本文介绍了利用基于化学发光的高灵敏度检测方法来检测一氧化氮及其生物学相关衍生物的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
一氧化氮（NO）活性 体内 是其直接作用、由NO自氧化生成的衍生物的作用以及亚硝基化化合物效应的综合结果。测量NO代谢物对于研究NO在血管水平及其他组织中的活性至关重要，尤其是在给予外源性NO的实验条件下。基于臭氧的化学发光检测法能够精确测定液体（包括血浆、组织匀浆、细胞培养物）和气体混合物（如呼出气体）中的NO及其代谢物。NO与臭氧反应生成处于激发态的二氧化氮，随后释放的光信号可通过光探测器检测，并转化为反映样品中NO含量的电信号。同一样品的不同等分试样可用于测定特定的NO代谢物，如硝酸盐、亚硝酸盐、S-亚硝基硫醇和铁-亚硝酰复合物。此外，无细胞血红蛋白消耗的NO也可通过化学发光分析进行定量。本文对上述所有技术进行了图示说明。
引言
自从 Salvador Moncada 以及诺贝尔奖得主 Robert Furchgott、Louis Ignarro 和 Ferid Murad 确定一氧化氮（NO）即先前已知的内皮源性舒张因子（EDRF）以来，NO 在血管生物学、神经科学、代谢以及宿主反应等多个关键机制中的核心作用已被确立1,2,3,4,5,6,7。外源性给予 NO 气体已成为治疗新生儿因肺动脉高压导致呼吸衰竭的成熟疗法8。一氧化氮气体还被研究用于呼吸道合胞病毒（RSV）感染、疟疾及其他感染性疾病、缺血-再灌注损伤的治疗，以及用于接受心脏手术患者急性肾损伤的预防9,10,11,12。由于机制研究和干预....
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方案
本方案中所述操作均符合麻省总医院审查委员会的规定。所使用的血样是在先前的一项研究中采集的，且针对当前研究目的已去除身份标识18。
注意：有关构成吹扫瓶的管路与玻璃器皿之间的最佳连接、清洗及常规维护的具体指导，请参阅制造商的说明书。连接必须牢固，并小心操作以避免损坏玻璃器皿。识别玻璃吹扫瓶的各个组件：气体入口管路、带加热套和冷凝器的吹扫瓶、氢氧化钠（NaOH）气体鼓泡阱、吹扫瓶与鼓泡阱之间的连接管路、通往化学发光检测器（CLD）的吹扫瓶出口气体管路，该管路配备强场介电（IFD）过滤器。每次测定液态样品中的NO代谢物（血浆、细胞培养物、组织匀浆）时（本方案中所有检测均属此类），必须在吹扫瓶与CLD样品入口之间安装IFD过滤器管路。样品制备取决于所分析的体液或组织类型以及目标化合物。分析前阶段的重要事项在第1和第2节中予以说明。特定检测的专门样品处理步骤见第3至第5节。第6至第8节适用于所有检测。
1. 专用试剂的制备
注意：更多细节请参见先前的出版物15,22。
- 制备用于去除 NO2- 的 5%（....
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结果
在含有已知浓度无细胞氧合血红蛋白的样本中，采用无细胞血红蛋白（Hb）消耗一氧化氮（NO）的检测方法（图4）。由于在该检测中，每摩尔氧合血红蛋白的血红素可按化学计量关系释放一摩尔NO分子，因此使用纯化的无细胞氧合血红蛋白建立该检测的校准曲线（补充图3）。
在心脏手术中脱离体外循环（CPB）的患者中，游离血红蛋白（通过比色法测定）与一氧化氮（NO）消耗之间的剂量-反应关系如图5所示。可以认为，在脱离CPB后，游离血红蛋白中处于Hb-Fe2+-O2状态的血红素基团浓度较高（图5，红色曲线），相比之下，在CPB期间接受NO治疗的患者中，仅有少数游离血红蛋白的血红素基团消耗NO（图5，绿色曲线）。
用于评估无细胞血红蛋白（H.......
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讨论
由于灵敏度较高，基于化学发光的NO及相关化合物检测方法存在较高的NO2-污染风险。实验中使用的每种试剂（尤其是NO2-阻断液）和稀释液（包括ddH2O）均应检测其NO2-含量，以校正背景信号。亚硝酸盐在全血中的半衰期约为10分钟，具有极高的反应活性，并迅速生成NO3-。因此，采血与离心或NO2-阻断之间的时间间隔可能导致分析前误差，应尽可能缩短15。在使用血浆样本的检测中，建议将血液采集至肝素抗凝管中，在加入40 μL由250 mg NEM溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）配制而成的200 nM NEM溶液封闭巯基后，于4 °C以750 × g离心5分钟。该储备液可保存于4 °C。某些抑制一氧化氮合酶（NOS）的化合物，如硝基精氨酸、硝普钠和硝酸甘油，会缓慢且非定量地转化为NO，导致基线升高。如果研究中需使用NOS抑制剂，建议选用不.......
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披露
L.B. 作为溶血和一氧化氮研究项目的首席研究员，获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI NIH）K23 HL128882项目的薪金支持。L.B. 还获得乔治梅森大学莫卡特斯中心“新冠研究快速资助”（Fast Grants for COVID-19 research）以及iNO Therapeutics LLC公司提供的资助。B.Y. 获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI）#R21HL130956项目以及美国国防部/日内瓦基金会（DOD/The Geneva Foundation，项目编号：W81XWH-19-S-CCC1，日志编号：DM190244）的资助。B.Y. 在麻省总医院（MGH）获得有关一氧化氮电化学生成技术的专利。
L.B. 和 B.Y. 已为一氧化氮递送在 COVID-19 疾病中的应用提交专利申请，PCT 申请号：PCT/US2021/036269，申请日期为 2021 年 6 月 7 日。RWC 作为技术开发项目的首席研究员，从 Unitaid 获得薪资支持，该项目旨在为资源匮乏地区儿童的结核病分散式诊断提供技术支持。
致谢
本手稿中报告的实验方案得益于马萨诸塞州总医院麻醉科重症监护麻醉研究实验室Warren Zapol博士实验室此前多位研究员的累积贡献。我们感谢Akito Nakagawa、Francesco Zadek、Emanuele Vassena、Chong Lei、Yasuko Nagasaka、Ester Spagnolli和Emanuele Rezoagli博士所做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Sigma | 45754 | 500 mL - 液体 |
| 抗泡沫剂B乳液 | Sigma | A5757 | 250 mL - 液体 |
| DETA NONOate | Cayman | 82120 | 10 mg |
| Gibco DPBS (1x)，无钙，无镁 | ThermoFisher | 14190144 | 500 mL |
| 盐酸 37% (1 M) | Sigma | 258148 | 500 mL - 液体 |
| 碘 | SAFC | 207772 | 100 g - 固体 |
| Kimwipes | Kimtech | 34155 | |
| 氯化汞(II) ACS级试剂> 99.5% | Sigma | 215465 | 100 g - 固体（溶于水） |
| Mili-Q 水纯化系统 | Millipore | ||
| Model 705 RN 50 μL 注射器 | Hamilton | 80530 | 微量注射器 |
| Model 802 N 25 μL 注射器 | Hamilton | 84854 | 微量注射器 |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma | 4260 | 25 g - 晶体 |
| 一氧化氮分析仪 + 套件软件 - 吹扫容器 | Zysense | NOA 280i | 化学发光检测器 |
| Nonidet p-40 (NP-40) | ThermoFisher | 85125 | 10% - 500 mL |
| 六氰合铁酸钾(III) ACS级试剂≥ 99% | Sigma | 244023 | 100 g - 粉末 |
| 碘化钾 ACS级试剂> 99% | Sigma | 221945 | 100 g - 固体 |
| 硝酸钾晶体 分析纯 EMSURE ACS | Supelco | 105067 | 250 g - 晶体 |
| PowerGen 125 | Fisher Scientific | 14-359-251 | 机械匀浆器 |
| RV3 双级旋片泵 | Edwards | A65201906 | 真空泵 - 与分析仪配套 |
| 肝素钠 - BD Hemogard Clo | BD Biosciences | BD367871 | 75 USP 单位 |
| 氢氧化钠无水 ACS级试剂 ≥ 97% | Sigma | 795429 | 1 kg - 颗粒 |
| 硝酸钠 ACS级试剂 ≥ 99% | Sigma | 221341 | 500 g - 粉末 |
| 亚硝酸钠 ≥ 99% | Sigma | S2252 | 500 g - 晶体 |
| 磺胺 ≥ 98% | Sigma | S9251 | 100 g - 固体 |
| 氯化钒(III) | Sigma | 112393 | 25 g - 固体 - 注意（放热） |
| Whatman 1 号滤纸 | Sigma | WHA10010155 |
参考文献
- Palmer, R. M. J., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
- Furchgott, R. F.
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