小鼠艾灸操作策略

摘要

本实验方案介绍了一种用于小鼠的艾灸施用方法，该方法可减少小鼠的恐惧感，保障其福利，并提高研究人员的操作效率。

摘要

艾灸研究领域正在不断扩展，近年来相关出版物数量迅速增加。艾灸是一种将艾绒在人体皮肤上点燃的疗法，可导致外周皮肤温度升高并出现局部发红现象。在治疗过程中，受试者必须保持静止，以防止烫伤，并暴露干预部位以便于操作；然而，对于动物而言，在艾灸过程中维持固定体位是一个巨大挑战。因此，在小动物（如小鼠）身上实施艾灸操作会给研究人员带来诸多困难。此外，不舒适的体位可能引起动物恐惧和对艾灸的抗拒，增加受伤风险，降低动物福利，并导致研究数据的有效性下降。迫切需要一种高效且舒适的艾灸方法，以保护动物福利并尽量减少对实验结果的不利影响。然而，目前的艾灸方法差异较大，且常常疗效有限。更重要的是，不舒适的艾灸体位可能引发应激反应，例如焦虑、恐惧和愤怒等情绪反应，这些都可能影响研究数据的准确性。因此，有必要制定在干预过程中对动物造成最小伤害的动物艾灸策略。本方案介绍了一种用于小鼠艾灸干预的固定方法，旨在最大限度地减少小鼠的不适感，并提高研究效率。文中重点阐述了小鼠固定的关键策略及艾灸操作方法，并描述了固定装置的结构。

引言

艾灸是中医使用的一种外部疗法¹。数百年来，艾灸被广泛应用于保健以及疾病预防与治疗^2,3。然而，艾灸的作用机制尚未完全阐明；因此，近年来随着研究人员对其效应及生物学机制的深入探索，该领域的研究不断拓展。

进行艾灸时，受试者必须保持静止，以达到最佳效果⁴。艾灸治疗通常持续15-30分钟^5,6。因此，对动物（尤其是适合用于动物实验的小型动物，如小鼠和大鼠）实施艾灸操作已成为研究人员面临的一大挑战。大多数艾灸设备适用于临床，无法用于动物，特别是小鼠等小型动物^7,8,9。此外，与人类不同，动物几乎无法遵从指令，难以在一段时间内保持稳定。动物长时间处于固定且不适的体位，可能引发焦虑、恐惧、愤怒、紧张以及对治疗的抗拒等负面情绪，增加受伤风险，降低动物福利，并导致研究数据的有效性下降¹⁰。为解决这一问题，在以往的研究中，针对涉及针灸、艾灸和推拿等外治法的动物实验，常采用长时间麻醉的方法^11,12,13。然而，由于麻醉会改变动物的生理状态，而在大多数临床情况下，艾灸是在患者清醒状态下进行的，因此麻醉可能影响研究数据的真实性。因此，如何在保证动物清醒的同时实现安全、舒适的固定，成为一项技术难题。为解决这些技术问题，目前已开发出专门用于小鼠艾灸的装置。本实验方案提供一种固定方法，可协助研究人员对动物实施艾灸治疗，使动物在治疗过程中保持稳定、清醒且舒适。

方案

所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并经成都中医药大学实验动物管理和使用委员会批准。实验动物的饲养与管理参照文献^14,15执行。实验选用成年雄性C57BL/6J小鼠，体重为20-25 g。所有小鼠均在12小时光照/12小时黑暗循环、温度24 °C、湿度40%-50%的环境中饲养，自由摄食和饮水。以下方案描述了在典型实验室饲养条件下进行的艾灸操作步骤。

1. 仪器设备的准备

1. 小鼠固定
   1. 准备一个由垂直板、垂直板底座和木制支架组成的小鼠固定装置。
      1. 使用一根直的木制夹板（长度：30 cm × 宽度：3 cm × 高度：3 cm）构建固定主体，并在上面安装固定用维可牢尼龙搭扣带（由两部分组成：钩面（4 cm × 3 cm）和毛面（10 cm × 3 cm）），以便在保持灵活性的同时固定小鼠身体（参见材料表）。
      2. 使用热熔胶枪将钩面粘贴在木制夹板的右侧，并将毛面的四分之一长度粘贴在左侧。
   2. 将小鼠放置在固定板上，使用固定维可牢尼龙搭扣带固定其躯干。
      注意：确保固定带不过紧，以免对心脏施加压力，导致小鼠死亡。应松紧适中、牢固地固定小鼠。
   3. 使用胶带将小鼠的下肢/上肢固定在木制夹板两侧，并将其尾巴固定在木制夹板表面。
2. 小鼠固定床架的准备
   注意：该支架由垂直木板、木制底板和木制支架组成。支架包含一个L形不锈钢片，用于支撑每张小鼠固定床。
   1. 将垂直板固定在底板上，并在底板上开凿方形凹槽，用于插入作为挡板的木棒（图1）。
   2. 若对小鼠头部进行艾灸处理，需准备一个透明塑料头罩。
      1. 取一支1000 mL注射器，移除针头和推杆，使用切割工具或刀片将注射器外套沿长度方向切成两半。
      2. 选取其中一半注射器外套，切掉头部和尾部，保留中间部分（长度：4 cm）作为小鼠头罩。
      3. 使用电钻在注射器外套中心钻一个直径为1 cm的孔，将艾条插入孔中。将头罩罩住小鼠头部，以限制其头部活动并防止点燃的艾条对其造成伤害。
   3. 若对小鼠前肢进行艾灸处理，则在小鼠固定床头部位置安装两条平行的木条（长度：7 cm × 宽度：1 cm）和一根横向横杆（长度：7.5 cm × 宽度：1 cm）（图2）。
      注意：每条平行木条与小鼠固定床之间的间距应为1 cm。支架数量和垂直板高度可根据实验需求确定。操作过程中应轻柔进行，避免惊吓小鼠。实验前务必对小鼠进行为期1周的适应性训练。
3. 艾条支架的准备
   1. 准备艾条支架，包括一个矩形磁性金属片（长度：30 cm）、一个支架底座（长度：5 cm × 宽度：5 cm × 高度：2 cm）以及若干带孔木块（长度：3 cm × 宽度：1.5 cm × 高度：1 cm），每个木块中心钻有一个孔（直径：0.55 cm），用于插入艾条（参见材料表）。
   2. 在每个木块的一侧粘附一块扁平薄磁铁（长度：3 cm × 宽度：1.5 cm，厚度：0.2 cm）。通过带艾条的木块与支架之间的磁力作用，可调节艾条的高度。
      注意：确保木块上的磁铁磁极与支架磁铁的磁极相反。
4. 为记录艾灸操作的开始和结束时间，将计时装置（参见材料表）放置在靠近小鼠固定装置的位置，以便于读取。
5. 在抓取和固定小鼠时，可使用裸手或佩戴薄手套。在进行艾灸处理时，佩戴薄手套同样有效。

2. 艾灸操作步骤

1. 戴上实验手套。在艾灸治疗前，剃除毛发 通过 在艾灸部位使用小鼠脱毛器脱毛以暴露穴位。
2. 将艾条（直径0.5 cm，长度10 cm）插入艾灸棒 holder（该 holder 由磁性金属矩形片、支架底座以及中心带孔的木块组成，用于插入艾条，每个 holder 仅可容纳一根艾条，步骤1.3）。
3. 为确定艾灸温度，将数字温度探测器连接至穴位以监测温度变化。
4. 启动计时器并点燃艾条；根据实验所需的温度变化，固定或调节艾条燃烧端与穴位皮肤之间的距离。

3. 小鼠同步灸法

注意：小鼠可以分组进行艾灸处理。使用小鼠床架来固定小鼠床，以便同时对一组小鼠进行处理。

1. 将每只小鼠放置于鼠架上，并在底板中插入木棒，以防止小鼠掉落（图3）。
2. 将艾条（直径0.5 cm，长度12 cm）插入艾灸架中，使其位置与每只小鼠所在位置相对应。调整鼠架与艾条架之间的距离，然后点燃艾条。
   注意：此方法可使小鼠在放松且舒适的状态下接受艾灸治疗。在艾灸过程中，应确保所有小鼠的鼠架与艾条架之间的距离保持一致。
3. 在建模前，先进行小鼠对热缩足阈值（TWL）测试的反应，以确定艾灸是否具有镇痛效果。

结果

表1总结了影响艾灸反应的各种因素。小鼠艾灸的积极效果已通过多项小鼠福利指标和积极效应得到证实。

接下来，将具体阐述采用艾灸技术结合完全弗氏佐剂（CFA）诱导注射方法所获得的结果。通过热缩足反应阈值（TWL）实验评估艾灸在缓解疼痛中的有效性¹⁶。

小鼠在24 °C、40%-50%湿度条件下，适应性饲养于12小时光照/12小时黑暗循环环境中一周后，分别进行束缚并注射CFA（20 µL，包括CFA诱导模型组、CFA诱导联合艾灸组，CFA+MOXI）或生理盐水。CFA诱导的炎症性疼痛模型已建立¹⁷。在各组模型建立前后均进行TWL实验，以评估造模效果。在建立CFA诱导的炎症性疼痛模型后以及进行艾灸干预后，对ST36穴位进行处理（图4）。

小鼠俯卧于固定板上，躯干用魔术贴带固定。小鼠的后肢和尾巴贴...

讨论

艾灸技术对多种疾病具有疗效，例如疲劳、失眠、腹泻和疼痛综合征^{20,21,22,23,24,25,26}。由于艾灸治疗在多种疾病中的优势，其作用机制已引起研究人员的关注。在动物模型上应用艾灸对于研究其分子机制至关重要。为了分析艾灸的作用机制，研究人员面临的主要挑战之一是如何将动物固定在合适的位置，使其保持稳定且无不适感，同时能够持续接受一段时间的治疗。为解决这一问题，许多研究采用麻醉动物的方法^27,28。然而，即使少量麻醉也可能抑制神经传导，从而可能干扰实验数据的准...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
完全弗氏佐剂（CFA）	Sigma-Aldrich	SF588102
胶枪	Deli 集团有限公司	DL5041
实验室手套	博奇  有限公司	53625130323
磁性金属矩形片（厚度：0.2 cm）	Sitoo Stationery Co., Ltd	1007908729
艾条	Hanyi Airong 工厂	5613
钢板	Rizhan金属材料有限公司	1108
注射器（1000 mL）	新民福达有限公司	796341
计时器	Bevoza Co., Ltd	KT003
魔术贴腰带	明尼苏达矿业制造有限公司	3MSJ3550
木块	Chuang Hing Wood Chip Co., Ltd	2581457A
木条	Chuang Hing Wood Chip Co., Ltd	3410968M
木棒	Chuang Hing Wood Chip Co., Ltd	2785476M
木条	Chuang Hing Wood Chip Co., Ltd	2374652S