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自动化二维时空分析可移动单分子FRET探针

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DOI：

10.3791/63124

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2021年11月23日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Applied Physics, TU Wien, 2Institute for Hygiene and Applied Immunology, Center for Pathophysiology, Infectiology and Immunology, Medical University of Vienna

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用宽场荧光显微镜对基于移动单分子荧光共振能量转移（smFRET）探针进行时空分析的方法。新开发的软件工具包能够确定运动探针的smFRET时间轨迹，包括随时间变化的准确FRET效率和分子位置。

摘要

单分子荧光共振能量转移（smFRET）是一种多功能技术，可用于检测亚纳米至纳米尺度的距离。该技术已广泛应用于多种生物物理和分子生物学实验中，包括分子力的测量、生物大分子构象动态的表征、蛋白质在细胞内的共定位观察，以及受体-配体相互作用时间的测定。在宽场显微镜配置中，实验通常使用表面固定的探针进行。本文介绍了一种将单分子追踪与交替激发（ALEX）smFRET实验相结合的方法，能够获取等离子膜或玻璃支撑脂双层中表面结合但具有移动性的探针的smFRET时间轨迹。针对所记录数据的分析，开发了一套自动化、开源的软件工具集，支持（i）荧光信号的定位，（ii）单颗粒追踪，（iii）FRET相关参数（包括校正因子）的确定，（iv）smFRET轨迹的严格验证，以及（v）结果的直观呈现。所生成的数据可便捷地作为输入，用于后续通过专用软件进行深入分析，例如探针扩散行为的评估或FRET跃迁过程的研究。

引言

荧光共振能量转移（FRET）一直是分子生物学和生物物理研究的重要推动力，因为它能够以亚纳米级分辨率研究各种过程。由于供体与受体荧光染料之间的能量转移效率强烈依赖于亚纳米至纳米尺度的染料间距，FRET 已被有效用作一种光谱尺，用于探究生物大分子的静态与动态构象1,2,3,4。此外，FRET 现象还被广泛用于在群体水平上研究膜相关蛋白和细胞内蛋白的共定位5,6。在过去的二十年中，该方法被改进用于监测单分子 FRET（smFRET）事件7，显著提高了时间和空间分辨率，并能够分辨异质样品中罕见的亚群。借助这些技术，研究人员对多种分子机器的动力学过程获得了独特的见解，例如 RNA 聚合酶 II 的转录加工速率8、DNA 聚合酶的复制速度9,10、核小体的移位速率11、剪接体组装后的转录本剪接与暂停速率12、核糖体亚群的活性13，以及驱动蛋白马达的行走速度14等。受体-配体相互作用的持续时间15和分子间作用力16也已得到量化。

基于强度的单分子FRET研究通常依赖于敏化发射来测量FRET效率：在激发供体后，发射光路中的分光器在空间上分离来自供体和受体荧光团的光信号，从而可对各自的荧光强度进行定量。随后，FRET效率可计算为受体发射的光子数占总光子数的比例17。此外，供体激发后对受体的激发（ALEX）可用于测量FRET事件的化学计量比，有助于区分真实的低FRET信号与例如由受体荧光团光漂白所导致的假性低信号18。

单分子FRET实验通常采用以下两种方法之一进行。第一种方法是使用共聚焦显微镜照射样品体积中的微小区域。当溶液中的单个探针分子扩散进入焦体积时，会被激发。利用该技术可使用快速光子计数探测器，实现亚微秒级的时间分辨率。第二种方法是将探针特异性地固定在表面，并通过宽场显微镜进行监测，通常采用全内反射（TIR）构型以最大限度减少背景荧光。探针的固定化使得记录时间远长于第一种方法。此外，更大的视场允许同时监测多个探针。但由于需要使用相机，该方法相较于上述方法速度较慢，时间分辨率受限于毫秒至秒级范围。

如果需要长时间的测量轨迹，例如研究毫秒到秒时间尺度上的动态过程，则第一种方法不适用，因为荧光爆发通常过于短暂。当无法实现固定时，第二种方法也不可行，例如在活细胞实验中，探针在细胞膜内扩散的情况。此外，已有研究发现，生物模型系统对接触表面的流动性不同，其响应可能会发生显著变化16。

尽管过去已开展过记录可移动FRET探针的单分子FRET（smFRET）与单粒子追踪联用实验19，但目前尚无公开可用的软件用于分析此类数据。这促使了新分析平台的开发，该平台能够测定可移动荧光探针的多种性质，包括单分子FRET效率和化学计量比、亚像素精度的空间位置，以及随时间变化的荧光强度。已建立多种方法，通过分析逐步漂白行为、最近邻距离、发射强度及其他特征对所得轨迹进行筛选，从而特异性地选择正确合成且功能完整的单探针分子。该软件还支持近期多实验室研究中达成共识的实验与分析技术，以生成可靠且定量的单分子FRET数据17。特别是，其实施严格遵循经验证的FRET效率与化学计量比计算流程。在供体激发下，供体发射通道的荧光强度 IDD 与受体发射通道的荧光强度 IDA 被用于根据公式（1）计算表观FRET效率 Eapp。

荧光分析中 E_app 的计算公式，显示强度比值，用于教学。 （1）

借助在受体激发条件下受体发射通道中的荧光强度 IAA，可利用公式（2）计算表观化学计量比。

用于光学分析的静态平衡方程 S_app=(I_DD+I_DA)/(I_DD+I_DA+I_AA)。 （2）

通过考虑四个校正因子，可以从Eapp和Sapp推导出FRET效率E和化学计量比S。

化学动力学公式，I<sub>DA</sub>→I<sub>DA</sub>-αI<sub>DD</sub>-δI<sub>AA</sub>，用于描述反应速率。

α 描述的是供体荧光泄漏到受体发射通道的情况，可通过仅含有供体荧光团的样品，或通过分析受体已被漂白的轨迹部分来确定。δ 用于校正供体激发光源对受体的直接激发，可通过仅含有受体荧光团的样品，或通过分析供体已被漂白的轨迹部分来测量。

数学符号变换公式，静态方程，I_DD 到 γI_DD。.

γ尺度 IDD 用于校正供体和受体发射通道中不同的检测效率以及荧光团不同的量子效率。该因子可通过分析在具有高FRET效率的轨迹中受体漂白后供体强度的增加来计算。20 或通过研究具有多个离散FRET状态的样本。

静态平衡公式；I<sub>AA</sub> ↦ I<sub>AA</sub>/β；方程；教育物理学概念。

β 用于对 IAA 进行缩放，以校正供体和受体激发效率的差异。如果 γ 是通过受体漂白分析确定的，则 β 可通过已知供体-受体比例的样品计算得到21。否则，多状态 FRET 样品也可提供 β 值。

综合这些校正，可利用公式（3）计算校正后的FRET效率。

能量转移方程，E=(IDA-aIDD-δIAA)/(IDA-aIDD-δIAA+γIDD)，分子相互作用分析。 （3）

以及使用公式 (Eq) 校正后的化学计量比4).

静态平衡方程；比率分析；数学公式；S方程图；物理学研究。 （4）

理想情况下，校正后的化学计量比为1:1的供体与受体比例可给出 S = 0.5。在实际操作中，信噪比降低会导致所测数值的离散程度增大 S，阻碍了对仅来自供体信号的区分S = 1）和仅有受体信号（S = 0）。所得的时间轨迹可作为单分子轨迹更详细分析的输入数据，以获取诸如时空力分布等信息16单分子事件的迁移率22或不同状态之间的转换动力学1.

以下方案描述了单分子FRET（smFRET）追踪实验的实验参数和操作步骤，以及使用新开发的软件套件进行数据分析的基本原理。为获取实验数据，建议采用满足以下要求的显微镜系统：i）具备检测单个染料分子发射光的能力；ii）宽场照明：特别是对于活细胞实验，推荐使用全内反射（TIR23,24,25）配置；iii）根据波长对发射光进行空间分离，使供体和受体荧光信号投射到同一相机芯片的不同区域或分别投射到不同的相机上25；iv）对供体和受体激发光源进行毫秒级精度的调制，例如使用可直接调制的激光器或通过声光调制器实现调制。该功能可实现频闪光照以最小化荧光染料的光漂白，并可通过交替激发来确定分子化学计量比；v）每条记录的图像序列输出为一个独立文件，文件格式需可被PIMS Python软件包26读取。特别是支持多页TIFF文件格式。

方案

1. 软件先决条件

  1. 安装 miniconda Python 发行版27（所需的最低 Python 版本：3.7）。
  2. 在 Windows 开始菜单中打开 Anaconda 命令提示符，或在 Linux 或 macOS 系统中打开终端并执行 conda activate。
  3. 通过执行以下命令启用社区维护的 conda-forge 软件包仓库28：
    conda config --add channels conda-forge
    conda config --set channel_priority strict
    conda update --all
  4. 执行以下命令安装所需的 Python 软件包：
    conda install opencv trackpy lmfit ipympl scikit-learn pyqt sdt-python jupyterlab
  5. 熟悉分析软件的用户界面 JupyterLab（可参考软件文档29）。
  6. 安装版本控制系统 git，后续将用于下载和更新分析软件。若使用 Linux 系统，请使用发行版自带的包管理软件进行下载和更新；否则，请执行：
    conda install git
  7. 可选：安装 sidecar Python 软件包，以便在分析过程中显示过滤步骤后的数据集：
    conda install sidecar

2. 样品测量

FRET 分析：激发/发射示意图、显微镜图像、数据热图、光谱分析。
图 1：图像采集。（A）激发序列。在使用 405 nm 激光记录染料标记细胞的可选图像后，分别使用 532 nm 和 640 nm 激光交替且重复地激发供体和受体，激发时间为 till。供体与受体激发之间的时间 tr 必须足够长，以允许相机完成图像读出。延迟时间 tdelay 可用于调节采集帧率，从而调整光漂白前的观察时间跨度。该图板改编自16。（B）使用定位标记（fiducial markers）计算两个发射通道之间的坐标变换。匹配的定位标记以颜色标示。应记录多幅偏移图像，以确保覆盖整个视场。（C）使用高度标记的样品记录用于平场校正的激光轮廓。先记录并光漂白受体轮廓，随后采集供体轮廓。应在样品的不同区域采集多幅图像，取平均并进行平滑处理，以减少样品缺陷（例如图像顶部中央的亮斑）的影响。（D）根据如（C）所述记录的 20 幅激光轮廓计算得到的平场校正图 p(x,y)。缩写：FRET = Förster 共振能量转移；ImDD = 供体激发下的供体发射图像；ImDA = 供体激发下的受体发射图像；ImAA = 受体激发下的受体发射图像。比例尺 = 5 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用电子倍增电荷耦合器件（EMCCD）相机时，应开启EM增益以在高信噪比下观测单分子信号（参见制造商说明书）。
  2. 激发序列（参见 图1A 有关更多详细信息）。
    1. 可选地，记录用于分割的图像，以将数据分析限定于视野中的特定区域。例如，使用405 nm激光激发负载Fura-2的细胞，并采集其在约510 nm处的发射光，从而仅评估位于细胞与支撑脂质双层（SLBs）界面处的探针信号。随后，等待时间 tr 以允许相机读取。
      注意：在EMCCD相机上， tr 取决于所选感兴趣区域（ROI）的行数。因此，选择较小的ROI具有优势，因为它可减少帧间延迟以及所记录数据的大小。此外，启用帧转移模式还可进一步缩短 tr.
    2. 交替重复激发供体和受体荧光染料。
      1. 激发供体一定时间的光照 t疾病 （5-10 ms 通常足以避免运动模糊），同时触发相机。
      2. 等待时间 tr 以允许相机读取。
      3. 激发受体的同时触发相机。
      4. 等待一段时间 t延迟.
        注意：此部分必须更长 tr 以使相机能够读取信号，但其他方面可任意选择。它应平衡时间分辨率和轨迹长度的要求。
      5. 重复步骤 2.2.2.1–2.2.2.4。重复次数应足够多，以确保在视野内每个探针至少有一个荧光分子发生光漂白，从而可通过逐步光漂白分析区分单分子信号与聚集体信号。
        注意：选择合适的 t疾病 激发激光强度的设置通常需要一些实验摸索：照明时间越长、激光强度越高，所得图像的信噪比越好，但获得的时间轨迹越短。
  3. 为每个样本记录足够数量的视频。

3. 确定校正因子的附加测量步骤

  1. 记录一系列在供体和受体发射通道中均可见的随机分布的定位标记，用于图像配准（即寻找将供体发射通道坐标映射到受体发射通道坐标，反之亦然的变换）。参见图1B。
    注意：图像配准由软件完成；参见步骤6.1.4。
  2. 测量供体和受体激发光源的强度分布，用于平场校正（即校正视场内激发光不均匀的问题）。为此，准备一个含有高密度FRET探针的样品，首先在受体激发条件下采集图像，随后对受体进行光漂白，再在供体激发条件下记录图像。为提高稳定性，可在不同样品区域重复多次。参见图1C、D。或者，可分别记录仅标记供体分子的样品和仅标记受体荧光团的样品。
    注意：平场校正由分析软件完成；参见步骤8.1.2。
  3. 记录不含受体荧光团的探针的单分子样品（如第2节所述），以确定供体发射信号渗漏至受体通道的情况。
    注意：供体渗漏也可通过实际探针在受体光漂白后的时序轨迹计算得出。若记录到足够数量的此类事件，则无需额外测量。分析软件支持上述两种方法；参见补充信息第3.15节。
  4. 采集不含供体荧光团的探针的记录，用于量化供体激发光源对受体的直接激发。
    注意：直接受体激发也可从实际探针在供体光漂白后的时序轨迹中推导得出。若记录到足够数量的此类事件，则无需额外测量。分析软件支持上述两种方法；参见补充信息第3.15节。
  5. 记录含有两种不同FRET效率的单分子样品，用于校正供体与受体发射通道检测效率的差异以及染料量子产率的不同。
    注意：此类样品可以是例如Holliday junction1，其在两种构象之间波动，或是在不同且明确定义的距离上连接FRET对的DNA棒状结构。若探针具有较高且足够稳定的FRET效率，该校正也可通过探针时序轨迹中的受体光漂白事件计算得出，此时无需额外测量。分析软件支持上述两种方法；参见补充信息第3.15节。

4. 单分子定位算法

注意：多个分析步骤需要单分子定位。根据信号密度、背景和信噪比，选择高斯拟合算法30或质心计算方法31。

  1. 要执行高斯拟合，请通过相应的用户界面选择 3D-DAOSTORM30 算法。
    注意：3D-DAOSTORM 旨在区分即使点扩散函数重叠的信号。虽然这通常是优势，但存在一个注意事项：单个明亮信号有时会被识别为两个相邻信号，这可能会干扰追踪算法，导致检测出两条短轨迹而非一条长轨迹。
    设置以下参数（详细信息请参见提供该算法实现的 sdt-python 库的文档32）。
    1. radius：根据有效像素尺寸，以像素为单位设置高斯拟合函数的初始 σ 值。
    2. threshold：为局部强度最大值设置最小振幅（即最亮像素值，已校正估计的局部背景），以决定是否进行拟合。
      注意：阈值可能是最重要的参数。若设置过低，噪声可能被视为荧光信号，且明亮信号可能被两个高斯函数拟合；若设置过高，则微弱信号将无法被拟合。
    3. model：设置为 2d 以拟合圆形高斯函数。
      注意：其他模型不适用于单分子 FRET 数据。
    4. find filter：在寻找局部最大值前应用滤波器以降低噪声，这在信噪比较低的情况下非常有用。可选的滤波器包括：i) identity：无滤波；ii) Crocker-Grier：来自 Crocker-Grier 算法31,33 的带通滤波器；或 iii) Gaussian：由 sigma 参数设定 σ 值的高斯模糊。
      注意：对于 Crocker-Grier 滤波器，feat. size 参数应大致等于点扩散函数的像素半径。
      注意：拟合过程使用未滤波的原始数据进行。
    5. min. distance：当两个潜在信号之间的距离小于最小距离（像素）时，使用单个高斯函数进行拟合。
      注意：这有助于避免前述情况，即明亮信号被错误地检测为两个相邻信号。
    6. size range：选择拟合的最小和最大 σ 值，以去除由噪声引起的虚假信号检测。
  2. 要执行质心计算（一种基于 Crocker 和 Grier 思想33 的改进算法31），请通过相应的用户界面选择 Crocker-Grier 算法。
    注意：该算法即使在低信噪比情况下以及处理具有不同强度范围的信号时也非常稳健，但无法精确拟合点扩散函数重叠的分子。
    1. radius：设置足够大的圆盘半径（以像素为单位），以包含整个点扩散函数。
    2. signal thresh.：为局部强度最大值设置最小振幅（高于估计背景的最亮像素值），以决定是否进行分析。
      注意：若设置过低，噪声可能被视为荧光信号；若设置过高，则微弱信号将无法被拟合。
    3. mass thresh.：设置待分析信号的最小总强度（背景校正后像素值之和）。
      注意：上述相同考虑因素同样适用。

5. 软件初始化

  1. 下载分析脚本。在 Anaconda 提示，导航至用于保存分析结果的文件夹（使用 cd 命令）并执行
    git clone https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis.git 目标文件夹
    1. 替换 目标文件夹 使用描述性名称，例如 2021-06-14_力致FRET实验.
      注意：分析软件最终将保存在此文件夹中；请确保该文件夹事先不存在。建议为每次实验下载一份分析脚本的副本，以便日后重新查看分析过程、回溯所使用的参数并进行修改。
  2. 复制 Jupyter 笔记本 (01. 跟踪.ipynb, 02. 分析.ipynb, 03. 作图.ipynb）移动到新创建的文件夹中（此后称为 根文件夹）。如果这是首次使用该软件，请从中获取 实验记录本 子文件夹 根文件夹.
    注意：如果类似的数据集已被分析过，从先前的实验中复制笔记本可能是一个便捷的选择，因为参数可能仅有轻微变化。
  3. 通过执行以下命令来启动 JupyterLab 服务器 Anaconda 提示打开一个显示网页的浏览器窗口 JupyterLab.
    jupyter lab
    注意：浏览器仅作为界面，而实际运行的进程位于后台 Anaconda 提示正在执行实际操作。因此，关闭浏览器窗口影响甚微；只需重新访问即可恢复会话 http://localhost:8888 然而，在命令行提示符中中断 JupyterLab 进程或关闭提示符将终止分析，导致未保存的工作丢失。
  4. 在 JupyterLab 浏览器窗口中，使用左侧窗格导航到 根文件夹. 双击 01. Tracking.ipynb 启动第一个笔记本。启动后，注意查看是否出现一个新标签页，其中显示为包含 Python 代码的框体，即所谓的单元格。
    注意：所有 Jupyter 笔记本均包含注释，用于描述每个代码单元的功能。此外，通过将文本光标置于左括号之前，可显示每个方法调用的文档信息 ( 并按压 Shift+Tab.
  5. 参见 图2 有关数据分析流程的概述。

荧光分析与单分子定位的FRET效率工作流程图
图2：典型分析流程的概述。 请注意，过滤步骤需根据实验设计进行相应调整。该图改编自16。缩写：FRET = Förster共振能量转移。 请点击此处查看此图的放大版本。

注意：可用于试用该软件的示例数据可从 https://github.com/schuetzgroup/fret-analysis/releases/tag/example_files 下载

6. 单分子定位、追踪及荧光强度分析（01. Tracking.ipynb）。

  1. 使用 01. 跟踪分析.ipynb 用于单分子荧光信号强度值可靠分析的 Jupyter notebook，专为精确量化设计，尤其适用于 FRET 测量中常见的微弱信号（例如，高 FRET 事件中因供体信号弱或反之所致的信号）。
    注意：为此，将对原始数据中的像素强度进行直接积分，并校正局部背景。有关每一步分析的截图及函数调用参数的说明，请参见 补充信息.
    1. 指定照明序列，以从记录的图像序列中选择供体和受体激发帧，以及用于图像分割的帧。
      注意：由于该软件允许处理采用任意照明方案记录的数据，因此必须指明图像序列中的哪一帧是在激发何种类型的荧光染料时采集的；参见 补充信息第1.2节，步骤3。原始图像序列的帧编号得以保留。
    2. 描述并加载数据集。可同时分析多个数据集，前提是这些数据集使用相同的照明设置进行记录。为每个数据集分配一个标识符，并指定与相应图像序列文件名匹配的模式。此外，可定义特定数据集用于特殊用途，例如用于图像配准的基准标记记录、用于平场校正的激发光轮廓，以及可选的仅供体和仅受体样本，以确定校正因子。
    3. 如果使用单个相机记录了两个通道的原始图像，请选择发射通道。为此，使用适当的图形控件选择供体和受体发射的相应区域。
    4. 在两个发射通道中定位标志点，并进行图像配准。使用提供的用户界面，分别为供体和受体发射通道的定位算法找到合适的参数。有关支持的定位算法信息，请参见第4节。
      注意：可通过其最近邻点的空间分布，在发射通道间识别随机分布的基准标记点图1B）。选择性平面照明显微镜所用算法的自定义实现34 在 sdt-python 文库会自动将供体发射通道中每个标记物的位置与受体发射通道中的相应位置进行匹配。一种变换 T 通过仿射变换对标记物位置进行线性最小二乘拟合，确定供体发射通道坐标向受体发射通道坐标的映射关系35RANSAC 用于处理异常值，例如上一步中错误匹配的位置。
    5. 在所有帧中分别基于供体和受体激发定位FRET探针，并将结果合并为一个表格，其中包含原始帧编号、二维坐标以及指向源图像文件的标识符。
      注意：为此，该软件提供了用户界面，用于查找适用于定位算法的适当选项。
      1. 在供体激发下，通过供体发射获得的图像之和对FRET探针进行定位 ImDD 供体和受体发射 ImDA，几乎不依赖于FRET效率。有关定位算法选项的详细信息，请参见第4节。
        注意：每幅总和图像是通过变换计算得出的 ImDD 使用转化方法 T 先前通过图像配准获得，并逐像素相加到 ImDA.
      2. 在受体发射通道中通过受体激发定位探针 ImAA （关于定位算法的详细信息，请参见第4节）。
    6. 进行追踪及荧光强度测量。

显微镜中的信噪比改善；图表；未滤波数据与模糊数据的比较；分析。
图3：单分子强度测量。（A）对于位于橙色像素处的荧光团，其未校正强度 Iuncorr 通过将足够大圆盘内所有像素（黄色和橙色像素）的强度求和得到，以覆盖所有受信号影响的像素：用于科学分析和研究的静态平衡公式 Σpx∈disk Ipx 方程。。局部背景通过计算圆盘周围环形区域（蓝色像素）内像素的平均值获得：静态平衡方程 b=Σpx∈ring Ipx/nring，用于数据分析。，其中 nring 为环形区域中的像素数量。荧光强度 I 是从未校正强度中减去背景后的结果，即 I = Iuncorr - b × ndisk，其中 ndisk 为圆盘中的像素数量。圆的半径由追踪方法的 feat_radius 参数指定，环的宽度由 bg_frame 参数确定。如果一个信号的点扩散函数与另一个信号的背景环发生重叠（下方面板），则受影响的像素（红色）将从局部背景分析中排除。如果两个点扩散函数相互重叠，则无法可靠地计算荧光强度，因此这些数据将被舍弃。（B, C）模拟结果表明，在低荧光强度下，应用标准差为1像素的高斯模糊可使信噪比提高近2倍（B），且几乎不引入误差（轻微低估，小于1%，（C））16。此外，相对误差（即 (Imeas - Itruth)/Itruth，其中 Itruth 为真实值，Imeas 为分析结果）在整个强度范围内保持恒定，因此在比值型量（如FRET效率和化学计量比）中可相互抵消。所有图表均基于先前发表的研究16。缩写：SNR = 信噪比；FRET = 奥斯特共振能量转移。 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. 为用于将FRET探针定位结果连接成轨迹的trackpy36 算法选择合适的参数选项。具体而言，设置从一帧到下一帧的最大搜索距离，以及信号可能因漂白或定位遗漏而未被检测到的连续帧数。
    注意：这些间隙将通过前后位置之间的插值进行填补。插值得到的位置会被标记，仅用于后续读取强度值，不用于扩散分析。轨迹在受体发射通道的坐标系中进行分析。对于荧光强度分析（步骤6.1.6.2），使用通过图像配准获得的逆变换T-1，将轨迹额外转换至供体发射通道的坐标系（见步骤6.1.4）。
  2. 选择荧光强度计算算法的参数（详见图3A）。指定：i) 以信号位置为中心的圆盘半径，该圆盘应包含受该信号影响的所有像素；ii) 每个圆盘周围用于确定局部背景的环形区域宽度。
    注意：为降低所获强度测量值中的噪声，对图像应用标准差为1像素的高斯模糊处理（图3B、C）。
  1. 使用分析软件功能处理来自图像序列的辅助图像数据。
    1. 提取为便于分割而记录的额外图像（参见步骤 2.2.1，这些图像在激发序列中标记为 s）（见补充信息，第 1.2 节，步骤 3）。
    2. 利用在高度标记样本上记录的图像，确定视野范围内供体和受体激发光的光强分布。
      注意：通过计算图像的逐像素平均值来获得光强分布，扣除相机基线信号，并使用高斯滤波对图像进行模糊处理，以减少样本杂质带来的影响。最后，将所得图像的每个像素值除以其最大值，从而得到将坐标映射到区间 [0,1] 的分布函数 p(x,y)。

7. FRET 轨迹的可视化（可选）

  1. 使用 inspector 应用程序在原始图像数据中显示单分子轨迹，以及相应的荧光强度、表观FRET效率和化学计量比。
    ​注意：该工具可用于评估所选参数的有效性，并手动接受或拒绝单个时间轨迹。有关截图和详细使用说明，请参见 补充信息。

8. 单分子数据分析与过滤（02. Analysis.ipynb）

  1. 使用 02. Analysis.ipynb Jupyter 笔记本对通过 01. Tracking.ipynb 笔记本获得的单分子数据进行分析和过滤。以下步骤展示了一个典型的分析流程。
    注意：不同的科学问题和实验设计可能需要调整参数设置。使用 Jupyter 笔记本可以方便地通过省略、重新排列或修改分析步骤来适应需求。如需查看每个分析步骤的截图及函数调用参数说明，请参阅 补充信息。
    1. 执行初步过滤步骤。
      1. 丢弃点扩散函数重叠的信号，因为难以可靠地确定其荧光强度。
      2. 在照明不均匀的情况下，仅保留视野中照明良好区域内的信号，以确保良好的信噪比。
      3. 若研究分子内 FRET，应将分析限制在图像序列开始时即存在的轨迹，以确保所有光漂白步骤均被记录，并可在后续逐步光漂白分析中正确评估。
        注意：在进行涉及分子间 FRET 探针的实验时，若供体和受体荧光团不属于预先形成的复合物，则可能无法将分析限制在初始存在的轨迹上。
    2. 执行平场校正，利用步骤 6.1.7.2 中获得的激发光源分布，消除因照明不均导致的位置依赖性荧光强度变化。
      注意：位于位置 (x,y) 的探针的荧光强度 I(x,y) 通过 图像处理方程，I(x,y) → I(x,y)/p(x,y)，用于数据归一化，示意图。 进行校正；参见 图 1C,D。
    3. 计算表观 FRET 效率 Eapp（即从供体荧光团传递至受体荧光团的能量比例）和表观化学计量比 Sapp（即一个衍射极限斑点内供体荧光团数量与总荧光团数量之比）。
      注意：通过绘制每个数据点的 E 与 S 关系图，可区分由供体-受体距离变化引起的 FRET 效率改变与由化学计量比变化引起的改变18。这使得能够区分因染料分离导致的 E = 0 与因缺乏活性受体导致的 E = 0。E-S 图在整个分析过程中用作质量评估工具；示例见 图 4。
    4. 对光漂白进行逐步分析，以区分单分子探针与聚集体。请选择以下任一选项。
      注意：为此，分析软件分别对供体激发下的荧光强度（IDD + IDA）和受体激发下的荧光强度（IAA）应用自定义实现的变点检测算法 PELT3732。
      1. 选择选项 1：受体荧光团以单步方式漂白，而供体无部分漂白（即不存在漂白至非零强度的步骤）。
        注意：此选项进一步排除供体在受体之前以单步方式漂白的轨迹。当受体光漂白速率较高时，建议优先选择选项 1。
      2. 选择选项 2：供体荧光团以单步方式漂白，而受体无部分漂白。
        注意：此选项进一步排除供体在受体之后以单步方式漂白的轨迹。当供体光漂白速率较高时，建议优先选择选项 2。
      3. 选择选项 3：任一荧光团以单步方式漂白，而另一荧光团无部分漂白。
        注意：选项 3 比选项 1 和 2 更具灵活性，建议作为数据分析的首选。
      4. 选择选项 4：供体和受体荧光团均表现为单步光漂白或完全无光漂白。
        注意：当光漂白速率较低时，建议优先选择选项 4。
    5. 计算供体发射泄漏至受体通道的校正因子 α、直接受体激发的校正因子 δ、探测效率 γ 以及激发效率 β17。
    6. 利用上述校正因子，由表观效率 Eapp 计算 FRET 效率 E，并由表观化学计量比 Sapp 计算实际化学计量比 S。
    7. 执行进一步的过滤步骤。仅选择每条轨迹中首次漂白事件之前的数据点。此外，仅保留至少 75% 的数据点满足 0.35 < S < 0.6 的轨迹，以将分析限制在单分子探针范围内（数值可调）。
      注意：上下限应根据目标群体与需排除群体（如仅含供体或仅含受体的群体）的分布情况来选择。根据经验，对于许多实验情况，0.35 < S < 0.6 是一个合理的选择。
    8. 通过对适当的辅助图像（见步骤 2.2.1 和 6.1.7）采用全局或自适应阈值法进行图像分割35，将分析限制在视野内的特定区域。
      ​注意：这允许例如仅对位于细胞-支持脂双层（SLB）界面或图案化结构上的探针进行评估。

9. 结果绘图与进一步分析 (03. Plot.ipynb)

注意：Jupyter 笔记本的截图及函数调用参数说明请参见补充信息。

  1. 创建 E-S 图以验证已正确识别并去除非正确化学计量比的信号。
  2. 绘制FRET效率的直方图，以提供FRET效率分布的成熟概览。将直方图分组，便于比较不同实验的结果。
  3. 在笔记本中利用科学Python库进一步分析数据（例如扩散分析、在使用分子力传感器的实验中将FRET效率转换为力，或进行转换分析）。
    注意：数据也可导出为多种文件格式，作为其他分析软件的输入。

结果

根据实验的科学问题，可以从单分子FRET轨迹中提取多种低级和高级信息。本文分别介绍了使用模拟探针和数字探针的分析流程示例：基于肽的分子力传感器16和具有构象随机切换的DNA探针38。有关这些探针的设计和工作原理，请参见图5。

在按照本方案所述执行定位和追踪算法后，该软件包提供了多种数据可视化工具，用于优化初始参数及后续的过滤步骤：（i）单个单分子FRET事件的可视化，（ii）可选的图像分割功能，用于分析特定感兴趣区域内的数据，（iii）通过FRET效率与化学计量比（E-S）图监控过滤步骤。单分子数据的可视化结果如图6所示。

最后，经过筛选的FRET事件通过E-S图和FRET效率直方图表示（图4）。E-S图是优化上述筛选步骤并分析最终结果的有用工具。部分漂白或标记不完全的FRET探针可通过其化学计量值予以排除。通过在x-y图（图6）或均方位移（MSD）图（图4）中绘制单个轨迹路径，可分析其运动特性。前者特别适用于区分可移动事件与固定事件，而后者用于计算扩散系数。

化学计量效率的图示分析、MSD 与滞后时间、显微镜数据比较。
图 4：典型输出结果。（A）分子力传感器群体在玻璃支撑的脂双层上分布，并受到 T 细胞牵拉，其荧光共振能量转移效率（FRET 效率）相对于化学计量比作图（E-S 图，左图）。仅可见一个群体云。相应的 FRET 效率直方图展示了有细胞与无细胞条件下力传感器群体之间的差异（中图）。在 T 细胞存在时，传感器群体的 FRET 效率未出现向较低值的偏移，表明传感器模块几乎未发生依赖于力的拉伸。在这些实验条件下，均方位移（MSD）图证实了位于 T 细胞下方的力传感器群体比未结合的对应物移动显著更慢（右图）。（B）使用霍利迪交叉 DNA 传感器修饰的玻璃支撑流动脂双层进行了相同的分析。E-S 图清晰显示了两个群体，这在 FRET 效率直方图中也明显可见。MSD 图表明存在一个快速移动的传感器群体。缩写：FRET = Förster 共振能量转移；MSD = 均方位移。请点击此处查看该图的放大版本。

力作用下T细胞受体激活的FRET分析；示意图显示低FRET与高FRET状态。
图5：分子内FRET探针的设计与工作原理。（A）用于量化分子机械力的模拟肽传感器。供体和受体荧光基团共价连接在肽骨架的两端。传感器模块位点特异性地连接到特定配体上，该配体进一步结合细胞表面的目标受体（此处为特异性识别T细胞受体β链的抗体片段）。在受体-配体结合后，力被施加，传感器模块伸展，并在键断裂后最终回缩。此图板修改自16。（B）用于量化FRET转换的数字DNA传感器。FRET传感器由四条DNA链组成，形成一个霍利迪交叉结构（Holliday junction）。供体和受体荧光基团共价连接在其中两条链上。霍利迪交叉结构会根据周围缓冲液条件频繁切换其构象。这些构象的随机切换可通过量化单个探针的FRET效率进行监测。缩写：TCR = T细胞受体；FRET = Förster共振能量转移。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞成像、轨迹、强度图、效率、化学计量分析的FRET分析示意图。
图6：FRET探针定位与追踪的示例。（A）通过定量供体激发下供体荧光团的强度（D → D）、供体激发下受体荧光团的强度（D → A）以及受体激发下受体荧光团的强度（A → A），计算单个事件的FRET效率和化学计量比。最近邻滤波可防止邻近发射体点扩散函数重叠带来的偏差。图像分割允许用户选择定位于特定区域（例如细胞或微图案）内的单分子FRET事件。作为图像分割的一个示例，T细胞用Fura-2染色（左侧显示），并进行自适应阈值处理以识别细胞边缘（橙色虚线）。比例尺 = 5 µm。（B）使用分子力传感器的单分子FRET轨迹。可在x-y平面上绘制单个轨迹，以可视化其扩散行为和定位（左图）。此外，还可将每个轨迹的强度随时间变化作图，以识别FRET转换或漂白步骤（中图显示左图中的红色轨迹）。所得的FRET效率和化学计量比也可类似地可视化（右图）。（C）使用Holliday junction DNA传感器的单分子FRET轨迹。测量过程中使用HBSS + 12 mM MgCl2作为缓冲液。除这些示例序列末端附近明显的受体漂白步骤外，还可确定每种传感器的FRET转换频率。Holliday junction构象转换频率较高，而分子力传感器则不表现出FRET转换。该信息可用于调整实验条件（例如帧间延迟），以增加或减少观察到的转换次数。缩写：FRET = Förster共振能量转移；smFRET = 单分子FRET；HBSS = Hank's平衡盐溶液。请点击此处查看该图的放大版本。

补充信息：单分子定位与追踪（01. Tracking.ipynb）。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文详细介绍了一种用于自动记录和定量分析来自可移动但表面固定的探针分子的单分子FRET（smFRET）数据的流程。该方法补充了smFRET实验中两种主流技术：一种是探针分子固定在表面，另一种是探针分子在溶液中进出共聚焦激发体积并发生扩散17。该流程可提供随时间变化的正确FRET效率及分子位置信息，因此可作为专门分析程序的输入数据，例如用于量化构象转换动力学1、FRET直方图39或二维扩散行为22。

该软件在开放源代码促进会（Open Source Initiative）批准的免费开源许可下发布，授予用户永久免费使用、修改和重新分发的权利。选择 GitHub 作为开发与分发平台，旨在使用户能够尽可能便捷地获取软件，并通过报告漏洞或贡献代码的方式参与开发过程40。软件采用 Python 编写，不依赖任何专有组件。选用 Jupyter 笔记本作为用户界面，便于在分析的每一步检查数据，并可根据具体实验系统对分析流程进行定制和扩展。sdt-python 库32 作为基础，实现了荧光显微镜数据的多种分析功能，包括单分子定位、扩散分析、荧光强度分析、多色通道配准、共定位分析以及感兴趣区域（ROI）处理。

原则上，单颗粒示踪可在一维、二维或三维系统中进行。本文中的单分子分析流程专为研究二维移动系统而设计。这一选择反映了可利用简单的体系，例如平面支撑脂双层（SLB），以呈现可移动的荧光探针。这类脂双层体系通常由两种或多种磷脂分子组成，其中主要组分决定SLB的关键理化参数（如相态和黏度），而次要组分则提供生物分子的结合位点。这些结合位点可以是生物素化的磷脂，用于构建亲和素（avidin）或链霉亲和素（streptavidin）介导的蛋白质平台；也可以是镍-NTA偶联的磷脂，用于结合带有组氨酸标签的蛋白质平台41。选择何种平台将蛋白质连接至SLB，取决于具体的科学问题。读者可参考相关文献16,38,42，了解已成功应用的策略实例。样品中探针的密度应足够低，以避免点扩散函数重叠；通常建议每平方微米（µm2）的分子数少于0.1个。参见代表性结果部分（特别是图6），以了解合适的探针密度示例。该分析方法同样适用于活细胞质膜中单个荧光标记蛋白质分子的扩散研究。

单分子FRET实验的一个关键方面是FRET探针本身的制备与表征。在选择FRET荧光对时，其福斯特半径应与预期的染料间距离相匹配43。应优先选用抗光漂白的染料，因为它们能够产生较长的时间轨迹。然而，当光漂白速率较高时，可通过逐步光漂白分析，利用其中一种荧光团来识别来自共定位分子的多发射体事件；详见方案部分的步骤8.1.4。荧光团对应特异性地共价连接至目标分子的特定位置，形成分子内或分子间FRET对。

将单分子FRET（smFRET）与其他现有技术相结合，可使其空间分辨率突破衍射极限（例如通过STED44）。本文介绍的smFRET追踪算法扩展了该方法在新实验条件和模型系统中的适用性。这包括对以下方面的研究：（i）移动生物分子化学计量比的动力学变化；（ii）移动生物分子的动态结合；（iii）自由扩散反应物的酶促反应速率；以及（iv）移动生物分子构象变化的动力学。前两个示例需要展示分子间FRET的模型系统，即供体和受体分别标记在不同的目标生物分子实体上。后两个示例则可利用在同一分子实体内携带供体和受体的生物传感器（分子内FRET）。

基于分子内FRET的传感器可揭示生物分子的内在构象变化1,2,3,4，由内源性或外源性力载荷引起的构象变化（分子力传感器）16），或纳米微环境中离子浓度（如钙离子）45 和 pH46根据模型系统和首选的锚定平台，此类单分子FRET事件可在二维或三维中进行追踪：（i）单分子FRET事件的平面追踪可用于量化质膜内受体-配体相互作用时间、膜锚定信号放大级联的关联以及表面受体的化学计量比变化；（ii）单分子FRET事件的体积追踪可用于活细胞内或体外任何分子内或分子间FRET探针 体外 重建系统

单分子FRET追踪方法的开发主要针对分子内FRET探针。这类探针具有固定且明确数量的荧光标记，这一特性被用于排除来自聚集分子、合成错误（例如标记不完全）的分子，以及其中一种荧光团已发生光漂白的探针的数据。然而，通过调整过滤步骤，该方法也可应用于分子间FRET探针。例如，不再仅接受含有单一供体和单一受体荧光团的分子，而是可以分析供体与受体染料的空间轨迹，并选择共扩散的供体-受体轨迹进行研究。

由于3D-DAOSTORM算法支持通过发射光路中柱面透镜引起的像散来确定信号在光轴方向上的位置，因此可轻松将三维实验整合到分析流程中。在此情况下，受体激发时的受体信号可用于确定化学计量比和轴向位置。该分析软件还可通过其高度自动化的处理和过滤方案，用于评估探针固定化实验的数据。事实上，已有研究使用该软件的早期版本分析了固定在凝胶相双层膜上的Holliday junction的单分子FRET效率数据38。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由奥地利科学基金（FWF）项目 P30214-N36、P32307-B 以及维也纳科学与技术基金（WWTF）项目 LS13-030 资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-[(N-(5-氨基-1-羧基戊基)亚氨基二乙酸)琥珀酰]（镍盐）(Ni-NTA-DOGS)Avanti Polar Lipids790404P
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱 (DOPC)Avanti Polar Lipids850375P
1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱 (POPC)Avanti Polar Lipids850457P
α Plan-FLUAR 100x/1.45 油镜Zeiss000000-1084-514
Axio Observer 显微镜机身Zeiss
带通滤光片Chroma Technology CorpET570/60m供体发射滤光片
带通滤光片Chroma Technology CorpET675/50m受体发射滤光片
conda-forgeconda-forge 社区Anaconda/miniconda 的社区维护 Python 软件包仓库
盖玻片 60 mm × 24 mm #1.5MENZEL
二向色镜Semrock IncFF640-FDi01-25×36分离供体与受体发射光
二向色镜（四通道）Semrock IncDi01-R405/488/532/635-25×36分离激发光与发射光
DPBSSigma-AldrichD8537
FCSSigma-AldrichF7524用于成像缓冲液
fret-analysisSchütz 团队（维也纳工业大学）单分子 FRET 数据分析 Python 软件包；版本 3
Fura-2 AMThermo Fisher Scientific11524766
HBSSSigma-AldrichH8264用于成像缓冲液
iBeam Smart 405-S 405 nm 激光器Toptica Photonics AG
iXon Ultra 897 EMCCD 相机Andor Technology Ltd
Lab-Tek 培养皿（8 孔）Thermo Fisher Scientific177402PK用于样品制备与成像
Millenia Prime 532 nm 激光器Spectra Physics
minicondaAnaconda Inc.Python 3 发行版，最低版本要求：3.7
单价链霉亲和素（用于细菌表达的质粒）Addgene20860 & 20859
OBIS 640 nm 激光器Coherent Inc1185055
Optosplit IICairn Research
卵清蛋白Sigma-AldrichA5253用于成像缓冲液
等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-002
sdt-pythonSchütz 团队（维也纳工业大学）数据分析 Python 库；版本 17
TetraSpek 微球尺寸试剂盒Thermo Fisher ScientificT14792随机分布、固定的定位标记，用于图像配准
USC500TH 超声波清洗仪VWR用于 SUV 制备

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