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从小鼠视网膜中分离内皮细胞用于下一代测序

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DOI：

10.3791/63133

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2021年10月11日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种用于分离小鼠出生后视网膜内皮细胞的方法，该方法在细胞得率、纯度和活力方面均经过优化。这些细胞适用于下一代测序技术。

摘要

新一代测序技术的近期进展极大地推动了研究人员对分子与细胞生物学的认识，多项研究揭示了血管生物学中的新范式。将这些方法应用于血管发育模型的研究，需要优化从胚胎及出生后组织中分离细胞的技术。为了从新一代测序方法中获得准确且可重复的结果，细胞得率、活力和纯度均需达到最大化。新生小鼠视网膜血管化模型被研究人员广泛用于研究血管发育的机制。该模型已被用于探究血管生成以及血管形成与成熟过程中动静脉命运决定的机制。将新一代测序技术应用于视网膜血管发育模型的研究，需要优化一种视网膜内皮细胞分离方法，以最大化细胞得率、活力和纯度。本方案描述了一种利用荧光激活细胞分选（FACS）对小鼠视网膜组织进行分离、消化和纯化的方法。结果表明，经FACS纯化的CD31+/CD45-内皮细胞群体中内皮细胞相关基因表达高度富集，且分选后60分钟内细胞活力无明显变化。本文还提供了采用该方法分离的内皮细胞进行新一代测序的代表性结果，包括批量RNA测序和单细胞RNA测序，证明该视网膜内皮细胞分离方法适用于新一代测序应用。该视网膜内皮细胞分离方法将有助于利用先进的测序技术揭示血管发育的新机制。

引言

核酸测序的高通量能力 通过 下一代测序技术极大地推动了研究人员对分子与细胞生物学的认识。这些先进技术包括全转录组RNA测序、靶向DNA区域测序以鉴定单核苷酸多态性（SNPs）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）中对结合的转录因子进行DNA测序、转座酶可及染色质检测测序（ATAC-seq）中对开放染色质区域进行DNA测序，以及单细胞RNA测序1在血管生物学领域，这些进展使研究人员能够阐明发育和疾病中复杂的机制，并区分出不同表型连续变化过程中的基因表达模式2,3未来的实验可通过将下一代测序技术与已评估的血管发育模型相结合，进一步阐明复杂的机制，但样品制备方法需与先进的测序技术相兼容。

新一代测序技术的质量、准确性和可重复性取决于样本制备方法。在从组织中分离特定细胞亚群或制备单细胞悬液时，最佳的消化和纯化方法对于最大化细胞数量、细胞活力以及细胞群体的纯度至关重要4,5。这要求在消化方法上取得平衡：较强的消化作用对于从组织中释放细胞并获得足够数量的细胞以进行后续实验是必要的，但如果消化过度，则会对细胞活力产生负面影响6,

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方案

耶鲁大学和弗吉尼亚大学的机构动物护理和使用委员会已批准本方案中列出的所有动物实验。

1. 获取小鼠眼球以分离视网膜

  1. 配制1×预冷PBS，向48孔板的每孔中加入500 μL。
  2. 按照批准的机构指南在出生后第6天（P6）处死新生小鼠。本实验中，每窝约4-8只新生小鼠在P6处死 通过 吸入异氟烷至少三分钟直至呼吸停止，随后进行断头术。
  3. 将每只小鼠的眼球取出。使用解剖剪沿垂直于眼睑的方向剪开眼球表面的皮肤和膜。然后用镊子轻轻按压眼球上方和下方，使眼球脱离眼窝。
    1. 用镊子轻轻夹住眼睛下方，剪断连接眼球的视神经。随后，将每只眼球放入已准备好的含1×冰冷PBS的48孔板中，待所有眼球采集完毕。
      注意：每只小鼠使用一个孔，同一只小鼠的两只眼睛置于同一孔中。

2. 分离小鼠视网膜组织

  1. 在培养皿底部铺上解剖垫，并加入 500 μL 冰冷的 1× PBS，使眼睛完全浸没，然后将培养皿置于解剖显微镜下，放大倍数设为 4.0×。
    1. 使用带宽口的移液器将眼睛悬浮于解剖垫上，避免损伤眼睛。
      注意：确保眼睛完全被 PBS 覆盖。

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结果

视网膜组织经消化并进行CD31和CD45免疫染色后，在对细胞、单细胞及活细胞设门分析后，可识别出一群明显的CD31+/CD45-内皮细胞（图2A）。必须进行CD45免疫染色以排除CD31+/CD45+细胞，后者包括血小板和部分白细胞21。每次实验均应设置对照，以验证抗体特异性并指导设门策略（图2B）。该细胞群比例相对较低，约占消化后单细胞悬液中所有细胞的0.5%-1.0%。

可通过碘化丙啶染色定量和对从不同细胞群分离的RNA进行基因表达分析，评估细胞的存活率和纯度。不同的消化时间会影响细胞得率和存活率百分比，其中20分钟的消化时间可获得最佳得率，且死细胞比例较低（内皮细胞存活率高）（图3A）。分离的内皮细胞在分离后60分钟内仍保持存活状态，后续通过碘化丙啶染色检测证实（图3B）。通过qPCR分析内皮.......

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讨论

本方案描述了一种从小鼠出生后视网膜组织中分离内皮细胞的方法，该方法已优化以获得高细胞数量、高纯度和高活性。通过CD31+/CD45-免疫染色，利用流式细胞术（FACS）从消化后的单细胞悬液中分离内皮细胞群体，从而获得细胞纯度。通过台盼蓝染色检测细胞活性，以及通过qPCR检测CD31、CD45和VE-钙黏蛋白（VE-Cadherin）的基因表达（尽管VE-钙黏蛋白未用于免疫染色）来定量评估分离质量。本方案的关键步骤为视网膜组织的分离和组织消化。视网膜组织分离应迅速进行，以维持细胞活性，并确保操作准确以提高细胞纯度。组织消化应按照所述方法进行，以优化细胞得率和细胞活性。

当将本方案应用于不同时间点、转基因小鼠或不同下游应用时，可对本方案进行相应修改。在研究成年小鼠视网膜组织时，这一点尤为重要，因为成年组织可能比P6阶段的视网膜组织更为成熟，需要更长的消化时间才能分离出纯净且具有活性的内皮细胞。修改方案时，必须优化视网膜组织的分离条件和消化时间。细胞得率低时，可能需要更换新鲜的消化酶、延长消化时间或使用新的FACS抗体。纯度低时，可能需要更换FACS抗体。活性低时，可能需要加快视网膜组织.......

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披露

作者无相关披露信息。

致谢

感谢耶鲁大学流式细胞术中心、弗吉尼亚大学流式细胞术核心实验室、耶鲁大学基因组分析中心以及弗吉尼亚大学基因组分析与技术核心实验室在本研究实验中所提供的努力、专业知识和建议。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号如下：N.W.C.（T32 HL007224、T32 HL007284），S.C.（T32 HL007284），K.W.（R01 HL142650），以及 K.K.H.（R01 HL146056、R01 DK118728、UH3 EB025765）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2 mL Eppendorf 安全锁扣管USA Scientific4036-3352
带细胞筛网 snap-cap 的 5 ml Falcon 试管Corning352235
60 mm 非 TC 处理培养皿Corning430589
APC 大鼠抗小鼠 CD31BD Biosciences551262
APC 大鼠 IgG2a κ 同型对照BD Biosciences553932
BD FACSChorus 软件BD BiosciencesFACSCHORUS
BD FACSMelody 细胞分选仪BD BiosciencesFACSMELODY
II 型胶原酶Sigma-Aldrich234115
Costar 48 孔透明 TC 处理多孔板，独立包装，无菌Corning3548
D-葡萄糖GibcoA2494001
一次性刻度移液管Fisher Scientific12-711-9AM
解剖盘蜡Carolina629100
解剖剪刀Fine Science Tools14085-08
解剖体视显微镜 M165 FCLeicaM165FC
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco11965-052
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190144
Eppendorf Flex-Tubes 微量离心管 1.5 mLSigma-Aldrich22364120
胎牛血清（FBS）Gemini Bio100-106
精细解剖镊Fine Science Tools11250-00
亨克氏平衡盐溶液（HBSS）Gibco14175095
HEPES（1M）Gibco15630130
iScript cDNA 合成试剂盒Bio-Rad1708890
异氟烷，USPCovetrus11695067772
Isotemp 通用精密水浴锅Fisher ScientificFSGPD20
引物：ActB_Forward：5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
引物：ActB_Reverse：5’- caatagtgatgacctggccgt -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
引物：CD31_Forward：5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
引物：CD31_Reverse：5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
引物：CD45_Forward：5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
引物：CD45_Reverse：5’- ctggacggacacagttagca -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
引物：VE-Cadherin_Forward：5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
引物：VE-Cadherin_Reverse：5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’Integrated DNA TechnologiesN/A
碘化丙啶Sigma-AldrichP4864
RNeasy Plus Mini 试剂盒Qiagen74134
Sorvall Legend Micro 21R 冷冻离心机ThermoFisher75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5120
台盼蓝溶液ThermoFisher15250061
V450 大鼠抗小鼠 CD45BD Biosciences560501
V450 大鼠 IgG2b，κ 同型对照BD Biosciences560457

参考文献

  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59(2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine<....

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标签

RNA CD31 CD45 RNA

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