本方案描述了使用商用的无细胞蛋白表达试剂盒来生产以纳米盘为支撑的膜蛋白，这些膜蛋白可用作亚单位疫苗中的抗原。
方法文章
无细胞规模化生产及佐剂添加的Chlamydia muridarum重组主要外膜蛋白用于疫苗开发
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
亚单位疫苗在安全性、稳定性和标准化生产方面优于传统的灭活或减毒全细胞来源疫苗。为了获得有效的基于蛋白质的亚单位疫苗，蛋白质抗原通常需要形成类似天然的空间构象。对于作为膜结合蛋白的病原体表面抗原而言，这一点尤为重要。无细胞表达方法已成功用于通过共翻译纳米脂蛋白颗粒（NLPs，通常称为纳米盘）来制备正确折叠且具有功能的膜蛋白。
该策略可用于生产由脂质结合环境中的膜蛋白组成的亚单位疫苗。然而，无细胞蛋白表达通常局限于小规模（<1 mL）。小规模表达所获得的蛋白量通常足以进行生物化学和生物物理研究。但为了获得足够用于动物模型疫苗研究的蛋白，需要对无细胞表达体系进行放大、优化和严格测试。疫苗生产中的其他环节，如纯化、佐剂添加和冻干，也需要同步优化。本文报道了一种用于表达、纯化和配制膜结合蛋白亚单位疫苗的放大化实验方案的开发过程。
放大的无细胞反应在使用多种质粒表达载体时，需要优化质粒浓度与比例、脂质选择以及佐剂添加，以实现配制型纳米脂蛋白颗粒的高效生产。本文以表达沙眼衣原体主要外膜蛋白（MOMP）为例演示该方法，但该方法可广泛适用于其他膜蛋白抗原。抗原有效性可进行评估 体内 通过免疫化研究来测量抗体产生，如此处所示。
引言
用于无细胞表达蛋白质的原核或真核裂解物作为商品化产品已广泛可得，可用于合成目标蛋白质（详见综述1）。这些表达系统具有多种规模，采用来自不同生物体的裂解物，包括大肠杆菌（E. coli）、烟草植物以及哺乳动物细胞培养物。与传统的重组蛋白生产方法相比，无细胞裂解物具有多种优势，包括操作简便以及高效快速的蛋白表达能力。尽管这些方法主要用于可溶性蛋白的生产，但本研究团队已率先开发出利用这些系统表达膜蛋白的方法。
这种新方法对现有的无细胞表达系统进行了微小改进，通过加入编码两种蛋白质产物的DNA，即载脂蛋白和目标膜蛋白，实现共表达。所表达的载脂蛋白（ApoA1或ApoE4的衍生物）与添加至无细胞裂解液中的脂质相互作用，自发组装成约20 nm的纳米脂蛋白颗粒（NLP）。当与目标膜蛋白共翻译时，NLP与膜蛋白形成可溶性纳米颗粒复合物，其中膜蛋白嵌入NLP的脂双层中。因此，由于膜蛋白被包裹在可溶性、离散的颗粒内，其在后续应用中更具可及性。该方法可在NLP脂双层中生成具有功能的寡聚蛋白复合物 关键词：无细胞表达系统，载脂蛋白，膜蛋白，纳米脂蛋白颗粒，NLP，脂双层，可溶性纳米颗粒，共翻译，功能蛋白复合物2 并可产生亚单位疫苗的抗原组分，随后将其与脂溶性佐剂混合，形成抗原与佐剂共定位的纳米颗粒疫苗，适用于 体内 评估
本方法改编自先前发表的方案3。主要改进集中在无细胞反应的放大以及后续对蛋白-NLP复合物的纯化。另一项改进包括添加一种名为端聚星（telodendrimer）的两亲性聚合物，该聚合物在加入无细胞反应体系前先与脂质混合。在端聚星和脂质存在下，质粒共翻译表达生成端聚星NLP（tNLP）。添加端聚星还有助于调控所形成tNLP纳米颗粒的尺寸和单分散性4。本方案特别针对大规模疫苗研究进行了优化，用于生产膜结合型亚单位抗原蛋白——沙眼衣原体MOMP5,6。该方法可产生与tNLP结合的重组MOMP，形成高度可溶的MOMP-tNLP复合物，并保留MOMP的寡聚化状态。典型的3 mL规模制备可获得>1.5 mg的纯化MOMP。无细胞体系产生的MOMP-tNLP可快速添加佐剂，用于in vivo免疫原性检测。
方案
所有动物实验均在加利福尼亚大学欧文分校符合公共卫生服务署（PHS）认证资质的设施内进行，并遵循机构动物护理与使用委员会制定的指南。
1. 玻璃器皿准备
注意：用于制备动物疫苗级制剂的所有材料均不含内毒素。
- 为破坏污染性内毒素，将用于盛装缓冲液的洁净玻璃器皿在 180 °C 烤箱中烘烤 4 小时。
2. 缓冲液的配制
- 配制 表1 中列出的250 mL镍亲和纯化缓冲液。4 °C下可保存长达6个月。
3. 反应准备
- 称取 20 mg 无内毒素的 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DMPC）至一个无内毒素的 1.5 mL 离心管中。加入 1 mL 无内毒素水溶解，使用探头超声仪在 6 A 条件下至少超声处理 4 次，每次 1 分钟，中间间隔 1 分钟，直至溶液澄清。于 22 °C 下以 13,000 × g 离心 2 分钟，去除探头上可能脱落的金属污染物，然后将溶解后的脂质转移至一个新的 1.5 mL 无内毒素离心管中。
- 称取 1 mg PEG5k-CA8 端树状大分子至一个 1.5 mL 无内毒素离心管中。用无内毒素水溶解至浓度为 20 mg/mL，涡旋振荡至完全溶解，再稀释至 2 mg/mL。
- 在另一个无内毒素离心管中，将 210 µL 的 20 mg/mL DMPC 溶液与 210 µL 的 2 mg/mL 端树状大分子溶液混合。
4. 用于亚单位疫苗制剂的无细胞合成 MOMP-tNLP
- 采用改良自先前发表方案的无细胞方法制备 MOMP-tNLPs5。
- 在设置无细胞反应前两小时，打开原核无细胞蛋白表达试剂盒，解冻其中一种重建缓冲液。解冻后，加入一片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合片剂，使其完全溶解。
- 使用专为运行 5 × 1 mL 反应设计的试剂盒进行本方案。
注意：典型的放大生产规模为 3 × 1 mL。- 对于每个 1 mL 反应，向 E. coli 裂解液瓶中加入 525 µL 重建缓冲液，轻轻滚动以溶解。向含有反应添加剂（如 ATP、GTP）的瓶子中加入 250 µL 重建缓冲液，并轻轻滚动以溶解。
- 向反应补料瓶中加入 8.1 mL 重建缓冲液，用橡胶塞盖紧（注意不要触碰橡胶塞内部），然后轻轻倒置或滚动以溶解。
- 向氨基酸混合物瓶中加入 3 mL 重建缓冲液，用橡胶塞盖紧，并轻轻倒置或滚动以溶解。
注意：注意不要触碰橡胶塞内部，以免造成污染。 - 向甲硫氨酸瓶中加入 1.8 mL 重建缓冲液，轻轻滚动使其溶解，然后置于冰上保存待用。
- 制备反应溶液。
- 向 E. coli 裂解液瓶中加入 225 μL 重建的反应混合液、270 μL 重建的不含甲硫氨酸的氨基酸混合液以及 30 μL 重建的甲硫氨酸。此外，加入 400 μL DMPC/端树状聚合物混合物、15 μg MOMP 质粒和 0.6 μg Δ49ApoA1 质粒。轻轻滚动或轻摇以混匀。
注意：确保两种质粒均构建于相同的质粒骨架上。切勿涡旋震荡。 - 取 20 μL 总反应液，置于 1.5 mL 离心管中，用于后续的 GFP 表达对照反应（见下文）。
- 向 E. coli 裂解液瓶中加入 225 μL 重建的反应混合液、270 μL 重建的不含甲硫氨酸的氨基酸混合液以及 30 μL 重建的甲硫氨酸。此外，加入 400 μL DMPC/端树状聚合物混合物、15 μg MOMP 质粒和 0.6 μg Δ49ApoA1 质粒。轻轻滚动或轻摇以混匀。
- 制备补料溶液。向补料混合瓶中加入 2.65 mL 重建的不含甲硫氨酸的氨基酸混合液和 300 μL 重建的甲硫氨酸。轻轻滚动或轻摇以溶解。
注意：此时未使用的重建缓冲液和甲硫氨酸可放回冰箱冷冻保存。 - 将 1 mL 反应溶液转移至无细胞反应试剂盒提供的内层反应室中，加满后密封。将 10 mL 补料溶液转移至反应容器的外层腔室中并密封。
注意：切勿过度填充腔室！内层反应室和内层补料室顶部若存在气泡，将对反应产生不利影响。剩余的反应溶液可置于 1.5 mL 离心管中，与主反应容器一同孵育混合。 - 向先前分装的 20 µL 反应混合物中加入 0.5 μL GFP 对照质粒（0.5 mg/mL）。
注意：许多试剂盒均附带用于质量控制的对照质粒。任何带有 T7 启动子和 E. coli 核糖体结合位点（RBS）的 GFP 表达质粒也可用作对照质粒。 - 将反应体系置于摇床中，在 300 rpm、30 °C 条件下孵育最长 18 小时。为验证反应是否成功，可在孵育仅 15 分钟后使用紫外光源检测因对照 GFP 合成而产生的荧光（图 1A）。
注意：这些条件，尤其是温度，可能需要根据其他膜蛋白的表达情况进行优化。
5. MOMP-tNLP 的纯化
- 利用固定化镍亲和层析，通过Δ49ApoA1蛋白上的His标签，从无细胞反应混合物中纯化MOMP-tNLP纳米颗粒复合物。
- 将1 mL 50%的His标签纯化树脂悬浊液转移至一次性10 mL层析柱中，并用3 mL结合缓冲液进行平衡。
- 让缓冲液流尽，封闭出口，向树脂中加入250 μL结合缓冲液。
- 在将无细胞反应液加入层析柱前，保留20 μL用于后续SDS-PAGE分析。将无细胞反应液与已平衡的树脂混合，在4 °C下于实验室摇床上孵育1小时。
- 打开层析柱，用500 μL额外的结合缓冲液冲洗柱塞，并将此液体加入柱体中。
- 收集层析柱流出的穿流液，用于后续SDS-PAGE分析。
- 用含20 mM咪唑的洗涤缓冲液每次1 mL，共洗涤六次，并收集各洗脱组分。注意避免树脂在洗涤间隙干燥。第二次洗涤时，使用1 mL移液器反复吹打，剧烈振荡树脂。
- 用洗脱缓冲液1（含250 mM咪唑）分六次每次300 μL洗脱MOMP-tNLP，随后用300 μL洗脱缓冲液2（含500 mM咪唑）进行最后一次洗脱。第二次洗脱时，使用1 mL移液器反复吹打，剧烈振荡树脂。
6. SDS-PAGE 分析
注意：所有洗脱组分均应通过SDS-PAGE分析，以检测目标蛋白的含量和纯度。
- 分别取1 µL总裂解液和流穿液，以及5 µL所有收集的洗涤液和洗脱组分。
- 将洗脱的MOMP–tNLPs、洗涤液、流穿液和总裂解液的等分试样与4x SDS-PAGE上样缓冲液混合。除非另有说明，否则加入10x样品还原剂，混匀后进行加热变性。
- 使用1.0 mm厚、4–12% Bis-Tris SDS-PAGE凝胶，以1x MES-SDS电泳缓冲液进行凝胶电泳分析，并同时使用适当分子量标准品。在200 V电压下电泳35分钟。
- 按照制造商说明书对凝胶进行染色。
- 将凝胶从玻璃板中取出，放入盛有60 mL染色液的容器中。将凝胶在染色液中微波加热30秒，轻轻摇动容器30秒以均匀传热。再次将凝胶在染色液中微波加热至80–85 °C，持续30秒，然后将凝胶置于摇床上振荡5分钟。
- 第三次将凝胶微波加热30秒，随后放回摇床继续振荡23分钟。
- 将凝胶转移至洁净容器中，用100 mL洗涤液（10%甲醇，7%乙酸）清洗30分钟。
注意：此步骤至关重要，必须避免加热洗涤液，否则可能导致背景染色及最终凝胶图像出现异常。 - 洗涤后，用超纯水冲洗凝胶两次，每次5分钟。
- 使用凝胶成像系统在600 nm波长下成像（图2）。若存在可比对的蛋白质标准品，可通过SDS-PAGE定量纳米颗粒溶液中各蛋白质的含量。
注意：本示例中，通过SDS-PAGE分离不同梯度稀释的重组表达MOMP蛋白，并使用仪器软件对条带密度进行定量分析。 - 根据MOMP条带的密度绘制标准曲线。将MOMP-tNLP样品与标准品在同一块SDS-PAGE凝胶上电泳，利用MOMP标准曲线计算颗粒中的MOMP组分含量 （图3）。
7. 蛋白质印迹与点印迹及储存
- 进行蛋白质印迹时，使用 SDS-PAGE 分离样品，并根据制造商的说明书，采用商用干式转膜系统及标准设置将凝胶中的蛋白转移至膜上。
- 转膜完成后，从转膜叠层中取出印迹膜，并在含有 0.2% Tween 20 以及针对 Δ49ApoA1 蛋白 His 标签的 0.5 mg/mL MAb40 或 0.2 mg/mL MAbHIS 抗-His 标签抗体的适当封闭缓冲液中，4 °C 下孵育过夜。
注意：用于印迹的抗体稀释比例为 MAb40 1:1,000，MAbHIS 抗体 1:500–1,000。 - 用 PBS-T（1× PBS，0.2% Tween 20，pH 7.4）洗涤每张印迹膜 3 次，每次 5 分钟。
- 在含有与荧光染料（例如 IRDye）偶联的二抗、稀释比例为 1:10,000 的封闭缓冲液中，室温孵育印迹膜 1 小时。
- 再次用 PBS-T 洗涤印迹膜 3 次，每次 5 分钟。最后一次洗涤后，使用荧光成像仪对印迹膜进行成像。
- 转膜完成后，从转膜叠层中取出印迹膜，并在含有 0.2% Tween 20 以及针对 Δ49ApoA1 蛋白 His 标签的 0.5 mg/mL MAb40 或 0.2 mg/mL MAbHIS 抗-His 标签抗体的适当封闭缓冲液中，4 °C 下孵育过夜。
- 进行点印迹时，使用点印迹装置点样 3 μg 纯化的 MOMP-tNLP 和空载 tNLP。封闭和显色步骤采用与上述蛋白质印迹相同的方法进行。
8. 内毒素评估
- 使用基于鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）检测法的内毒素检测系统定量内毒素水平。使用1 M三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris hydrochloride）溶液和无内毒素水配制无内毒素的25 mM Tris（pH 7.4）样品缓冲液。
注：通常需要使用该样品缓冲液对样品进行稀释，并调整稀释倍数以确定各样品的合适检测范围。此处，MOMP-tNLP样品在样品缓冲液中稀释500倍，每孔加入25 µL至检测装置的试剂盒中，检测灵敏度为0.05 EU/mL。在下述小鼠研究中所用的MOMP-tNLP和空载tNLP的内毒素水平因样品而异，介于0.4至12 EU/µg蛋白之间。
9. 冷冻干燥
- 将 MOMP-tNLP 纳米颗粒冻干后于 -20 °C 保存，可长期（长达数年）使用。为制备用于冻干的 tNLP 和 MOMP-tNLP 悬液，需在冷冻和冻干过程中加入海藻糖作为保护剂。
注意：该过程已在多种 tNLP 制剂中得到充分验证7,8。 - 将当前 MOMP-tNLP 溶液的体积除以 9，得到所需 1 M 海藻糖溶液的体积（溶剂为无菌、无内毒素的去离子水），以使终浓度达到 0.1 M 海藻糖。记录最终体积，并根据需要分装至无内毒素的 15 mL 或 50 mL 聚丙烯管中。
- 将混合溶液在干冰上冷冻，并使用冻干机过夜冻干。将冻干后的制剂储存于 -20 °C，直至使用。
- 使用无内毒素的水重悬冻干的 tNLP。轻轻滚动，直至冻干粉末完全溶解并重新水化。如需去除海藻糖，可使用截留分子量为 3.5 kDa 的透析膜，在 PBS 中对溶液进行透析。
10. 佐剂添加
注意：这些及其他类似的基于NLP的亚单位疫苗制剂可轻松掺入脂溶性佐剂，例如CpG-ODN1826和FSL-1。CpG-ODN1826是一种经过修饰的B类CpG寡核苷酸（5'-tccatgacgttcctgacgtt-3'），具有完全硫代磷酸骨架，并带有5'胆固醇基团（5'-chol-C6）。CpG-ODN1826与tNLP的结合是通过胆固醇基团与tNLP磷脂双分子层之间的疏水相互作用介导的，该结合方式已被证实并得到充分表征，如先前报道所述9,10。
- 在将胆固醇修饰的 CpG 加入这些制剂之前，需通过反相色谱法对其进行纯化，以去除污染性的内毒素以及任何未修饰的 CpG 分子。
- 从供应商处收到后，用无内毒素的水重悬冻干的 CpG 材料，并使用制备型 C4 反相高效液相色谱柱进行纯化，分离梯度由 10 mM 三乙基乙酸铵（TEAA）（流动相 A）和乙腈（流动相 B）组成。
注：更多细节见表 2。 - 合并含有胆固醇修饰 CpG 的洗脱组分并进行冻干。为确保完全去除残留的 TEAA，用 15 mL 无内毒素的水重新溶解 CpG，并重复冻干三次。
- 最后一次冻干后，用无内毒素的水重悬 CpG（>20 mg/mL 的最终 CpG 浓度），分装后于 -80 °C 保存，直至使用。在加入制剂前，将 CpG 稀释至 1–2.5 mg/mL 的浓度。
注：FSL-1 可作为疫苗级冻干粉末获得，使用无菌且无内毒素的水重悬至 1 mg/mL 的浓度。该疫苗通过肌内注射（i.m.）给药，每剂包含 10 μg MOMP，总体积为 50 μL。
- 从供应商处收到后，用无内毒素的水重悬冻干的 CpG 材料，并使用制备型 C4 反相高效液相色谱柱进行纯化，分离梯度由 10 mM 三乙基乙酸铵（TEAA）（流动相 A）和乙腈（流动相 B）组成。
- 为达到所需的制剂剂量，需将纳米颗粒透析至 PBS 中，并在添加佐剂前使用离心真空浓缩仪进行浓缩。操作时需注意防止样品完全干燥——在离心过程中每 20–30 分钟检查一次样品体积。
- 在生物安全柜内无菌条件下添加佐剂。为评估佐剂成功包载情况，采用分析型尺寸排阻色谱（SEC）对最终制剂及其组分进行分析。
注：在这些制备过程中，使用了 PBS 缓冲液中的 SEC 柱（流速为 0.5 mL/min），并通过紫外-可见光二极管阵列检测器检测洗脱组分。通过比较添加佐剂颗粒与未添加佐剂颗粒在 214 nm 和 280 nm 处的吸光度来评估包载效果。 - 在动物实验使用前，将含佐剂的 MOMP-tNLP 和空载 tNLP 储存于 4 °C，最长可保存 14 天。为全面评估新型 tNLP 制剂的稳定性，应定期通过 SEC 分析储存的 tNLP。
注：不同制剂的稳定性可能存在差异。
11. 血清学检测
- 取6只3周龄雌性小鼠（BALB/c品系，n = 6）。
- 在每只小鼠的后肢肌肉内（i.m.）接种10 µg MOMP，以MOMP-tNLP形式给予，并添加5 µg CpG和1 µg FSL-1作为佐剂（每次注射总体积为50 mL）。
- 接种后观察小鼠，直至其能够维持胸卧位。
- 初次免疫（初免）4周后，对动物进行第二次免疫（加强免疫），接种10 µg MOMP，以MOMP-tNLP形式给予，并添加5 µg CpG和1 µg FSL-1作为佐剂（每次注射总体积为50 mL）。
- 初次免疫后第56天，采集血液以检测抗体滴度。首先通过腹腔注射（i.p.）给予赛拉嗪（0.3 mg/20 g体重）和氯胺酮（3.0 mg/20 g体重）溶液进行麻醉。轻捏前肢和后肢，确认无反射性抽动。在眼部周围涂抹凡士林，防止麻醉期间眼睛干燥。
- 使用微毛细管刺破小鼠眶后丛，收集100 mL血液至微量离心管中。
- 采血后继续观察小鼠，直至其从麻醉中恢复并能维持胸卧位。
- 将血液在室温下静置凝固30分钟，随后在2,000 × g 条件下离心10分钟。收集血清，并于-80 °C冷冻保存。
- 此时可对动物进行Chlamydia muridarum攻毒或实施安乐死。安乐死方法为：首先腹腔注射赛拉嗪（0.3 mg/20 g体重）和氯胺酮（3.0 mg/20 g体重）溶液，随后进行颈椎脱位。
- 采用上述所述的Western blot技术检测针对MOMP的特异性血清抗体。将所有免疫小鼠的血清混合，将混合血清按1:5,000稀释后作为一抗使用。
结果
1 mL 无细胞反应中 MOMP-tNLP 经镍亲和纯化后的 SDS-PAGE 谱图如图 1B所示。该反应中 MOMP 和 Δ49ApoA1 蛋白均实现了高水平表达。先前的研究结果表明，在 DMPC 和端粒树状大分子存在下，Δ49ApoA1 的无细胞表达可形成端粒树状大分子纳米脂蛋白颗粒（tNLPs）4。MOMP 与 Δ49ApoA1 共洗脱表明 MOMP 与 tNLPs 相结合，因为 His 标签仅存在于 tNLP 支架蛋白 Δ49ApoA1 上，而不存在于 MOMP 上。MOMP 是一种高度不溶性蛋白，只有通过与 tNLPs 结合才能被洗脱，而 tNLPs 已被证明可促进膜蛋白的溶解。
将含有MOMP-tNLP的洗脱组分合并，并使用基于荧光的定量设备或通过280 nm吸光度测定浓度的设备，按照制造商提供的蛋白质定量说明测定总蛋白浓度。为了实现MOMP疫苗的精确给药，还需确定纯化复合物中MOMP的浓度。我们建立了一种基于凝胶密度测定法的MOMP定量方法（图2），该方法采用已知浓度的纯化重组MOMP作为标准品。通过建立标准曲线并与MOMP-tNLP样品进行比较，可准确量化MOMP的浓度。测定纯化样品中的MOMP浓度有助于估算不同规模无细胞反应中MOMP的产率，这对于规划适合后续研究的反应体系具有重要意义（表3）。
MOMP 需要形成寡聚体才能引发强烈的免疫反应11。为了检测 MOMP 的寡聚状态，在有无加热以及还原剂二硫苏糖醇（DTT，50 mM）的条件下对 MOMP-tNLP 进行了分析（图 3A）。当样品未经加热和 DTT 处理时，通过 SDS-PAGE 检测到 MOMP 的高级寡聚体。相比之下，在 DTT 存在下经加热处理的样品在凝胶上主要显示两条明显不同的条带，分别对应于 MOMP 和 Δ49ApoA1（分子量分别约为 40 kDa 和 22 kDa）。这些结果与 MOMP 寡聚体形成的凝胶条带模式高度相似，而寡聚化对其功能有效性至关重要。
进一步使用MAb40进行Western印迹分析，该抗体针对MOMP蛋白可变区上的线性表位，结果显示相似的条带模式，证实MOMP蛋白在其非变性状态下形成寡聚体（图3B）。影响MOMP寡聚体形成的一个重要因素是在无细胞反应体系构建过程中MOMP质粒与Δ49ApoA1质粒的比例。表4列出了不同质粒比例及其对应的MOMP插入tNLPs的效率。既往研究表明，衣原体MOMP及其他外膜蛋白主要以三聚体形式存在12。为了在无细胞反应中最大化三聚体的形成，理想情况是每个NLP插入约三个MOMP蛋白，这对应于约25:1的MOMP与Δ49ApoA1质粒比例。
采用点印迹法作为更简便的方法来检测MOMP和tNLP的存在。使用MAb40抗体检测总MOMP，使用靶向tNLP中Δ49ApoA1支架上His标签的MAbHIS抗体来评估tNLP的存在。MAb40与MAbHIS抗体的共信号提示MOMP-tNLP的形成。对照反应生成空载tNLP，仅显示MAbHIS的阳性信号。图3C）。为了检测无细胞反应中产生的 MOMP-tNLP 的免疫原性，我们将 MOMP-tNLP 与 CpG + FSL-1 佐剂联合，按照上述描述的初免-加强免疫程序经肌内注射（i.m.）注入小鼠体内。采集免疫小鼠的血清，采用蛋白质印迹法（western blot assay）检测 MOMP 特异性 IgG 抗体。图4）。注射佐剂化MOMP-tNLP的小鼠血清显示出强烈的MOMP结合能力，表明MOMP-tNLP能够诱导免疫反应 体内.
图1：MOMP-tNLP的表达与纯化。（A）试管图像显示，在紫外光源下成功表达GFP的无细胞反应小份样品发出荧光（右侧），与不含GFP质粒的裂解液对照（左侧）相比。（B）SDS-PAGE后用SYPRO Ruby染色的蛋白凝胶，显示MOMP-tNLP的纯化过程。MOMP迁移至40 kDa位置，49ApoA1迁移至22 kDa位置。缩写：MOMP = 沙眼衣原体主要外膜蛋白；tNLP = 端树状大分子纳米脂蛋白颗粒；MOMP-tNLP = MOMP-tNLP复合物；GFP = 编码绿色荧光蛋白的质粒；MW = 分子量标记物；T = 总无细胞裂解液；FT = 穿流组分；R1-R3 = 无细胞反应小份样品；W1、W6 = 洗脱1和6；E1-E7 = 洗脱组分1至7；Δ49ApoA1 = 带His标签的小鼠ApoA1衍生物。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：MOMP-tNLP 样品中 MOMP 的定量分析。（A）使用 SYPRO Ruby 染色的 SDS-PAGE 凝胶对 MOMP 进行定量。将已知浓度的重组 MOMP 加样至凝胶以获得标准曲线。每条泳道分别加入 0.1 µg、0.5 µg、1.0 µg、2.0 µg 和 4.0 µg 的 MOMP。待定量的 MOMP-tNLP 样品与标准品在同一块凝胶上加样。（B）通过密度测定法生成 MOMP 浓度标准曲线。建立了归一化条带密度与 MOMP 量之间的方程，并利用该方程计算未知样品中的 MOMP 含量。缩写：MOMP = 沙眼衣原体主要外膜蛋白；tNLP = 端树突纳米脂蛋白颗粒；MOMP-tNLP = MOMP-tNLP 复合物；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：无细胞表达的MOMP-tNLP可使MOMP形成高级结构。（A）经或未经加热及还原剂DTT处理的MOMP-tNLP的SDS-PAGE凝胶，使用SYPRO Ruby染色。在加热和DTT处理后，MOMP主要以约40 kDa的单体条带形式出现，表明加热和还原剂破坏了大部分MOMP的高级结构。在未加热且无DTT处理的条件下，存在高级条带，提示MOMP具有寡聚构象。（B）MOMP-tNLP与单独MOMP在未处理及经加热和DTT处理后的蛋白质印迹分析。转膜后，使用MAb40（1:1,000稀释）进行杂交。观察到的条带模式与SYPRO Ruby染色凝胶相似，证实高分子量条带确为MOMP寡聚体。（C）MOMP-tNLP与空载tNLP样品（设两个重复）的点印迹分析，分别使用MAb40和MAbHIS进行检测。缩写：MOMP = 沙眼衣原体主要外膜蛋白；tNLP = 端树状大分子纳米脂蛋白颗粒；MOMP-tNLP = MOMP-tNLP复合物；SDS-PAGE = 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；DTT = 二硫苏糖醇。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：无细胞表达的MOMP-tNLP具有高度免疫原性。 来自免疫小鼠的血清显示出强烈的抗MOMP IgG信号。使用CpG + FSL-1作为佐剂的MOMP-tNLP对小鼠进行免疫。收集六只免疫小鼠的血清，混合后用于检测MOMP-tNLP。该血清在蛋白质印迹实验中能够结合MOMP，并显示出强烈的IgG信号（左图）。使用MAb40作为一抗的蛋白质印迹（右图）显示出相似的条带，表明该血清中含有MOMP特异性的IgG。缩写：MOMP = 沙眼衣原体主要外膜蛋白；tNLP = 端树枝状大分子纳米脂蛋白颗粒；MOMP-tNLP = MOMP-tNLP复合物；CpG = 胆固醇修饰的CpG佐剂；FSL-1 = 亲脂性佐剂。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 缓冲液名称 | NaH2PO4 | NaCl | 咪唑 | pH |
| 结合缓冲液 | 50 mM | 300 mM | 10 mM | 8.0 |
| 洗涤缓冲液 | 50 mM | 300 mM | 20 mM | 8.0 |
| 洗脱缓冲液 1 | 50 mM | 300 mM | 250 mM | 8.0 |
| 洗脱缓冲液 2 | 50 mM | 300 mM | 500 mM | 8.0 |
表1： 镍亲和纯化所需缓冲液列表，详细列出各组分浓度及pH值。
| 运行时间 | 50 min |
| 流速 | 6.0 mL/min |
| 梯度类型 | 二元梯度 |
| 缓冲液 A | 10 mM TEAA in H20 |
| 缓冲液 B | MeCN |
| 梯度 | % 缓冲液 B |
| 0 min | 25% |
| 30 min | 60% |
| 30.5 min | 100% |
| 40 min | 100% |
| 40.5 min | 25% |
| 50 min | 25% |
表2：胆固醇修饰CpG反相高效液相色谱纯化的条件。缩写：TEAA = 三乙基乙酸铵；MeCN = 乙腈。
| 无细胞裂解液 (mL) | DMPC 脂质 (mg) | 端树状大分子 (mg) | MOMP 质粒 (µg) | 纯化的 MOMP 产量 (mg) |
| 1 | 4 | 0.4 | 15 | 0.5 |
| 2 | 8 | 0.8 | 30 | 1.1 |
| 3 | 12 | 1.2 | 45 | 1.6 |
| 5 | 20 | 2 | 75 | 2.7 |
表3：用于不同规模无细胞反应的脂质、端粒树形分子和质粒的用量及相应的产量。缩写：MOMP = 沙眼衣原体主要外膜蛋白；DMPC = 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱。
| 质粒投入比例，MOMP : Δ49ApoA1 | 1:1 | 5:1 | 10:1 | 25:1 | 50:1 | 100:1 | |
| 产生的蛋白量比例，MOMP : Δ49ApoA1 | 0.02 | 0.32 | 0.64 | 3.46 | 6.55 | 20.04 | |
| 每个tNLP中MOMP插入的估计数量 | 0.03 | 0.37 | 0.75 | 4.04 | 7.65 | 23.39 | |
表4：无细胞反应体系中的质粒比例及相应的MOMP插入率。缩写：MOMP = 沙眼衣原体主要外膜蛋白；tNLP = 端粒状纳米脂蛋白颗粒；Δ49ApoA1 = 带有His标签的小鼠ApoA1衍生物。
讨论
沙眼衣原体是影响男性和女性最常见的性传播感染。尽管针对沙眼衣原体的疫苗研究已有数十年历史，但一种安全有效且可实现大规模生产的疫苗至今仍未成功研发13。沙眼衣原体的主要外膜蛋白（MOMP）被认为是具有保护作用的候选疫苗抗原；然而，MOMP具有高度疏水性，容易发生错误折叠14,15。进一步研究表明，MOMP以寡聚状态存在，而这种状态对其免疫原性至关重要11。本文详细描述了一种经过验证的无细胞共表达方法，该方法可在tNLP纳米颗粒内形成寡聚态MOMP作为疫苗，每3 mL裂解液可获得约1.5 mg纯化的MOMP。这一完整整合的流程可进一步放大用于工业化生产，从而提升了其作为疫苗制备有效策略的应用前景。
我们先前已发表过利用无细胞表达系统在纳米脂盘（NLP）中表达膜蛋白，以及在端树状大分子稳定脂盘中进行表达的研究3,16。然而，后一种技术所产生的膜蛋白颗粒具有更高的异质性和更低的溶解度4。此外，与MOMP-tNLP颗粒相比，MOMP-端树状大分子颗粒的免疫原性尚不明确6。
该方法可适用于扩大表达具有亚单位疫苗抗原潜力的细菌膜蛋白。此方法不仅能够产生可溶性的细菌膜蛋白，而且其整体纳米颗粒结构还可通过多种脂溶性疫苗佐剂进行进一步修饰，包括但不限于与胆固醇基团偶联的CpG或FSL-1。表达其他细菌来源的候选抗原也是可行的，但可能需要优化表达温度、脂质选择以及表达系统类型等参数，以获得最佳产量。
此外，质粒的选择和比例在此过程中至关重要。所使用的两种质粒应基于相同的骨架构建。如果插入片段长度相近，可根据所加质粒的质量来确定比例，如本文所述。然而，基于摩尔数进行比例配比可获得更可重复的结果，尤其是在放大反应规模时。适用于小规模筛选反应（< 0.5 mL）的比例可能不适用于较大规模的反应，可能需要进一步优化。非膜蛋白仍可使用无细胞试剂盒进行表达，但可能无需脂质纳米颗粒（共表达）即可产生可溶性产物。此外，尽管本方案描述了使用CpG和FSL-1作为佐剂，该系统也可根据需要与其他脂溶性佐剂配制，或与可溶性佐剂混合使用。
在建立无细胞表达反应体系时，必须避免污染，因为污染可能影响产物得率。所有添加到反应体系中的成分，包括质粒本身，都应具有高纯度。此外，表达的蛋白质应仅与无内毒素污染的材料和溶液接触。候选制剂中的内毒素污染可能导致免疫学检测结果不一致或出现假阳性，并在足够浓度下对机体造成危害。尽管本文未作描述，但如果在后续分析步骤（如SDS-PAGE）中观察到大量杂质，则在镍亲和层析之后可能需要进一步纯化。这可以通过尺寸排阻层析（SEC）实现，但具体条件可能需要针对不同制剂进行优化。
披露
作者声明，他们不存在任何已知的相互竞争的经济利益或可能被认为影响本文所报告工作的个人关系。
致谢
本工作由美国国家过敏与传染病研究所的公共卫生服务基金资助，项目编号为 R21 AI20925 和 U19 AI144184。本工作在美国能源部合同 DE-AC52-07NA27344 的授权下，由劳伦斯利弗莫尔国家实验室完成 [LLNL-JRNL-822525, LLNL-VIDEO-832788]。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 粉末状 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DMPC） | Avanti Polar Lipids | 850345 | |
| 1.5 mL 无内毒素离心管 | Eppendorf | 2600028 | |
| 1 M Trizma 盐酸溶液 | Millipore Sigma | T2194 | |
| 冰醋酸，ACS 试剂，≥99.7% | Millipore Sigma | 695092 | |
| Bio-Dot 装置 | Bio-Rad | 1706545 | |
| XCell SureLock 缓冲液坝 | Life Technologies | EI0012 | |
| C24 恒温振荡培养箱 | New Brunswick Scientific | ||
| 无细胞表达系统：RTS 500 ProteoMaster E. coli HY 试剂盒 | BiotechRabbit | BR1400201 | |
| cOmplete His-Tag 纯化树脂 | Roche Molecular Diagnostics | 5893682001 | |
| cOmplete，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Molecular Diagnostics | 4693132001 | |
| CpG-ODN1826 | Biosearch Technologies | T9449 | |
| D-(+)-海藻糖二水合物 | Millipore Sigma | 71509 | |
| 透析管 D-Tube Dialyzer Maxi | Millipore Sigma | 71508-3 | |
| 一次性聚丙烯筛板柱，10 mL 容量 | Bio-Rad | 7311550EDU | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS） | Millipore Sigma | D8537 | |
| 电泳电源 | |||
| Endosafe PTS 检测盒 | Thermo Fisher Scientific | NC9594798 | |
| Endosafe-PTS 检测系统 | Charles River | ||
| 凝胶洗涤液：10% 甲醇，7% 乙酸 | |||
| 用于 pH 调节的 HCl 和 NaOH 溶液 | |||
| 配备紫外-可见二极管阵列检测器的高效液相色谱仪（HPLC） | Shimadzu | ||
| HyClone HyPure 培养级水 | VWR | 82007-328 | |
| iBlot 2 干式转印系统 | Life Technologies | ||
| iBlot 2 转印叠层，PVDF | Life Technologies | IB24001 | |
| Image Studio V2.0 软件 | Li-COR Biiosciences | ||
| 咪唑 | Millipore Sigma | I5513 | |
| Immun-Blot PVDF 膜 | Bio-Rad | 1620177 | |
| LI-COR Odyssey Fc 成像仪 | Li-COR Biiosciences | ||
| 冷冻干燥机 | Labconco | ||
| 甲醇（≥99.9%） | Millipore Sigma | 34860 | |
| 微量离心机 | |||
| 微波炉 | |||
| NanoDrop One/OneC 微量紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NuPAGE 4 至 12%，Bis-Tris，1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE LDS 上样缓冲液（4x） | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20x） | Life Technologies | NP000202 | |
| NuPAGE 样品还原剂（10x） | Life Technologies | NP0009 | |
| 含 0.2% Tween 20 的 TBS 配制 Odyssey 封闭缓冲液 | Li-COR Biosciences | 927-50000 | |
| 旋转摇床 | |||
| PBS-T（1x PBS，0.2% Tween 20，pH 7.4） | |||
| PEG5K-CA8 端基树状大分子（定制合成产品） | |||
| pIVEX2.4d 载体 | Roche Molecular Diagnostics | ||
| 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12162 | |
| 一抗：MAb40（针对 C. muridarum MOMP 可变区 1（VD1）的单克隆抗体，de la Maza 实验室）4 | |||
| 一抗：MAbHIS，Penta-His 抗体 | Qiagen | 34660 | |
| 探头式超声破碎仪 | |||
| Qubit 3.0 荧光计 | Life Technologies | Q33216 | |
| Qubit 蛋白检测试剂盒 | Life Technologies | Q33212 | |
| Rainin 移液器吸头：LTS 1000 µL | Rainin | 17002428 | |
| Rainin 移液器吸头：LTS 20 µL | Rainin | 17002429 | |
| Rainin 移液器吸头：LTS 200 µL | Rainin | 17002426 | |
| Rainin 移液器 | Rainin | ||
| 二抗：IRDye 800CW 山羊（多克隆）抗小鼠 IgG（重链和轻链） | Li-COR Biosciences | 926-32210 | |
| SeeBlue Plus2 预染蛋白质标准品 | Life Technologies | LC5925 | |
| 氯化钠 NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| 磷酸二氢钠 NaH2PO4 | Millipore Sigma | S0751 | |
| Superdex 200，5/150 GL 柱 | Cytiva | GE28-9909-45 | |
| 合成双酰化脂蛋白-TLR2/6 FSL-1 | Invivogen | tlrl-fsl | |
| SYPRO Ruby 蛋白凝胶染色剂 | Life Technologies | S12001 | |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | |
| 紫外光源 | |||
| Vacufuge 台式离心机 | Eppendorf | ||
| 涡旋振荡器 | |||
| VWR 15 mL 锥形离心管（89039-666） | VWR | ||
| VWR 50 mL 锥形离心管（89039-656） | VWR | ||
| XCell SureLock Mini-Cell（Life Technologies） | Life Technologies | EI0001 |
参考文献
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重印与许可
