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方法文章

基于化学发光的检测方法用于检测一氧化氮及其自氧化和亚硝化化合物衍生物

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DOI：

10.3791/63107

⸱

2022年2月16日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia, Critical Care and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Department of Pediatrics, Massachusetts General Hospital, 3Harvard Medical School

本文内容

摘要

本文介绍了利用基于化学发光的高灵敏度检测方法来检测一氧化氮及其生物学相关衍生物的实验方案。

摘要

一氧化氮（NO）活性 体内 是其直接作用、由NO自氧化生成的衍生物的作用以及亚硝基化化合物效应的综合结果。测量NO代谢物对于研究NO在血管水平及其他组织中的活性至关重要，尤其是在给予外源性NO的实验条件下。基于臭氧的化学发光检测法能够精确测定液体（包括血浆、组织匀浆、细胞培养物）和气体混合物（如呼出气体）中的NO及其代谢物。NO与臭氧反应生成处于激发态的二氧化氮，随后释放的光信号可通过光探测器检测，并转化为反映样品中NO含量的电信号。同一样品的不同等分试样可用于测定特定的NO代谢物，如硝酸盐、亚硝酸盐、S-亚硝基硫醇和铁-亚硝酰复合物。此外，无细胞血红蛋白消耗的NO也可通过化学发光分析进行定量。本文对上述所有技术进行了图示说明。

引言

自从 Salvador Moncada 以及诺贝尔奖得主 Robert Furchgott、Louis Ignarro 和 Ferid Murad 确定一氧化氮（NO）即先前已知的内皮源性舒张因子（EDRF）以来，NO 在血管生物学、神经科学、代谢以及宿主反应等多个关键机制中的核心作用已被确立1,2,3,4,5,6,7。外源性给予 NO 气体已成为治疗新生儿因肺动脉高压导致呼吸衰竭的成熟疗法8。一氧化氮气体还被研究用于呼吸道合胞病毒（RSV）感染、疟疾及其他感染性疾病、缺血-再灌注损伤的治疗，以及用于接受心脏手术患者急性肾损伤的预防9,10,11,12。由于机制研究和干预性研究的需要，必须采用精确的检测技术来评估 NO 及其代谢物、靶蛋白和相关化合物的水平。

由于一氧化氮（NO）具有高反应活性，其可能发生的反应取决于其生成和/或释放所处的生物基质。在不存在血红蛋白（Hb）或其他含氧血红素蛋白的情况下，NO 几乎完全被氧化为亚硝酸根（NO2-）。

2NO + O2 → 2NO2

NO2 + NO → N2O3

N2O3 + H2O → NO2- + H+

一氧化氮（NO）首先与分子氧（O2）发生自氧化反应，生成二氧化氮（NO2），并进一步与NO2反应生成三氧化二氮（N2O3）。一个N2O3分子与水（H2O）反应生成两个亚硝酸根离子（NO2-）和一个质子（H+）13。在全血中14,15，NO和NO2-会迅速转化为硝酸根离子（NO3-），因为这些分子可与血红蛋白中的氧化型血红素基团[Hb-Fe2+-O2或氧合血红蛋白（oxyHb）]强烈反应，生成NO3-。该反应同时伴随着血红素基团向高铁状态的转变[Hb-Fe3+或高铁血红蛋白（metHb）]：

Hb-Fe2+-O2 + NO → Hb-Fe3+ + NO3-

红细胞（RBC）屏障以及内皮细胞附近的微环境是限制该反应的主要因素，使得内皮释放的一氧化氮（NO）中有小部分能够发挥内皮源性舒张因子（EDRF）的作用16,17。事实上，循环中的无细胞血红蛋白（Hb）已被证实可在实验和临床条件下破坏血管舒张功能17,18。在红细胞内部，根据氧合状态和NO2-浓度的不同，部分NO会与脱氧血红蛋白（Hb-Fe2+）反应生成亚铁-亚硝酰基血红蛋白（Hb-Fe2+-NO 或 HbNO）：

Hb-Fe2+ + NO → Hb-Fe2+-NO

在红细胞（RBC）15,17中，NO2-可通过还原Hb-Fe2+生成Hb-Fe3+，从而释放NO，而NO又可结合Hb-Fe2+-O2（优先结合）或Hb-Fe2+。

不应将NO衍生物的生成视为严格的单向过程，因为在各种组织中，通过不同酶的作用（例如肠道细菌或线粒体内，尤其在缺氧条件下），NO可以从NO2-和NO3-重新生成19,20。

不同量的一氧化氮（NO）的产生（或施用）会通过硫醇转硝基化反应，主要在亲核试剂存在下由N2O3生成S-亚硝基硫醇，形成NO+供体中间体（Nuc-NO+-NO2-）：

N2O3 + RS- → RS-NO + NO2-

生成S-亚硝基硫醇的另一种可能性是氧化型硫醇的亚硝基化反应（NO与氧化型硫醇反应）：

RS• + NO → RS-NO

该机制以及NO2对巯基的直接氧化作用可能仅在特定条件下发生，相关条件已在其他文献中描述21。S-亚硝基硫醇的种类涵盖从小分子（如S-亚硝基谷胱甘肽）到含巯基的大分子蛋白质。S-亚硝基血红蛋白（S-NO-Hb）是由血红蛋白β链上保守的半胱氨酸残基（β93C）的巯基发生亚硝基化反应而形成的22。

S-亚硝基硫醇的生成与代谢是重要调控机制的组成部分，例如对谷胱甘肽、半胱天冬酶、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和雷诺丁受体的调控23,24,25,26,27,28曾被认为是体内一氧化氮（NO）生物学作用的主要介质，亚硝基化白蛋白（S-硝基-白蛋白）似乎是一种NO/NO+ 不具有任何特定附加生物学活性的转运蛋白29.

在测定特定生物样本于生物基质中释放的一氧化氮（NO）及其衍生物浓度时，需考虑酸度、氧合状态、温度以及试剂存在的特性。示例包括外源性给予的NO供体，以及在急性炎症情况下存在的过氧化氢（H₂O₂）。2O2) 与一氧化氮（NO）反应2 导致过氧亚硝酸盐（ONOO⁻）等自由基的超常浓度生成-)21除了所采用的分析方法外，样本制备与储存的分析前阶段也至关重要。无法真实反映样本原始状态的下游反应 体内 不应预测、考虑或阻断NO活性。一个合理的例子是S-NO-Hb的不稳定性，在针对其进行测定时，需要对血液样本采取专门的处理方法。22.

基于化学发光的检测方法是检测一氧化氮（NO）及其主要代谢物水平的金标准[NO2-，一氧化氮3-，S-亚硝基化合物和亚硝酰铁复合物（Fe-NO）] 在包括组织匀浆在内的任何生物流体中30,31. 这些方法依赖于化学发光检测器（CLD），该装置用于容纳一氧化氮（NO）与臭氧（O₃）之间的反应3），生成一氧化氮（NO）2 激发态（NO2•）一氧化氮的松弛作用2• 产生一个光子，该光子被光电倍增管检测到，生成一个与采样气体混合物中一氧化氮含量成正比的电信号32CLD 的简化示意图如图所示。

化学发光检测示意图，显示NO与O₃的反应；光电倍增管装置。
图1：一氧化氮气体化学发光检测仪的简化示意图。 基于化学发光法检测一氧化氮（NO）的原理是，每进入化学发光检测器（CLD）的一个NO气体分子，会按化学计量关系产生一个光子。该化学发光反应在专用反应室中进行，反应室由内置臭氧发生器提供臭氧（O₃），并通过连接外部泵使反应室保持负压，从而实现样品气体的持续稳定流入。O₃的生成3 需要双原子氧（O₂）2）由专用的 O 供应2 与CLD相连的气罐（其他制造商提供的CLD可在环境空气下运行）。在反应室内，采样气体中含有的每个NO分子与氧气反应，生成一个处于激活态的二氧化氮分子（NO2*). 通过返回其基态，每个NO2* 分子释放一个光子，该光子由位于反应室旁边的光电倍增管（PMT）检测。PMT 与配套的放大器和中央处理单元产生一个与光子计数及反应室中 NO 分子数量成正比的信号。 请点击此处以查看此图的放大版本。

化学发光检测器（CLD）的样品入口可连接至含有液体样品反应室的玻璃装置系统。该系统持续用惰性气体（如氮气、氦气或氩气）吹扫，将一氧化氮（NO）从反应室转移至CLD。液相样品通过专用膜注入吹扫容器中。

化学气体系统示意图，显示吹扫装置、NaOH 洗气瓶和气体流动设置。
图 2：用于基于化学发光法检测一氧化氮气体的吹扫装置结构 吹扫装置（右侧）可用于检测一氧化氮（NO）气体，或任何在从液相试剂释放后可轻易转化为 NO 气体的化合物。惰性气体入口连接至惰性气体源（气瓶），如氩气、氙气或双原子氮气（N2）。针阀（向左打开）用于控制吹扫装置内的压力，必要时可完全拆卸以清洗装置。进样口由带隔膜垫的盖子密封，用于样品注入，隔膜应经常更换。加热套包裹反应室，并连接至热水浴，以进行 VCl3 在 HCl 中的测定。吹扫装置出口连接至化学发光检测器（CLD）或 NaOH 洗气瓶（VCl3 在 HCl 测定中必需使用）。要排空反应室内容物，首先关闭惰性气体入口和吹扫装置出口的旋塞，关闭针阀，取下进样口的盖子，最后打开排液口的旋塞。当进行 VCl3 在 HCl 中的测定时，由于 HCl 具有腐蚀性，必须在吹扫装置与 CLD 之间串联安装 NaOH 洗气瓶（左侧）。CLD 的连接处始终需要在 CLD 与吹扫装置出口（或所用的 NaOH 洗气瓶出口）之间安装强场介电（IFD）过滤器。IFD 过滤器可去除空气中的颗粒物，并阻止液体通过吹扫装置。PTFE = 聚四氟乙烯。 请点击此处查看该图的放大版本。

因此，任何能够通过特定且可控的化学反应转化为NO的化合物，均可在各种生物液体和组织匀浆中被高灵敏度地检测到24。气相NO的直接测定可通过化学发光法在实验和临床环境中进行。这些技术在其他文献中已有详尽描述33,34,35。通过将样品加入含三碘化物（I3-）的反应体系中，可测定NO2-、S-亚硝基硫醇、S-亚硝基化蛋白以及Fe-NO复合物，该反应可按化学计量关系从上述所有化合物中释放出NO气体：

I3- → I2 + I-

2NO2− +2I− +4H+ → 2NO + I2 +2H2O

I3− + 2RS-NO → 3I− + RSSR + 2NO+

2NO+ + 2I− → 2NO + I2

而 I3- 不与 NO3- 发生反应15。通过使用酸化磺胺（AS）有或无氯化汞（HgCl2）对样品等分试样进行预处理，可实现对每种化合物的精确定量。具体而言，使用 AS 预处理可去除所有 NO2- 含量。因此，化学发光检测器（CLD）测得的 NO 含量仅反映 S-NOs 与 Fe-NOs 浓度的总和。在加入 AS 前，向样品等分试样中注入 HgCl2，可使 S-NO 释放出 NO2-。随后经 AS 处理（导致 NO2- 被去除），可确保所测得的 NO 含量仅反映 Fe-NOs 的浓度。通过对各测定结果进行一系列差值计算，即可精确得出三种 NO 衍生物的浓度22。

静态平衡图；化学分析方法；流程图；NO₂⁻、S-NOs、Fe-NOs 分析。
图 3：乙酸中 I3- 化学发光法样品制备步骤。 图示为乙酸中 I3- 化学发光法的逐步样品制备流程。必须使用避光离心管。试管 1、2 和 3 用于本分析法的样品准备。若需测定硝酸盐（NO3-），则需另取一份样品（试管 4）用于 HCl 中 VCl3 分析法。步骤以红色数字标示。在加入样品前，按指示预先加入磷酸盐缓冲液（PBS）或 HgCl2（步骤 1）。按指示加入样品体积（2），涡旋混匀，并在室温（RT）孵育 2 分钟。按指示加入 PBS 或酸化磺胺（AS）（3），涡旋混匀，并在室温孵育 3 分钟。进行检测（4）。该检测所测得的浓度为各试管下所列化合物浓度的总和。试管 1 可同时检测亚硝酸盐（NO2-）、S-亚硝基硫醇（S-NO）和铁-亚硝基复合物（Fe-NOs）的信号。为测定硝酸盐（NO3-），样品需同时进行乙酸中 I3- 和 HCl 中 VCl3 两种检测，试管 4 测得的数值应减去试管 1 的数值。*建议用于血红蛋白分析以测定残留 NO2-、S-亚硝基血红蛋白和铁-亚硝基血红蛋白的用量。 请点击此处查看此图的放大版本。

对于硝酸根（NO3-）的测定，使用盐酸（HCl）中的三氯化钒（VCl3）在吹扫容器中将 NO3- 转化为 NO，以便通过化学发光检测器（CLD）对 NO3- 进行化学计量测定：

2 NO3- + 3V+3 + 2H2O → 2NO + 3VO2+ + 4H+

为了实现足够快的转化速率，反应需在90-95 °C下进行。NO3-还原为NO2-的过程与HCl存在下NO2-进一步还原为NO的过程相偶联。金属钒也可还原S-亚硝基化合物，释放其NO基团22,36。使用HCl中的VCl3通过CLD测得的最终浓度反映了NO3-、NO2及其他亚硝基化化合物的总浓度。将该值从I3-存在下CLD测得的浓度中减去，即可计算出NO3-的浓度36,37（图3）。

在NO消耗测定实验中，NO供体如(Z)-1-[2-(2-氨基乙基)-N-(2-铵乙基)氨基]重氮-1-烯-1,2-二醇盐（DETA-NONOate）在吹扫装置中持续释放NO，产生稳定信号，可用于定量注射样品中的无细胞氧合血红蛋白（oxyHb）。吹扫装置中消耗的NO量与样品中oxyHb的量之间存在化学计量关系38。

本文展示了在血浆样本中测定NO2-、NO3-、S-亚硝基硫醇、铁-亚硝酰基复合物以及无细胞血红蛋白对NO消耗的实验方案。针对红细胞环境中NO的研究，需要特定的样品处理，并结合排阻色谱法来测定极为不稳定的S-NO-Hb和Hb-NO，同时测定总血红蛋白浓度15,22。样品制备对于校正测定结果至关重要。H2O中NO2-的预先存在以及在检测过程中NO2-的释放，可能导致S-NO-Hb等NO衍生物的浓度被高估14,39。本文还介绍了样品制备中的关键要点。

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方案

本方案中所述操作均符合麻省总医院审查委员会的规定。所使用的血样是在先前的一项研究中采集的，且针对当前研究目的已去除身份标识18。

注意：有关构成吹扫瓶的管路与玻璃器皿之间的最佳连接、清洗及常规维护的具体指导，请参阅制造商的说明书。连接必须牢固，并小心操作以避免损坏玻璃器皿。识别玻璃吹扫瓶的各个组件：气体入口管路、带加热套和冷凝器的吹扫瓶、氢氧化钠（NaOH）气体鼓泡阱、吹扫瓶与鼓泡阱之间的连接管路、通往化学发光检测器（CLD）的吹扫瓶出口气体管路，该管路配备强场介电（IFD）过滤器。每次测定液态样品中的NO代谢物（血浆、细胞培养物、组织匀浆）时（本方案中所有检测均属此类），必须在吹扫瓶与CLD样品入口之间安装IFD过滤器管路。样品制备取决于所分析的体液或组织类型以及目标化合物。分析前阶段的重要事项在第1和第2节中予以说明。特定检测的专门样品处理步骤见第3至第5节。第6至第8节适用于所有检测。

1. 专用试剂的制备

注意：更多细节请参见先前的出版物15,22。

  1. 制备用于去除 NO2- 的 5%（290 mM）酸化磺胺（AS）溶液：将 500 mg 磺胺溶解于 10 mL 1N HCl 中。该溶液可稳定保存数月。
  2. 制备用于从 S-NOs 释放 NO2- 的 50 mM 氯化汞（HgCl2）溶液：将 67.9 mg HgCl2 溶解于 5 mL PBS 中。避光保存储备液。
  3. 制备 NO2- 阻断溶液，其中含 800 mM 铁氰化钾 [K3Fe(CN)6] 用于氧化血红蛋白，同时加入 100 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）以封闭巯基，并可选加入 10% 辛基苯基-聚乙二醇溶液（Nonidet p-40）以溶解红细胞膜。
    1. 将 K3Fe(CN)6 加入去离子蒸馏水（ddH2O，每升加入 263.5 g 粉末），配制成终浓度为 800 mM 的溶液。
    2. 将 NEM 加入上述 800 mM K3Fe(CN)6 的 ddH2O 溶液中（每升加入 12.5 g 粉末，使终浓度为 100 mM），混匀至所有晶体完全溶解。
    3. 将一份 10% NP-40 溶液与九份 800 mM K3Fe(CN)6 和 100 mM NEM 混合溶液混合（每升混合液中加入 111 mL），充分混匀（全血分析时此步骤为必需）。
  4. 使用储备液配制含 12 mM K3Fe(CN)6、10 mM NEM、100 µM 二乙烯三胺五乙酸（DTPA，用于金属螯合）和 1% Nonidet p-40 去垢剂的 S-NO-Hb 稳定溶液。
    1. 通过将 NEM 晶体加入 PBS（25 mg/mL，例如 250 mg 加入 10 mL PBS）中配制 200 mM NEM 溶液，搅拌至所有晶体完全溶解（需在实验当天配制）。
    2. 通过将 K3Fe(CN)6 加入 ddH2O 中（263.5 mg/mL，例如 1.32 g 加入 5 mL ddH2O）配制 800 mM K3Fe(CN)6 溶液，以获得终浓度 800 mM（需在实验当天配制）。
    3. 将 786 mg DTPA 加入 200 mL ddH2O 中，用 5N NaOH 调节 pH 至 7.0，以充分溶解 DTPA，制成 10 mM DTPA 储备液。
    4. 将 5 mL 200 mM NEM 溶液、1.5 mL 800 mM K3Fe(CN)6 溶液和 1 mL DTPA 储备液加入 81.5 mL pH 7.2 的 PBS 中，最后加入 11 mL 10% NP-40，定容至 100 mL。

2. 样本采集

注意：有关样本采集的更多细节，请参考先前已发表的研究15,22,40。

  1. 采集全血
    1. 使用肝素包被的采血管采集血液，优先选择静脉而非动脉（除非有特殊要求），并优先采用导管置入而非静脉穿刺（如可行），导管或针头内径应至少为20 G或更大，以最大限度减少溶血。
    2. 立即加入NO2-阻断溶液（按1份溶液与4份全血的比例），随后进行处理（第3或第4节），或冷冻并保存于-80 °C。
  2. 采集血浆和红细胞（RBCs）
    1. 使用肝素包被的采血管采集血液，优先选择静脉血而非动脉血（除非有特殊要求），使用至少20 G或更大的针头以最大限度减少溶血，并立即在4 °C下以4000 × g离心5分钟。
    2. 将上清液（血浆）与NO2-阻断溶液按1份溶液与4份上清液的比例在新试管中混合，随后进行处理（第3或第4节），或冷冻并保存于-80 °C。
      注意：对于一氧化氮消耗测定，不能使用NO2-阻断溶液。该测定可在无需血浆预处理的情况下进行。
    3. 将底部的红细胞沉淀重悬于预先装有S-NO稳定溶液（见步骤1.4）的新试管中（1 mL沉淀加9 mL溶液），孵育5分钟。
    4. 将红细胞裂解物通过已用ddH2O预洗过的G-25 Sephadex凝胶过滤柱，进行凝胶排阻层析。
    5. 收集血红蛋白（Hb）组分用于后续处理（第4节），并使用Drabkin试剂测定Hb浓度（Hb浓度测定方法参见已发表文献22）。
      注意：若需制备和取样特定组织/器官，应先确定其门部，外科分离该组织。切开静脉，穿刺动脉，并通过动脉注入肝素化生理盐水（10 U/mL）。当静脉切口处开始出现回流时，切除该组织。在机械匀浆器中匀浆组织，同时按1份NO2- 阻断溶液与4份匀浆组织的比例加入溶液。

3. HCl 中 VCl3 检测液的配制

注意：有关 HCl 中 VCl3 测定法的制备细节，请参阅先前已发表的研究37,41。

警告：进行此检测时，若未正确安装 NaOH 捕集装置，CLD 将会被损坏。原因是 HCl 具有腐蚀性。

  1. 制备NO标准溶液3- 标准曲线用
    1. 溶解85 mg NaNO₂于10 mL去离子水中。3 在10 mL ddH₂O中2O 以获得 0.1 M NaNO3- （该溶液可保持数周稳定）。
    2. 使用母液通过ddH₂O稀释配制标准品2O 以获得 5 µM、10 µM、20 µM、40 µM、80 µM、200 µM 的 NaNO 浓度3 为了对血浆或尿液样本进行标准曲线测定（若处理细胞培养物，则使用较低浓度）。
  2. 制备 VCl3 （氯化钒）饱和溶液用于一氧化氮3-​ 吹扫容器中的减少
    警告：水与 VCl 的反应3 是放热反应。加入酸以及实验结束时清洗玻璃器皿时，需注意玻璃器皿温度较高。
    1. 溶解1.6 g VCl3 在200 mL 1 M HCl中，首先加入VCl3 在洁净的烧瓶中，然后加入200 mL 1 M HCl。
    2. 通过滤纸（例如 11 μm 滤纸，但可使用任何类型的滤纸）对溶液进行真空过滤。
      注意：滤过的溶液应变为澄清的蓝色，而未过滤的 VCl3 溶液是 由于未溶解的颗粒而呈棕色。
    3. 该化合物对光敏感，需用铝箔或聚四氟乙烯（PTFE）胶带覆盖饱和溶液。
  3. 准备循环水浴
    1. 将循环水浴装置连接至吹扫容器的水夹套。在启动前，确保管路干燥。
    2. 将水浴锅温度设为 95 °C 并开始加热，通过在水管周围使用（非粘性）纸巾检查水管是否漏水。
  4. 设置气体鼓泡器捕集装置
    1. 确认起泡器的聚四氟乙烯套管已安装到位且无损坏。
    2. 打开气体鼓泡器，向鼓泡器底部注入15 mL 1 M NaOH溶液。
    3. 重新放置气体鼓泡器，并通过将底部向上推并轻微扭转两部分来紧密密封连接处。若不施加外力则无法转动鼓泡器顶部，表明密封正确。
    4. 将吹扫容器的出口连接至气体鼓泡阱的入口。

4. 碘乙酸溶液中 I3- 的测定准备

注意：有关乙酸中 I3- 测定的制备细节，请参考先前发表的研究15,22,38,41,42。

  1. 制备NO标准曲线2-
    1. 通过将69 mg亚硝酸钠（NaNO₂）溶于适当溶剂中，配制储备液。2) 加入 10 mL ddH₂O 中2O，以获得100 mM溶液。该溶液若储存于密封容器中，冷藏并避光，可保持稳定。
    2. 将储备液进行系列稀释，加入预先装有900 μL ddH₂O的1.5 mL微量离心管中2O：取100 μL储备液加入第一个离心管中，混匀，标记，然后取该管中100 μL加入第二个管中，重复此操作，得到10 mM、1 mM和100 μM的溶液。
    3. 用ddH₂O进一步稀释2O 以获得 50 μM、25 μM、10 μM、1 μM 和 500 nM 的 NaNO2 用于标准曲线的等分试样。
  2. 制备 I3- 乙酸用于吹扫容器（可在室温（RT）下保存1周）22
    1. 加入2 g碘化钾（KI）和1.3 g碘（I₂）2) 加入 40 mL 去离子水（ddH2O 和 140 mL 乙酸。
    2. 充分搅拌混合物至少30分钟，确保混合均匀。
  3. 准备样品以进行一氧化氮的差异测定2-，S-亚硝基硫醇（若收集了Hb，则为S-NO-Hb）和亚硝酰铁复合物（若收集了Hb，则为Hb-NO）（图3)
    1. 将每个样品均分为3份，每份270 μL（若检测S-NO-Hb和Hb-NO，则为900 μL Hb），分装至避光的微量离心管中，其中两管预先加入30 μL 1×PBS（若检测S-NO-Hb和Hb-NO，则为100 μL），第三管加入30 μL HgCl₂2 （若检测S-NO-Hb和Hb-NO，则加入100 μL），涡旋混匀，室温孵育2 min图3).
    2. 向样品中加入 30 μL 5% AS，该样品含有 HgCl2 用于测量Fe-NO（Hb-NO为100 μL），另一份加入PBS用于测量S-NO和Fe-NO（S-NO-Hb和Hb-NO均为100 μL），向第三份已预装1×PBS的样本中加入30 μL PBS以测量NO2-，S-NOs 和 Fe-NOs（100 μL 用于残留 NO）2- 从Hb收集、S-NO和Hb-NO）开始。涡旋混匀，室温孵育3分钟（图3).

5. 无细胞血红蛋白体系对一氧化氮的消耗

注意：更多细节请参见先前发表的研究38。

  1. 使用已知浓度的纯化血红蛋白（Hb）储备液配制标准氧合血红蛋白（oxyHb）溶液
    1. 将储备液用ddH2O在1.5 mL微量离心管中进行系列稀释，得到用于绘制标准曲线的溶液：62 μM、50 μM、25 μM、12.5 μM、6.25 μM、3.125 μM、1.56 μM。
  2. 配制DETA-NONOate溶液
    1. 将10 mg DETA-NONOate加入610 µL pH 7.4的PBS中的10 µM NaOH溶液中，配制成100 mM的DETA-NONOate溶液，并置于冰上保存。

6. 启动化学发光检测器（CLD）并准备吹扫装置

注意：有关吹扫容器的制备，请参考先前发表的研究43。

  1. 检查与化学发光检测器（CLD）相关的主要连接管路
    1. 将氧气管路连接至CLD，并打开氧气罐，调节压力至符合CLD制造商规定的要求。
    2. 确保强场电介质（IFD）滤光管路已连接至CLD，但尚未连接至吹扫瓶或NaOH捕集阱。
  2. 启动CLD
    1. 在CLD界面上，启动用于液相检测的检测程序。
    2. 确认氧气供应充足。若条件满足，CLD将成功从进样口开始采样，并以毫伏信号（0–5 mV）显示检测结果；否则，CLD将提示诊断失败信号。
  3. 准备吹扫瓶
    1. 关闭吹扫瓶的三个端口：将针阀完全向右拧紧，关闭进样口和出样口的旋塞。
    2. 取下吹扫瓶盖，在反应腔内加入足量适用于预定检测的试剂（表1），确保用于注入样品的注射器针头能够浸入液柱中。
    3. 确认获得稳定且符合预期的基线信号（表1）。
  4. 启动吹扫气体流
    1. 确保惰性气体罐（例如N2）配备双级减压阀，并将惰性气体罐连接至吹扫瓶的气体入口。
    2. 调节减压阀，使出口压力为1–5 psi，打开吹扫瓶的进气口，缓慢打开吹扫瓶的针阀以允许气体流入，并确认吹扫瓶内出现气泡。
  5. 调节气体流速
    1. 使用CLD通过IFD滤光管路采集环境空气样品，记录此时CLD测得的池压。
    2. 将吹扫瓶盖重新安装到位，将IFD滤光管路连接至吹扫瓶（或在VCl3溶于HCl的检测中连接至NaOH捕集阱），并打开吹扫瓶的出口旋塞。
    3. 调节针阀，使CLD处测得的池压与环境空气中的记录值相同。

7. 实验

注意：有关实验的更多细节，请参考先前发表的研究工作43。

  1. 启动化学发光信号采集程序
    1. 将化学发光检测仪（CLD）的串口连接至已安装采集程序的计算机串口。
    2. 运行分析程序。
    3. 点击 Acquire，选择保存 .data 文件的文件夹，输入文件名，然后点击 Save。
      注意：注意屏幕上预设的运行时间，当预设时间结束时记录将自动停止。如有需要，可延长预设运行时间。
  2. 准备重复进样
    1. 通过点击 Minimum 和/或 Maximum 按钮，然后输入所需数值，调整屏幕上的电压量程，以控制目标基线。
    2. 准备一个 20 或 50 mL 的试管，装入去离子水（ddH2O），用于在每次进样之间冲洗注射器。
    3. 准备好一盒精密擦拭纸巾，以便随时取用。
  3. 样品进样
    注意：首先从用于绘制标准曲线的标准溶液开始进样（按浓度由低到高依次进样），然后进行实验样品的进样（建议每个样品做双份或三份重复）。
    1. 每次吸取样品前（以及每次进样后），先用去离子水（ddH2O）至少冲洗注射器两次或更多次，并每次在擦拭纸上检查水流是否畅通无阻。
    2. 手持注射器和样品管靠近，将注射器插入样品管中，拉动活塞至所需体积，确保无气泡或未混匀的固体颗粒被吸入。
    3. 用擦拭纸清洁注射器针头，然后将注射器插入进样口的隔垫盖中，在确认针尖已进入反应室液相后进行注射。
  4. 在软件程序中标记进样并等待
    1. 确认进样引起信号上升（补充图1）（在无细胞血红蛋白消耗 NO 的实验中为信号下降），点击 Sample Names 下方的灰色框输入样品名称，然后点击 Mark Injection。
      注意：若进样后未产生信号，应怀疑注射器堵塞。
    2. 等待电信号恢复至基线（通常需要 3–4 分钟）。此期间可进行步骤 7.3.1 的操作。
  5. 在每次进样过程中及之后，重复步骤 7.3 和 7.4 中所述的所有操作，直至实验结束。记得运行保存液样品（如使用了保存液）
  6. 停止实验
    1. 点击 STOP 以中断信号采集，关闭 CLD 并关闭水浴（如检测 NO3-）。
    2. 中断气体流动，打开针阀，取下吹扫瓶的盖子，在排水口下方放置废液容器，然后打开排水旋塞。
      ​注意：若实验需要超过 60 分钟的数据采集，则必须在运行 60 分钟后重新启动采集（重复步骤 7.1.3）并创建新文件。

8. 测量与计算

注意：测量和计算为离线进行，可在其他时间完成。

  1. 启动化学发光数据采集程序以进行离线数据分析
    1. 启动程序，然后点击 Process。
    2. 选择实验文件，然后点击 Open。
  2. 计算每次给药后曲线下面积
    1. 软件会自动在屏幕上绘制基线（补充图 2A，水平黄色线）以及每个样品给药后产生的每个波形的峰值轴（垂直黄色线）：请验证其位置是否正确（或通过点击每条线并用鼠标或方向键移动进行调整），然后点击 Threshold OK（补充图 2B）。
      注意：在无细胞血红蛋白（Hb）对一氧化氮（NO）消耗的测定实验中，软件通常无法正确捕捉样品注入所产生的波形。通过放大每个波形，操作者可轻松协助软件完成面积计算（补充图 2）。
    2. 软件会自动绘制由每次样品给药引起的每个峰的起始点（垂直绿色线）和终点（垂直红色线）：请验证其位置是否正确（或通过点击每条线并用鼠标或方向键移动进行调整），然后点击 Integrate（补充图 2C）。
      注意：此时，部分轨迹区域可能被错误识别为注射事件，某些峰可能被自动计数两次。这些错误可在步骤 8.2.2 中重新识别并删除。
    3. 软件会自动将实验中标记的每次注射后的信号面积与其对应的名称进行匹配：通过点击 Next Peak 和 Previous Peak 浏览每个带有指定名称的峰（由垂直黄色线标示），然后点击按钮 All OK，最终获得屏幕上所有区域的计算结果。
    4. 为纠正用户或程序产生的所有命名或匹配错误，请根据需要使用 补充文件 1 中所示的按钮。
  3. 将校准曲线数值导入电子表格并生成线性回归方程（补充图 3）
    1. 通过复制粘贴方式将 CLD 程序中的数据导入新的电子表格。在数据表中将两列分别排列为 Sample Concentration 和 Area Under the Curve，并在两列中均添加一个匹配的零值。
    2. 选中这两列，点击 Insert > Scatter，然后在 Chart Design 菜单下选择 Add Chart Element > Trendline > Linear。
    3. 右键点击生成的趋势线，选择 Format Trendline，然后在 Format Trendline 菜单中勾选 Display Equations on Chart 和 Display R-squared value on Chart ，以获得简单的线性校准方程。
  4. 将各样品计算得到的面积用于浓度计算（补充图 3）
    1. 将每个数值填入电子表格。在下一列中，应用步骤 8.3.3 所得方程计算每次注入样品的浓度，其中 y 为浓度（新列的数值），x 为注射后测得的曲线下面积。
      注意：请记得考虑在保存溶液中测得的浓度（如使用了保存液），并相应地减去该值。

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结果

在含有已知浓度无细胞氧合血红蛋白的样本中，采用无细胞血红蛋白（Hb）消耗一氧化氮（NO）的检测方法（图4）。由于在该检测中，每摩尔氧合血红蛋白的血红素可按化学计量关系释放一摩尔NO分子，因此使用纯化的无细胞氧合血红蛋白建立该检测的校准曲线（补充图3）。

在心脏手术中脱离体外循环（CPB）的患者中，游离血红蛋白（通过比色法测定）与一氧化氮（NO）消耗之间的剂量-反应关系如图5所示。可以认为，在脱离CPB后，游离血红蛋白中处于Hb-Fe2+-O2状态的血红素基团浓度较高（图5，红色曲线），相比之下，在CPB期间接受NO治疗的患者中，仅有少数游离血红蛋白的血红素基团消耗NO（图5，绿色曲线）。

用于评估无细胞血红蛋白（H...

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讨论

由于灵敏度较高，基于化学发光的NO及相关化合物检测方法存在较高的NO2-污染风险。实验中使用的每种试剂（尤其是NO2-阻断液）和稀释液（包括ddH2O）均应检测其NO2-含量，以校正背景信号。亚硝酸盐在全血中的半衰期约为10分钟，具有极高的反应活性，并迅速生成NO3-。因此，采血与离心或NO2-阻断之间的时间间隔可能导致分析前误差，应尽可能缩短15。在使用血浆样本的检测中，建议将血液采集至肝素抗凝管中，在加入40 μL由250 mg NEM溶于10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）配制而成的200 nM NEM溶液封闭巯基后，于4 °C以750 × g离心5分钟。该储备液可保存于4 °C。某些抑制一氧化氮合酶（NOS）的化合物，如硝基精氨酸、硝普钠和硝酸甘油，会缓慢且非定量地转化为NO，导致基线升高。如果研究中需使用NOS抑制剂，建议选用不...

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披露

L.B. 作为溶血和一氧化氮研究项目的首席研究员，获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI NIH）K23 HL128882项目的薪金支持。L.B. 还获得乔治梅森大学莫卡特斯中心“新冠研究快速资助”（Fast Grants for COVID-19 research）以及iNO Therapeutics LLC公司提供的资助。B.Y. 获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所（NHLBI）#R21HL130956项目以及美国国防部/日内瓦基金会（DOD/The Geneva Foundation，项目编号：W81XWH-19-S-CCC1，日志编号：DM190244）的资助。B.Y. 在麻省总医院（MGH）获得有关一氧化氮电化学生成技术的专利。

L.B. 和 B.Y. 已为一氧化氮递送在 COVID-19 疾病中的应用提交专利申请，PCT 申请号：PCT/US2021/036269，申请日期为 2021 年 6 月 7 日。RWC 作为技术开发项目的首席研究员，从 Unitaid 获得薪资支持，该项目旨在为资源匮乏地区儿童的结核病分散式诊断提供技术支持。

致谢

本手稿中报告的实验方案得益于马萨诸塞州总医院麻醉科重症监护麻醉研究实验室Warren Zapol博士实验室此前多位研究员的累积贡献。我们感谢Akito Nakagawa、Francesco Zadek、Emanuele Vassena、Chong Lei、Yasuko Nagasaka、Ester Spagnolli和Emanuele Rezoagli博士所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酸Sigma45754500 mL - 液体
抗泡沫剂B乳液SigmaA5757250 mL - 液体
DETA NONOateCayman8212010 mg
Gibco DPBS (1x)，无钙，无镁ThermoFisher14190144500 mL
盐酸 37% (1 M)Sigma258148500 mL - 液体
碘SAFC207772100 g - 固体
KimwipesKimtech34155
氯化汞(II) ACS级试剂> 99.5%Sigma215465100 g - 固体（溶于水）
Mili-Q 水纯化系统Millipore
Model 705 RN 50 μL 注射器Hamilton80530微量注射器
Model 802 N 25 μL 注射器Hamilton84854微量注射器
N-乙基马来酰亚胺Sigma426025 g - 晶体
一氧化氮分析仪 + 套件软件 - 吹扫容器ZysenseNOA 280i化学发光检测器
Nonidet p-40  (NP-40)ThermoFisher8512510% - 500 mL
六氰合铁酸钾(III) ACS级试剂≥ 99%Sigma244023100 g - 粉末
碘化钾 ACS级试剂> 99%Sigma221945100 g - 固体
硝酸钾晶体 分析纯 EMSURE ACSSupelco105067250 g - 晶体
PowerGen 125Fisher Scientific14-359-251机械匀浆器
RV3 双级旋片泵EdwardsA65201906真空泵 - 与分析仪配套
肝素钠 - BD Hemogard CloBD BiosciencesBD36787175 USP 单位
氢氧化钠无水 ACS级试剂 ≥ 97%Sigma7954291 kg - 颗粒
硝酸钠 ACS级试剂 ≥ 99%Sigma221341500 g - 粉末
亚硝酸钠 ≥ 99%SigmaS2252500 g - 晶体
磺胺 ≥ 98%SigmaS9251100 g - 固体
氯化钒(III)Sigma11239325 g - 固体 - 注意（放热）
Whatman 1 号滤纸SigmaWHA10010155

参考文献

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