙酰转移酶（ChAT）Milliporeab144P抗体 (1:500)
小牛皮胶原蛋白Thermo Fisher Scientific17104019包被组分
CNTF（睫状神经营养因子）Peprotech450-13B生长因子
DAPI Nucblue 活细胞染色 ReadyProbes 试剂Thermo Fisher ScientificR37605免疫细胞化学组分
DAPTTocris Bioscience2634培养基添加剂
结蛋白AbcamAb15200抗体 (1:200)
DMEM/F12Thermo Fisher Scientific11330032培养基组分
DMSOSigmaD2650-100ML冷冻保存组分。H315，H319，H335。P280。
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Thermo Fisher Scientific14190250无钙，无镁
乙醇VWR20.821.296消毒。H225。P280
胎牛血清Thermo Fisher Scientific10270106培养基组分
Fluo-4 AM 活细胞染料Thermo Fisher ScientificF14201钙成像染料
荧光封片介质DakoS3023免疫细胞化学组分
GDNF（胶质细胞系源性神经营养因子）Peprotech450-10B生长因子
戊二醛Agar ScientificR1020固定组分。EUH071，H301，H314，H317，H330，H334，H410。P280。
马血清Thermo Fisher Scientific16050122培养基组分
人碱性磷酸酶R&D systemsMAB1448抗体
ImageJ 软件NIHICC 分析
IMDMThermo Fisher Scientific12440053培养基组分
胰岛素-转铁蛋白-硒Thermo Fisher Scientific41400045培养基组分
Islet-1Milliporeab4326抗体 (1:400)
无血清替代物Thermo Fisher Scientific10828-028冷冻保存组分
来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白SigmaL2020-1MG包被组分及培养基添加剂
Leica SP8 DMI8 共聚焦显微镜LeicaICC 共聚焦显微镜
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030-024培养基组分
肌细胞生成素（MyoG）AbcamAb124800抗体 (1:500)
肌球蛋白重链（MyHC）本实验室，SCIL抗体 (1:20)
N-2 添加剂Thermo Fisher Scientific17502-048培养基组分
Neurobasal 培养基Thermo Fisher Scientific21103049包被及培养基组分
神经丝重链（NEFH）AbcamAB8135抗体 (1:1000)
Nikon A1R 共聚焦显微镜Nikon活细胞钙成像显微镜
NIS-Elements AR 4.30.02 软件Nikon活细胞钙成像分析
非必需氨基酸Thermo Fisher Scientific11140050培养基组分
正常驴血清SigmaD9663-10ML免疫细胞化学组分
Olig2IBL18953抗体 (1:1000)
Parafilm MSigmaP7793-1EA储存设备
多聚甲醛Thermo Fisher Scientific28908固定组分。H302，H312，H315，H317，H319，H332，H335，H341，H350。P280。
青霉素/链霉素（5000 U/mL）Thermo Fisher Scientific15070063培养基组分
培养皿（3 cm）nunc153066直径：3 cm
培养皿（10 cm）Sarstedt833.902直径：10 cm
培养板（6 孔）Cellstar Greiner bio-one657160培养板
Pluronic F-127Thermo Fisher ScientificP3000MPFluo-4 染料溶剂
多聚-L-鸟氨酸（PLO）SigmaP3655-100MG包被组分
氯化钾CHEM-Lab NVCL00.1133.1000钙成像试剂
视黄酸SigmaR2625培养基添加剂。H302，H315，H360FD，H410。P280。
RevitaCell 添加剂Thermo Fisher ScientificA2644501ROCK 抑制剂溶液
Smoothened 激动剂Merck Millipore566660培养基添加剂
二甲胂酸钠缓冲液SigmaC0250固定组分。H301，H331，H350，H410。P280。
丙酮酸钠Life Technologies11360-070培养基组分
突触素（SYP）Cell Signaling5461S抗体 (1:1000)
T75 培养瓶SigmaCLS3276培养板
肌联蛋白发育研究杂交瘤库9D10抗体 (1:300)
Triton X-100SigmaT8787-250ML免疫细胞化学组分。H302，H315，H318，H319，H410，H411。P280
TrypLE expressThermo Fisher Scientific12605010MAB 解离溶液
氯化筒箭毒碱五水合物SigmaT2379-100G乙酰胆碱受体阻断剂。H301。P280。
XonaChips 预组装微流控装置Xona MicrofluidicsXC150微沟道长度：150 μm
Xona 硅基微流控装置Xona MicrofluidicsSND75微沟道长度：75 μm

参考文献

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