整合型细胞信号分析工具包：力学、运动、形态与荧光

摘要

整合型细胞信号分析工具包（iTACS）平台可自动化同步测量贴壁细胞中的多种化学和机械信号。iTACS 旨在促进社区驱动的开发模式，并使研究人员无论其教育背景如何，均能使用平台的全部功能。

摘要

在过去的四十年中，细胞力学力与运动的定量评估取得了显著进展。这些进展为在细胞培养系统中研究深入的机械信号传导过程提供了框架。然而，该领域目前面临三个问题：所获取数据缺乏质量标准化，数据分析与可视化中的技术错误，以及或许最为重要的一点——该技术仍难以被普通细胞生物学实验室所获取。为克服这些局限性，我们开发了一种新的实验平台——细胞信号整合分析工具包（Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals, iTACS）。iTACS 包含两个模块：采集与训练模块（Acquisition and Training Module, AcTrM）和分析与可视化模块（Analysis and Visualization Module, AnViM）。AcTrM 基于 µManager——一种以 NIH-ImageJ 为基础的显微镜控制软件——可促进用户自主训练并实现常规图像采集流程的自动化。AnViM 基于 NIH-ImageJ，可实现数据分析的用户友好型自动化，并对结果进行深入的可视化呈现。这些实验包括在水凝胶上培养贴壁细胞，对嵌入水凝胶中的基准标记物进行成像，并最终从这些图像中提取出细胞的全面力学特征。目前，iTACS 能够使用户分析并追踪多种细胞特性，包括单个细胞及其邻近区域的形态、运动、细胞骨架力以及荧光信号。AcTrM 通过采用参考图像引导的重新对焦技术，解决了数据质量标准化的问题；AnViM 则通过多步骤图像分割流程、用户友好的边界条件识别方法，以及一种基于细胞特性的新型数据可视化策略，解决了数据分析中的技术难题。AcTrM 旨在将基础荧光显微镜简便地转化为实验性细胞力学研究装置，而 AnViM 使用户无需具备工程学背景即可测量细胞力学信号。iTACS 将以开源套件的形式向科研社区开放，并支持由社区驱动的持续开发。

引言

常用的光学成像与数据分析工具所依赖的硬件和软件技术几乎已过时。电子设备、计算方法以及数学分析领域的进展未能及时转化为常规的细胞生物学实验工具，这一滞后严重制约了我们对细胞生理学认知的进展速度。目前，细胞生物学研究人员虽能便捷地使用分子生物学工具，但基于工程学原理的工具仍难以触及。单层应力显微镜（Monolayer Stress Microscopy, MSM）便是这类基于工程学原理的工具之一^1,2。尽管MSM已在全球多个实验室中被改进和研究，但其应用主要局限于具备工程学专长的实验室^{3,4,5,6,7,8,9}。

NIH-ImageJ 是细胞生物学研究人员中最受欢迎的开源工具之一¹⁰。其广泛应用得益于用户社区推动的功能改进与技术发展^11,12。ImageJ 提供了多种功能，允许用户结合高级编程语言与简化的脚本方法来开发应用程序。这些功能使得具备基础编程知识的用户也能够实现、调整并推进对软件的任何新功能贡献。基于 NIH-ImageJ 的这些优势，我们开发了细胞信号整合分析工具包（Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals, iTACS），该工具包能够以较低成本集成所需的硬件与软件，实现对贴壁细胞中多种化学和机械信号的自动化测量^11,12。

iTACS 包含两个组件：采集与训练模块（AcTrM）和分析与可视化模块（AnViM）。AcTrM 基于 µManager——一种以 NIH-ImageJ 为基础的图像采集应用程序——使用户能够对多个样本中贴壁细胞的传统光学特性及多种物理特性进行时间序列测量¹²。AcTrM 通过图形界面中包含的简明操作指引来辅助用户培训。此外，该模块还具有一项基于参考图像的自动对焦新功能，旨在促进对物理力的实时测量，并实现所获取数据的质量标准化。

AnViM 基于 ImageJ 插件、加速软件和文件处理脚本构建，使用户能够定量评估超过 50 种细胞特性，包括细胞形态、大小、取向、运动速度与方向、细胞对细胞外基质（ECM）以及邻近细胞施加的牵引力，以及单个贴壁细胞及其邻近区域的收缩力矩和剪切力矩。AnViM 使用户无需掌握底层技术背景即可量化细胞物理特性¹¹。此外，该工具支持以交互式或批处理模式进行数据分析，可生成热图以揭示特性的空间变化，并绘制图表以展示单个细胞特性的时序变化。

在典型的实验中，用户将细胞培养在一种弹性水凝胶上，该水凝胶的表面覆盖有适当的细胞外基质蛋白，并含有两种嵌入式的荧光标记物。本质上，只需获取细胞培养前后这些荧光标记物的图像，即可量化单个细胞内部及周围的作用力^2,13。AnViM 将这些结果映射到贴壁细胞簇中的各个细胞，并生成具有洞察力的图像和图表。

方案

注意：使用 iTACS 平台检测的样品是黏附在软基底上的细胞。评估机械和化学信号的方案分为两个连续部分：采集与训练模块（AcTrM）和分析与可视化模块（AnViM）。

1. 获取与训练模块（AcTrM）

注意：AcTrM 可自动完成数据采集和用户自训练过程。在进行任何数据采集之前，需准备一种软基底，该基底能够提供用于量化细胞对其施加力所需的信息。

1. 水凝胶制备
   注意：此处的目标是制备剪切模量为1,250 Pa、厚度约为100 µm、直径为22 mm的聚丙烯酰胺（PAA）水凝胶。
   1. 按照 Yeung 等人的方法制备聚丙烯酰胺溶液，并依据 Trepat 等人描述的步骤浇铸水凝胶。^14,15一个例外情况是，位于细胞正下方的嵌入微珠直径为0.5 µm，可发出黄色荧光。
   2. 如果预期观察区域存在较大的无细胞区域，则可跳过将2 µm珠子固定到盖玻片的步骤。
      注意：水凝胶制备方案在该领域现已较为成熟¹⁶在后续描述中，0.5 µm 的微珠称为“上层微珠”，2 µm 的微珠称为“下层微珠”。然而，当成像区域包含较大的无细胞区域时，下层微珠可省略。此类无细胞区域的上层微珠分布模式即可起到下层微珠分布模式的作用。
   3. 将含有荧光微珠的水凝胶固定在显微镜载物台上。
   4. 等待15-20分钟，使平板温度达到稳态。
      注意：该培养板的顶面已用细胞外基质蛋白进行功能化处理，但细胞尚未接种于水凝胶上。
2. 参考图像采集
   1. 第1部分：创建位置列表
      注意：此步骤中的手动输入包括根据 AcTrM 提示选择磁珠分布最佳的位置。此步骤不使用任何先前创建的文件。此步骤生成的关键新文件夹包括 `t0imgs`、`tnimgs` 和 `textfiles` 文件夹，生成的文件包括位置列表文件。参见 图2 有关使用 AcTrM 创建位置列表的后续步骤的可视化描述。演示示例以 20x 放大倍数采集数据。
      1. 启动 µManager 2.0 - 测试版。
      2. 单击以运行 AcTrM AcTrM.bsh 按钮在 IMBL 资源 窗口。
      3. 在标题为 定义采集属性选择合适的物镜、侧向位置（即 XY）恢复精度的容差、粗调和精调重新对焦（即 z）操作的步长，以及对焦恢复可接受的图像相关系数值。
         注意：对侧向位置恢复设置更小的容差会减慢位置恢复速度，但容差过大则在数据分析期间需要进行位置校正，并可能导致重新对焦困难。较小的步长会减慢重新对焦操作，但步长过大可能导致移动过快而错过对焦点。
      4. 在 AcTrM - 第0步 窗口，选择 新鲜获取 创建一个位置列表。
         注意：标题为 AcTrM - 第1步 列出所有关键的后续步骤。这些步骤包括移动载物台、调节焦距以及在 µManager 中点击按钮。这些操作可指导构建适合数据采集的位置列表。
      5. 点击 活体 在 MicroManager 用于可视化样本，以便进行所列的手动调整 AcTrM - 第1步 窗口
      6. 按照此窗口上列出的步骤进行操作。
      7. 现在获取微珠的图像。为上层微珠选择合适的通道。
      8. 务必观察底部的珠子。为此，选择底部珠子对应的通道，此时可见底部珠子的图像较为模糊。
         注意：可在主 µManager 窗口的预设下拉菜单中切换通道。若实验中使用底部微珠，请确保其位于所选位置。这些微珠将呈现模糊状态。
      9. 选择合适位置后，单击 马克 在 阶段位置列表 保存位置的窗口。
         注意：最佳位置的定义是在顶表面正下方嵌入的顶部微珠分布密集且均匀（即顶部微珠），并且至少有两个微珠附着在盖玻片上（即底部微珠）补充图 S1）。如果底部珠子呈现为较大的离焦环状，则重新对焦的速度更快。然而，如果实验在固定位置进行，无需重新对焦或恢复横向位置，则可忽略与底部珠子图像相关的操作说明。
      10. 遵循第6至第9步所述操作 图2 将更多位置添加到列表中。
          注意：选择若干额外的位置，以便通过一轮淘汰后能在平板上确定最佳位置。
   2. 第二部分：参考图像的获取
      注意：此步骤无需任何手动输入。此步骤中使用的先前创建的密钥文件包括 `textfiles/*.pos`。此步骤生成的关键新文件和文件夹包括 `t0imgs` 和 `tnimgs` 文件夹中的内容。参见 图3 和 补充图 S2 用于直观描述以下使用AcTrM获取参考图像的步骤。 AcTrM - 第2步 窗口还列出了所有关键步骤。
      1. 按照所列出的步骤进行 AcTrM - 第2步 窗口中，进行以下选择 多维采集 窗口。例如，要进行长时间延时成像，需设定采集图像的数量，选择第一通道为相差通道，随后选择下一个通道用于上层微珠，再下一个通道用于下层微珠。点击 关闭 在 多维采集 窗口，然后单击 好的 在 ActrM - 第2步 窗口。
      2. 在 AcTrM - 第3步 窗口中，选择启用基于参考图像的 XYZ 位置恢复。通常情况下选择“是”。然而，如果图像在单一位置采集，且不存在焦距或载物台漂移的可能时，则可选择“否”。 AcTrM - 第3步 窗口将被 无.
      3. 在 AcTrM - XYZ 恢复选项 窗口，设置用于粗略XYZ恢复的通道、是否执行精细XYZ恢复、精细XYZ恢复的区域和通道，以及开始重新对焦的方向（补充图 S4完成后，AcTrM 将获取参考图像。
         注意：通道的典型选择为底部微珠通道。在当前实现中，XYZ恢复在使用完整图像时效果最佳。参考图像通常包括水凝胶的透射光图像、顶部微珠的荧光图像以及底部微珠的荧光图像。每组图像的具体内容可能因所选设置的不同而有所变化 多维采集 窗口。尽管如此，软件仍将在先前确定的每个位置采集参考图像集 图2在此步骤结束时，所选目录中将创建三个文件夹：`t0imgs`、`tnimgs` 和 `textfiles`。`t0imgs` 文件夹包含 µManager 可识别的参考图像，这些图像将在后续步骤中使用；`tnimgs` 文件夹包含单独的 TIFF 图像，文件名格式为 `c0_p0_t0.tif`、`c1_p0_t0.tif` 等，其中 `c` 代表通道，`p` 代表位置，`t` 代表时间，其后的数字分别表示通道编号、位置编号和帧编号。`textfiles` 文件夹包含以 XML 格式存储的位置列表，以及用户关于图像采集和位置恢复的设置选项。
3. 细胞接种与生长
   注意：iTACS 平台具有灵活性，可兼容常用样本制备方案中的操作流程 体外 黏附细胞力学行为评估，包括稀疏细胞、完全汇合的单层细胞、网络形成实验，以及存在孔洞或显著间隙的单层细胞。
   1. 在培养瓶中将大鼠肺微血管内皮细胞培养至汇合^17,18.
   2. 使用胰蛋白酶消化细胞。将细胞重悬于含10%胎牛血清的培养基中，调整细胞浓度至1 × 10⁶ cells/mL。⁶ cells/mL
   3. 将5 µL重悬细胞滴加至部分干燥的水凝胶表面，并置于细胞培养孵育箱中。
      注意：在含有10%胎牛血清的培养基中培养2天后，该液滴中的细胞形成密集的细胞岛¹.
4. 剩余实验的自动图像采集
   注意：此步骤的手动输入包括根据 AcTrM 提示继续图像采集。该步骤使用的先前创建的关键文件包括 `textfiles/*.pos` 和文件夹 `t0imgs` 中的底部微珠图像文件。此步骤生成的新关键文件包括更新的位置列表文件和图像 `tnimgs/*_t*.tif`。
   1. 确保显微镜环境控制系统达到稳定的组织培养条件。
   2. 将培养有细胞的培养板轻轻安装到显微镜载物台上。
   3. 等待15-20分钟，使温度和湿度稳定。
      注意：参见 图4 用于直观描述以下步骤，以指导使用 AcTrM 获取剩余实验图像的过程。
   4. 开始 µManager 2.0 - 测试版.
   5. 单击以运行 AcTrM AcTrM.bsh 按钮在 IMBL 资源 窗。
      注意：忽略在上述过程中所做的选择 定义采集属性 窗口，但使用上一步骤中所做的选择。
   6. 在 AcTrM - 步骤 0 窗口，选择 继续暂停采集.
   7. 选择已确定的放大倍数和目录 多维采集 在之前保存数据文件夹（'t0imags'、`tnimgs` 和 `textfiles`）的窗口中。
      注意：窗口标题会引导用户选择合适的目录。
   8. 在 重新放置培养板 窗口中，选择用于重新定位平板的选项（三个非共线位置）以及用于重新定位的通道。
      注意：保存的图像将在相机中显示。如果重叠的图像显示为红、绿、黑色的复合图像，请进行手动调整。
   9. 点击 接受 继续进行数据采集。
      注意：此步骤可克服因载物板重新安装到显微镜载物台时对位不可重复而导致的微小偏移。AcTrM 会通过显示参考图像（通常为底部微珠图像，以红色显示）与当前物镜下观察到的图像（以绿色显示）的合成图像，提示用户快速完成三个位置的对位。当绿色图像与红色图像足够接近时，可减少软件后续处理的工作量。当两者完全重叠时，合成图像呈现黄色和黑色。通常情况下，判断“足够接近”的标准是：红色和绿色图像中均可见相同的底部微珠，且对应的失焦环相互接触。载物板重新定位完成后，AcTrM 将载物台移至各个选定位置，并通过将参考图像与相机当前捕获的图像进行匹配，恢复 XYZ 位置。首先匹配横向（XY）位置，然后匹配焦平面（Z）位置。位置与焦距的恢复分为粗略恢复和精细恢复两个阶段。实验当前状态的更新信息将通过屏幕上的四部分窗口实时显示 补充图 S3获取的图像将按照“*_t1.tif”、“*_t2.tif”的命名格式保存在“tnimgs”文件夹中，以表示图像序列的时间点。如果XYZ恢复识别出更新的位置，则会生成新的位置列表，并保存在“textfiles”文件夹中。

2. 分析与可视化模块（AnViM）

1. 建立自动化数据分析系统
   注意：此步骤中的手动输入包括确定 `tnimgs' 文件夹的位置。此步骤中使用的关键先前创建的文件包括 `tnimgs/*.tif`。此步骤生成的关键新文件和文件夹包括与 `tnimgs` 位于同一父目录下的 `analysis` 文件夹，以及每个位置对应的文件夹 `analysis/p*`。在每个 `analysis/p*` 目录下，此步骤会在 `phs` 和 `tny` 文件夹中生成新的 `*.tif` 图像文件。这些图像是经过裁剪和漂移校正的细胞和顶部微珠图像。其他生成的文件包括 `analysis/analysisChoices.txt`（列出分析选项）、`analysis/p*/skipAnalysis.txt`（列出因显著预先存在的漂移而跳过分析的情况）以及 `analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat`（列出估计的漂移值）。AnViM 不会修改 `tnimgs` 文件夹中的原始数据。参见 图5 用于可视化描述以下步骤，以指导使用 AnViM 设置自动化数据分析。
   1. 启动 Fiji 软件并选择其中的第一个选项 MSM 下拉菜单，标注为 MSM - 预处理.
   2. 使用文件浏览器对话框，选择包含 `tnimgs` 文件夹的目录，该目录中包含已分析的数据。
   3. 定义图像的通道。遵循以下指南 补充图 S5，确定细胞透射光图像（细胞相差图像）、底部微珠图像和顶部微珠图像的通道编号。通常勾选以下三个复选框：“将文件移至位置文件夹”、“对刚性运动进行额外校正”、“裁剪数据并保存至位置文件夹”。最后，定义用于排除严重漂移数据的容差、像素大小，以及细胞穿过的图像边缘区域。
   4. 响应提示，通过调整菜单中的滑动条来增强底部珠像的亮度和对比度，使珠子显著可见，然后单击 好的.
   5. 现在执行位置校正以消除可能存在的位移。完成后，将创建一个分析文件夹。
      注意：通常不需要进行对比度增强，但此选项适用于需要尽量减少激光暴露的实验。完成该选择后，AnViM 会将文件从 `tnimgs` 文件夹复制到 `analysis` 文件夹。每个位置对应的文件将保存在 `analysis/p0`、`analysis/p1` 等文件夹中。在每个位置文件夹内，AnViM 会创建 `cels`、`defs` 和 `refs` 文件夹，分别用于存放原始透射光图像、顶部微珠图像和底部微珠图像。补充图 S6). AnViM 随后分析底部微珠图像中的刚性运动，并生成一个 `phs' 文件夹，其中包含细胞的校正后透射光图像，以及一个 `tny' 文件夹，其中包含更新后的顶部微珠图像。最后，用户选择的通道、操作、容差、像素大小和边界跨越参数将保存在 `analysisChoices.txt` 文件中补充图 S6).
2. 水凝胶与单层细胞形变的定量分析
   注意：需要特别指出的是，从图像序列中对运动进行量化是一个快速发展的领域¹⁹该技术在速度、准确性、原始图像中的特定特征以及特定形变模式等方面不断优化。因此，部分用户可能会采用与本文所述不同的形变量化方法。
   1. 第1部分：水凝胶形变的定量分析
      注意：此步骤中的手动输入包括确定数据目录和选择网格分辨率。此步骤使用的关键先前创建的文件包括 `p*/tny/*.tif`。此步骤生成的关键新文件包括 `p*/displacement/*_disp.dat`，其中列出了水凝胶顶面的位移矢量。参见 图6 以直观描述以下操作步骤 通过 AnViM：基于顶部微珠图像的粒子图像测速分析²⁰.
      1. 启动 Fiji 软件，然后从 MSM 下拉菜单，选择 MSM - 凝胶变形.
      2. 从这里选择适合实验的选项。
      3. 使用文件浏览器对话框，选择包含已分析数据的“analysis”文件夹的父目录。
      4. 在 计算凝胶变形的参数 窗口，选择适当的互相关窗口大小、噪声水平和阈值（补充图 S7)²⁰.
         注意：结果将保存在每个位置文件夹（如“analysis/p0”、“analysis/p1”等）内新创建的 `displacement` 目录中，所有输出文件均存储于此。
   2. 第二部分：单层膜变形的量化
      注意：此步骤中的手动输入包括指定数据目录和选择网格分辨率。此步骤使用的关键先前创建的文件包括 `p*/tny/*.tif`。此步骤生成的关键新文件包括 `p*/velocity/*_vel.dat`，该文件列出了细胞的运动矢量。参见 图7 用于直观描述操作步骤 通过 AnViM：基于顶部微珠图像的粒子图像测速法分析²⁰该步骤与用于量化水凝胶变形的方法类似，并进行选择 MSM - 细胞运动 来自 MSM 下拉菜单。结果将保存在每个位置文件夹（如“analysis/p0”、“analysis/p1”等）内新创建的“velocity”目录中。
3. 细胞-细胞外基质及细胞-细胞间作用力的量化
   注意：此步骤中的手动输入包括确定数据目录、指定水凝胶刚度，以及响应细胞簇分割提示以从无细胞区域中识别细胞。此步骤使用的关键前期生成文件包括 `p*/displacement/*_disp.dat`。此步骤生成的关键新文件包括：`p*/traction/*_trac.dat`，记录细胞对水凝胶施加的力；`p*/traction/*_domain.dat`，记录包含细胞的网格点位置；以及输入文件 `p*/traction.in`、`p*/clusterInput.txt` 和 `p*/prestress.in`，用于记录此步骤中的用户选择。在首次对细胞-ECM和细胞间作用力进行定量评估之后，该技术已发展出多种改进方法^1,15. 这些变体侧重于特定的底物、细胞、实验条件或数值工具案例^7,8,21,22。参见 图8 用于视觉描述以吸引观众 通过 AnViM、傅里叶变换牵引力显微镜以及单层应力显微镜对水凝胶形变数据的分析^1,2,15.
   1. 启动 Fiji 软件，然后从 MSM 下拉菜单，选择 MSM - 细胞-细胞外基质及细胞-细胞间作用力 （下拉菜单中的第三个选项）。
   2. 使用文件浏览器对话框，选择包含 `tnimgs` 文件夹和包含已分析数据的 `analysis` 文件夹的父目录。单击 选择.
   3. 在 计算细胞力的参数 窗口中输入剪切模量、水凝胶厚度以及预期的噪声水平。选择 好的。这使其能够产生牵引力 通过 MATLAB 函数。
      注意：输入上述参数后，AnViM 将计算细胞-ECM 作用力。
   4. 之后，判断单层细胞是否达到汇合。如果整个细胞图像区域均被细胞覆盖，则答案为是 是在这种情况下，细胞间的力将在整个图像帧范围内进行计算。另一方面，如果图像的某一部分没有细胞，则答案为 无此时，请遵循 AnViM 的提示，以辅助分割包含细胞的图像区域。
   5. 如果答案为否，则在软件提示时手动在非细胞物体周围绘制一个多边形，然后选择合适的分割方法。软件将提示选择细胞的颜色（黑色或白色）。
   6. 检查 自动填充斑点 软件中的选项并点击 好的.
      注意：非融合单层细胞的分割步骤将在第2.4节的第一部分中介绍。细胞-ECM作用力数据存储在每个位置文件夹内新建的“traction”目录下的“*_trac.dat”文件中，细胞-ECM作用力计算软件的输入文件保存为“traction.in”补充图 S8）。细胞间作用力存储在每个位置文件夹内新创建的“prestress”目录下的 `*_prestress.dat` 文件中，而细胞间作用力计算软件的输入则保存在 `prestress.in` 文件中（补充图 S9).
4. 将网格点数值映射到单个细胞上
   注意：iTACS 目前的研究重点之一是引入一种简单直接的方法，用于解读现场测量的力学信号。该方法有助于研究细胞簇中邻近细胞之间的力学相互作用。¹⁸总体而言，目前所量化的各项属性均位于细胞簇内规则分布的网格点上。该数据可识别个体细胞形态边界内选定属性的中位数、均值及标准差，并将这些统计值赋予细胞的物理属性/信号。其中，标准差用于指示属性的变异性，均值与中位数的差异用于指示分布特征，而中位数值则用于反映细胞在选定属性上的整体状态。
   1. 第1部分：包含细胞的图像区域分割
      注意：此步骤的手动输入包括指定数据目录，并响应分割提示以从无细胞区域中识别细胞。此步骤中使用的关键前期生成文件包括 `p*/phs/*.tif`。此步骤生成的关键新文件包括 `p*/phs/bwImages/*.tif`，即用于区分细胞区域与无细胞区域的二值图像；`p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt`，记录每次成像中细胞覆盖图像区域的百分比；以及 `p*/clusterInput.txt`，记录用户在 AcTrM 界面中输入的选择。参见 图9 用于可视化描述以下步骤，以分割包含细胞的图像区域。此部分必须在计算细胞间作用力之前完成。若已执行过这些步骤，则无需重复。此外，若在细胞间作用力计算前已完成这些步骤，则在开始力计算时不会再次要求执行。
      1. 启动 Fiji 软件，然后从 MSM 下拉菜单，选择 分割 - 细胞簇.
      2. 使用文件浏览器对话框，选择包含在规则间距网格点上量化的属性的目录，如 `analysis/p0`、`analysis/p1` 等。
      3. 指示单层细胞是否达到汇合。
         注意：仅当单层细胞未达到融合状态时，才执行以下步骤。根据 AnViM 的提示，应用这种新颖的多管齐下方法，识别包含细胞的图像区域。该过程包含四种方法，每种方法以不同的方式实现分割。结合使用其中一种或多种方法，可覆盖多种类型的细胞图像。因此，建议尝试不同的方法组合，以确定最适合其数据的方案。
      4. 调整“域连接因子”和“弥散因子”以获得最佳分割效果。
         注意：`涂抹因子`会使包含细胞的区域变大。
      5. 指明细胞在二值图像中呈现为黑色或白色。
      6. 在 清理边界图像的操作指南 在窗口中，选择是自动还是手动清理图像。
         注意：图像中的非理想特征包括细胞占据的像素上的黑点，以及与待分析细胞簇不相连区域上的白点。分析只能在相互连接的区域内进行，因此多个不相连的区域必须分别分析。
   2. 第2部分：图像中单个细胞的分割
      注意：此步骤的手动输入包括指定数据目录，以及响应分割提示以识别图像中的单个细胞。本步骤使用的关键前期生成文件包括 `p*/phs/*.tif` 和 `p*/phs/bwImages/*.tif`。本步骤生成的关键新文件包括 `p*/phs/textResults/*.csv`，其中包含细胞形态学特征。参见 图10 用于以下步骤的可视化描述，以分割单层中的单个细胞。
      1. 启动 Fiji 软件，然后从 MSM 下拉菜单，选择 分割 - 单细胞s.
      2. 使用文件浏览器对话框，选择包含在规则间距网格点上量化的属性的目录，如 `analysis/p0`、`analysis/p1` 等。
      3. 在 选择输入参数 窗口，指示最大宽高比、细胞中心相对于细胞边界的显著程度，以及两个用于引导细胞检测的模糊参数（补充图 S10).
      4. 在每个位置的图像堆栈上，于最小的正常细胞上绘制一个多边形，用于计算面积。任何小于此多边形的结构将不被软件识别为细胞。
      5. 接下来，在最大的正常细胞周围绘制一个多边形，并指明细胞中心或细胞间界面哪个更亮。
         注意：AnViM 随后会为每一帧生成文件，例如 `phs/textResults/0001.csv`、`phs/textResults/0002.csv` 等，其中包含该帧内细胞的信息。在此阶段，文件中包括有关细胞的形态学信息，如面积、质心、周长、方向、圆度、长宽比、圆整度、实心度以及与无细胞区域的距离。这些属性中的长度单位为像素，角度单位为度。最后，在后续步骤中，该文件将被更新以包含细胞像素强度、运动和受力信息。
   3. 第3部分：细胞上像素强度的映射
      注意：此步骤中的手动输入包括确定数据目录以及选择映射属性和参数。此步骤中使用的关键先前创建的文件包括 `p*/phs/*.tif`（或 `p*/fluo/*.tif`）和 `p*/phs/bwImages/*.tif`。此步骤生成的关键新文件包括 `p*/phs/textResults/*.csv`，该文件列出了细胞形态学特性。参见 图11 用于直观描述以下步骤，以评估单个细胞及其邻近区域所涵盖范围内的像素强度，并将这些强度定义为细胞的属性。
      1. 启动 Fiji 软件，然后从 MSM 下拉菜单，选择 细胞图谱 - 强度.
      2. 使用文件浏览器对话框，选择包含在规则间距网格点上量化得到的属性的目录 `analysis/p0`、`analysis/p1` 等。
      3. 当软件提示时，选择“检测细胞分裂”或“定量细胞荧光”。定义邻近区域的大小，同时勾选“收集邻近区域属性”和“收集细胞属性”选项，然后单击 好的.
      4. 在“记录细胞强度的目的”窗口中，指明用于强度映射的图像类型、邻近区域的大小，以及数据是针对单个细胞采集，还是同时针对细胞及其邻近区域采集补充图 S11).
         注意：对相差图像的像素强度进行映射可实现细胞分裂事件的检测；对荧光图像强度的映射则可用于检测荧光标记的细胞质分子的波动情况。上述步骤的输出结果为单个细胞的像素强度均值、中位数、标准差、最小值和最大值。这些数值将作为新列输入至文件 `phs/textResults/0001.csv`、`phs/textResults/0002.csv` 等中。
   4. 第4部分：细胞受力与运动的映射
      注意：此步骤的手动输入包括确定数据目录，以及选择映射属性和参数。该步骤中使用的关键前期生成文件包括 `p*/phs/textResults/*.csv`、`p*/velocity/*_vel.dat`、`p*/displacement/*_disp.dat`、`p*/traction/*_trac.dat`、`p*/prestress/*_prestress.dat` 和 `p*/phs/bwImages/*.tif`。此步骤不创建新文件，而是将新信息（细胞力和运动特性）添加到文件 `p*/phs/textResults/*.csv` 中。参见 图12 用于直观描述评估单个细胞及其邻近区域所受作用力与运动的步骤，并将这些作用力与运动定义为细胞的属性。
      1. 请选择以下选项 MSM 下拉菜单 细胞运动/力数据映射 (补充图 S12).
      2. 然后，按照步骤 2.4.3 中列出的步骤进行操作。
         注意：新的列将被添加到文件 `phs/textResults/0001.csv`、`phs/textResults/0002.csv` 等中，包含速度的均值、中位数和标准差，速度方向，平均细胞骨架张力，张力各向异性，水凝胶中的应变能，最大张力方向，以及细胞-ECM牵引力的大小补充图 S13).
5. 结果的可视化
   1. 第1部分：实验过程中细胞身份的追踪
      注意：此步骤的手动输入包括确定数据目录和选择要可视化的映射属性。该步骤中使用的关键先前创建的文件包括 `p*/phs/textResults/*.csv`。此步骤生成的关键新文件包括 `p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv`，其中包含细胞数据的时间轨迹。参见 图13 用于直观描述以下步骤，以在整个实验过程中追踪单个细胞的特性。
      1. 启动 Fiji 软件，然后从 MSM 下拉菜单，选择 结果 - 轨迹数据.
      2. 使用文件浏览器对话框，选择包含待追踪细胞特性的位置目录 `analysis/p0`、`analysis/p1` 等。完成后，单击 选择.
      3. 在 选择追踪起始点 窗口中，选择用于监测的起始帧以及同时追踪的帧数（补充图 S14）。始终从第2帧开始，因为无法确定第1帧的速度。完成后，单击 好的.
      4. 在 检查变量以生成轨迹 窗口中，通过键入变量名称或从复选框中选择相应项来选择变量（补充图 S15）。然后，点击 好的.
         注意：追踪过程会生成 `phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv` 文件，其中每一列包含一个唯一的细胞编号，每一连续行代表连续的时间点。
   2. 第2部分：评估的细胞特性时间轨迹的生成
      注意：此步骤的手动输入包括确定数据目录以及选择要可视化的映射属性。该步骤中使用的关键前期生成文件包括 `p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv`。此步骤生成的关键新文件包括 `p*/phs/trackedDataPlots/*.tif`（包含时间轨迹图）和 `p*/phs/trackedDataPlots/*.csv`（包含绘图数据）。参见 图14 用于可视化描述以下步骤，以生成所评估细胞特性的随时间变化轨迹。
      1. 启动 Fiji 软件，然后从 MSM 下拉菜单，选择 结果 - 图表.
      2. 使用文件浏览器对话框，选择包含待绘图追踪细胞属性的目录 `analysis/p0`、`analysis/p1` 等。
      3. 选择是否通过单击来限制绘图仅包含具有完整轨迹的细胞 是 或 无 按钮
         注意：此选项将忽略在一次或多次时间点中未能检测到的细胞。
      4. 选择要同时绘制的变量数量，然后单击 好的.
         注意：目前，AnViM 允许在同一图表中最多显示三个变量。
      5. 使用下拉菜单选择用于绘图的单个变量。
         注意：这些步骤将在 `phs/trackedDataPlots/` 文件夹中生成一个标记图像文件格式（TIFF）文件和一个逗号分隔的数据文件。文件名由变量名组成，变量名之间以下划线分隔，并以细胞编号结尾。
   3. 第3部分：评估的细胞特性热图生成
      注意：此步骤中的手动输入包括确定数据目录和选择要可视化的映射属性。本步骤中使用的关键先前创建的文件包括 `p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv`。本步骤生成的关键新文件包括 `p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif`，即细胞属性的热图。参见 图15 用于可视化描述生成所评估细胞特性的热图的步骤。
      1. 请选择以下选项 MSM 下拉菜单 结果 - 图片.
      2. 按照步骤 2.5.2 中所述的步骤进行操作。
         注意：输出结果以 TIFF 文件格式存储在 `phs/segmentedImages/cellPropMaps/` 文件夹中。文件名由时间点编号和变量名组成，两者之间以下划线分隔。

结果

本文展示了所演示示例的两个关键输出结果。第一个输出是细胞1的细胞运动速度和细胞骨架张力的时间轨迹（图16）。这些参数在共用的纵坐标轴上显示，以便于直观地关联各参数之间的关系，横坐标轴表示时间点序号。本实验中，连续图像帧以15分钟的时间间隔采集。第二个输出是实验进行1小时后的热图阵列（图17）。此处显示的参数包括单个细胞的铺展面积、取向、圆形度、运动速度、运动方向、最大张力取向、细胞骨架张力、基底牵引力以及张力各向异性。

图1：细胞信号整合分析工具包（iTACS）的结构。 iTACS包含两个关键模块：采集与训练模块（AcTrM）和分析与可视化模块（AnViM）。AcTrM可采用现有的多种水凝胶制备技术，以制备能够牢固固定在显微镜载物台上的水凝胶，并结合任意的细胞接种方法及培养方案，使细胞保持在同一焦平面上。AnViM则可采用多种技术对水凝胶和单层细胞的形变、细胞-细胞外基质（ECM）作用力以及细胞-细胞间作用力进行量化。所有用户自定义的力学测量实验步骤均可在iTACS中实现，这些部分以虚线框标出；而以实线框标出的部分则是本研究在细胞力学测量技术上的创新贡献。AnViM中的可视化分析重点关注单个细胞间各项参数的中位数值及其变异性。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：参考图像采集——第一部分。 使用 AcTrM 创建位置列表的步骤。请点击此处查看此图的放大版本。

图3：参考图像采集——第二部分。 使用AcTrM采集参考图像的步骤。步骤2、4和6的详细视图分别见于补充图S2、S3和S4。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：剩余实验的自动图像采集。 恢复图像采集以评估 AcTrM 检测下的细胞行为的步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：设置自动化数据分析。 使用 AnViM 开始自动化图像分析的步骤。步骤 3 和步骤 5 中面板的详细视图分别见补充图 S5和补充图 S6。请点击此处查看该图的放大版本。

图6水凝胶与单层细胞形变的量化——第一部分参与步骤， 通过 AnViM，Tseng Q. 等人发表于 PNAS (2012) 的粒子图像测速法实现方案²⁰ 量化水凝胶顶面的形变。用户还可以在AnViM中采用其他方法来量化水凝胶的形变。步骤3的详细视图如下所示。 补充图 S7. 请点击此处以查看此图的放大版本。

图7水凝胶与单层细胞形变的定量分析——第二部分 参与步骤， 通过 AnViM，即Tseng, Q. 等人在 PNAS (2012) 中实现的粒子图像测速法²⁰ 用于量化单个细胞的局部运动。用户还可以在AnViM中实施其他方法来量化细胞运动。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图8细胞-细胞外基质及细胞-细胞间作用力的定量分析 进行图像分析的步骤以激活 通过 AnViM，即Trepat等人在《自然·物理学》（2009年）中实现的傅里叶变换牵引力显微镜方法¹⁵ 用于量化细胞对水凝胶施加的力，以及Tambe等人在《自然·材料》（2011年）中提出的单层应力显微镜分析方法¹ 用于量化单个细胞内及相邻细胞间的力学作用。用户还可以在AnViM中实施其他方法，以量化细胞-细胞外基质（ECM）及细胞-细胞间的力学作用。步骤6的详细视图如下所示。 补充图 S8 和 补充图 S9. 请点击此处以查看该图的放大版本。

图9：在单个细胞上映射网格点数值——第一部分。 使用一种新颖的多角度方法对包含细胞的图像区域进行分割的步骤。该方法可用于对相位差、明场或荧光细胞图像进行分割。请点击此处查看该图的放大版本。

图10：在单个细胞上映射网格点数值——第二部分。 使用AnViM中开发的一种新型多策略方法对单层细胞进行单个细胞分割的步骤。该方法可用于分割细胞的相差、明场或荧光图像。步骤2的详细视图见补充图S10。请点击此处查看该图的放大版本。

图11：在单个细胞上映射网格点数值——第3部分。 使用AnViM评估单个细胞内部区域及其邻近区域像素强度的步骤。所评估的强度包括透射光强度和荧光强度。本部分映射单个细胞内部以及单个细胞邻近区域内像素强度的中位数和标准差。步骤2的详细视图见补充图S11。请点击此处查看该图的放大版本。

图 12：在单个细胞上绘制网格点数值——第 4 部分。 使用 AnViM 评估单个细胞内部及其邻近区域内网格点的力和运动特性的步骤。本部分绘制单个细胞内部及其邻近区域内特性的中位数和标准差。步骤 2 和步骤 3 的详细视图见补充图 S12和补充图 S13。请点击此处查看该图的放大版本。

图 13：结果可视化 — 第一部分。 使用 AnViM 在整个实验过程中追踪单个细胞特性的步骤。步骤 2 和步骤 3 的详细视图见补充图 S14 和补充图 S15。请点击此处查看该图的放大版本。

图 14：结果可视化——第二部分。 使用 AnViM 生成所评估性质的时间轨迹的步骤。用户可选择在一张图中绘制最多三种性质。时间轨迹可针对所有细胞生成，也可仅针对在整个实验过程中成功追踪的细胞生成。步骤 5 的详细视图见补充图 S16和补充图 S17。请点击此处查看此图的放大版本。

图15：结果可视化——第3部分。 使用AnViM生成所评估属性热图的步骤。热图将针对起始帧之后的所有帧以及所有选定的属性生成。步骤3的详细视图见补充图S18。请点击此处查看该图的放大版本。

图16：细胞编号1的时间轨迹。 图中显示的两个参数分别为细胞骨架张力（“avgtenMedian”）和细胞运动速度（“speedMedian”）。细胞骨架张力和细胞速度均以细胞内网格点上的中位数值进行量化。这两个参数在同一坐标轴上以任意单位绘制，以便可视化所评估参数之间的关系。其他变量名称详见补充表S1。请点击此处查看该图的放大版本。

图17：分析单层中各个细胞特性的热图。 每个细胞的颜色代表该面板所示特性的中位数值。因此，在颜色谱中深红色表示细胞的最大值，深蓝色表示分析单层中细胞的最小值。如Tambe等在PLoS One (2013)²中所述，靠近边界的细胞其力学受图像外部细胞未知特性的影响。因此，热图仅针对远离边界的细胞生成。 请点击此处查看该图的放大版本。

图S1：顶部和底部荧光微球的样本图像。 请点击此处下载该文件。

图S2：图3中步骤2的详细视图。 请点击此处下载此文件。

图S3：图3中步骤4的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S4 A：图3中步骤6的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S5：图5中步骤3的详细视图。 请点击此处下载此文件。

图S6：图5中步骤5的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S7：图6中步骤3的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S8：图8中第6步的细胞-ECM力输出的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S9：图8中第6步的细胞间作用力输出的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S10：图10中步骤2的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S11：图11中步骤2的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S12：图12中步骤2的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S13：图12中步骤3输出的详细视图。请点击此处下载此文件。

图S14：图13中步骤2的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S15：图13中步骤3的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S16：来自图14中步骤5生成的数据文件的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S17：来自图14第5步生成图表的详细视图。 请点击此处下载该文件。

图S18：热图的详细视图以及在图15的步骤4中生成的颜色光谱范围文件。 请点击此处下载该文件。

表 S1：iTACS 量化的部分属性列表。 请点击此处下载该表格。

讨论

贴壁细胞利用机械信号和化学信号来存活、生长并发挥功能。多种显微成像软件通过基于荧光的成像技术优化了用户评估化学信号的体验。然而，对机械信号的评估需要具备标准显微软件中通常不具备的功能。此外，当数据采集与数据分析相整合时，机械信号的评估效率最高。长期以来，实验细胞生物学领域缺乏一个能够满足机械信号评估特殊需求的统一平台，这构成了重大的技术空白。细胞信号整合分析工具包（Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals, iTACS）正是为填补这一空白而设计的。iTACS 包含两个组件：AnViM 和 AcTrM，为用户提供了量化贴壁细胞四大类特性的必要功能：力、运动、形态以及荧光/亮度。在这四类特性中，iTACS 目前已能揭示单个贴壁细胞超过 50 种独特的属性。这些属性涵盖每一类别的具体特征，包括其在细胞内的代表性数值及空间变异性（补充表 S1）。例如，在“力”这一类别中，包括细胞骨架内的张应力、张应力的各向异性、最大张力的方向，以及在细胞-细胞外基质（ECM）界面处对贴壁细胞行为具有深远影响的剪切应力^1,3,6。

一种研究单层细胞中单个细胞力学行为的新方法
单层中的单个细胞会进行化学和力学性质信号的交换³。这两类信号在细胞单层中的传递方式不同²³。然而，相较于化学信号传递，人们对力学信号传递的理解仍较为滞后。这一知识空白也反映出长期以来缺乏简单直观的方法来评估细胞力学信号。本文所描述的新型数据映射方法能够有效填补这一空白。该映射方法揭示，细胞邻近区域固有细胞骨架张力的波动可作为松弛、流体化和锚定信号，调控细胞形态、大小以及运动速度的变化¹⁸。邻近区域特性的图谱呈现出"多细胞亚区"模式，其中亚区内部的细胞处于相对均一的微环境中，而位于亚区边界的细胞则处于显著不均一的微环境中¹⁸。

力测量技术的可及性
已有多种实验方案可用于制备PAA水凝胶、分析水凝胶形变与细胞运动，并量化细胞-ECM及细胞间作用力^{1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27,28,29,30,31,32}。然而，这些技术进展仍难以被普通细胞生物学实验室所掌握，仅局限于具备工程学专长的实验室中应用。通过自动化这些方法的技术环节，并将其整合于一个统一且用户友好的平台，iTACS的目标是使机械信号的检测成为实验细胞生物学研究与教学中的常规操作。

ImageJ 允许用户采用几乎无需或仅需少量培训的方法来开发应用程序¹¹。iTACS 主要通过简单的脚本方法构建，以促进社区驱动的持续开发。AcTrM 的大部分功能使用 BeanShell 脚本编程实现，而 AnViM 的大部分功能则使用 ImageJ 宏编程实现。这些脚本以及在用户显微镜上实现这些功能的指导说明均可通过 GitHub 获取（https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS）。

所获取图像的质量标准化
尽管基于弹性基底的技术已被多个实验室开发并用于量化贴壁细胞中的物理力，但该实验方案仍缺乏标准化。其中最需要标准化的环节之一是所获取的顶层微珠图像的质量（补充图 S1）。实验过程中焦点漂移会引发严重问题。我们提出的基于参考图像的重新对焦方法，使这一对焦过程成为客观可衡量的操作。AcTrM 流程的第一步中定义的参数，设定了必要的客观质量阈值。其他标准化措施可在 AcTrM 的未来版本中编程实现。

iTACS 的广泛应用性
除了能够量化贴壁细胞的多种特性外，iTACS 的结构还使其适用于各种实验方案和需求。AcTrM 可实现由软件引导的用户自助训练。对于需要高速成像的应用，例如同时评估细胞质钙离子波动，目前受限于重新定位和重新对焦硬件的速度，因此最好一次只在一个位置进行。然而，当前的系统已充分具备支持长期成像和间断式成像的能力，后者适用于样本无法在整个实验过程中持续保留在显微镜载物台上的情况。由于参考图像在实验开始时即被采集，iTACS 能够实现实时机械信号成像，为药物筛选应用开辟了新的途径。AnViM 可帮助用户以通俗易懂的方式提供高度技术性的信息。能够量化广泛的细胞特性并全程追踪这些参数，是发现新型细胞间通讯机制所必需的关键能力。

对于iTACS的未来发展，我们确定了四个重点方向：（1）提升数据采集与数据分析速度；（2）建立用于评估新细胞信号的方法¹³；（3）开发基于iTACS的细胞信号评估培训课程与教育模块；（4）开发低成本自动化解决方案。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于制备用于水凝胶包被的玻璃表面的试剂和组分
(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷，97%	Aldrich Chemistry	13822565
2% 双丙烯酰胺溶液	Bio-Rad	1610142
3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯，98%	Acros Organics	2530850
40% 丙烯酰胺溶液	Bio-Rad	1610140
玻璃底 35 mm 培养皿 / 6 孔、12 孔或 24 孔板	MatTek 或 CellVis
戊二醛，电镜级，25%	Polysciences	1909100
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	1002074706
用于制备合适水凝胶的试剂和组分
2% 双丙烯酰胺溶液	Bio-Rad	1610142
40% 丙烯酰胺溶液	Bio-Rad	1610140
过硫酸铵	Bio-Rad	1610700
盖玻片	Electron Microscopy Sciences	7222301
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（1 M）	Gibco	14190136
FluoSpheres 羧基 0.2 µm，黄绿色（505/515）	Invitrogen	F8811
FluoSpheres 羧基 0.5 µm，红色（580/605）	Invitrogen	F8812
FluoSpheres 羧基 2.0 µm，红色（580/605）	Invitrogen	F8826
Rain-X
TEMED	Bio-Rad	1610801
用于在水凝胶上包被细胞外基质的试剂
Ⅰ型胶原蛋白（大鼠尾来源）	Corning	354236
HEPES（1 M）	Gibco	15630080
磷酸盐缓冲液（1 M）	Gibco	10010023
Sulfo-SANPAH	CovaChem	102568434
本研究中使用的显微镜硬件
相机	Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS 相机	C11440-42U
H117 ProScanTM 载物台	Prior Scientific
光源 - Lambda DG4 和 Lambda DG5	Sutter Instrument Company
显微镜	Nikon Eclipse TE2000-S	550372
ProScan III 通用显微镜自动化控制器	Prior Scientific
载物台式培养箱	ibidi	11922
步进电机聚焦驱动器	Prior Scientific