本文介绍了一种标准化的蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型，通过血管内细丝穿刺法诱导，并在术后24小时结合磁共振成像（MRI）以确认出血部位准确，并排除其他相关的颅内病理改变。
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方法文章
蛛网膜下腔出血的血管内穿孔模型结合磁共振成像（MRI）
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
通过血管内丝线穿孔法模拟蛛网膜下腔出血（SAH）是一种常用的动物模型，但该技术可能导致较高的死亡率，并引发不可控的SAH出血量以及其他颅内并发症，如脑卒中或颅内出血。本实验方案介绍了一种标准化的SAH小鼠模型，采用血管内丝线穿孔法诱导SAH，并在术后24小时结合7.0 T磁共振成像（MRI）检查，以确认出血部位准确，并排除其他相关颅内病理改变。简言之，C57BL/6J小鼠通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（70 mg/16 mg/kg体重）进行麻醉，仰卧位固定。经颈部正中切口暴露颈总动脉（CCA）及颈动脉分叉处，将5-0不可吸收单丝聚丙烯缝合线逆行插入颈外动脉（ECA），并沿颈总动脉推进。随后将丝线经颈内动脉（ICA）进入，并向前推送以穿破大脑前动脉（ACA）。术后小鼠恢复后，在24小时时接受7.0 T MRI检查。通过术后MRI可对出血体积进行量化和分级，从而建立稳定的实验性SAH组，并可根据出血量进一步开展亚组分析。
引言
蛛网膜下腔出血（SAH）由颅内动脉瘤破裂引起，是一种危及生命的急症，具有较高的致残率和死亡率，约占所有脑卒中病例的5%1,2。SAH患者表现为剧烈头痛、神经功能障碍以及意识状态进行性恶化3。约30%的SAH患者在初次出血事件后的30天内死亡4。临床上，50%的患者在早期脑损伤之后出现迟发性脑损伤（DBI）。DBI的特征是迟发性脑缺血和迟发性神经功能缺损。目前研究表明，多种不同因素的协同作用导致神经功能丧失，包括血脑屏障破坏、小动脉收缩、微循环功能障碍以及血栓形成5,6。
蛛网膜下腔出血（SAH）的一个独特之处在于，其发病机制起源于脑实质外部位，但随后引发脑实质内的有害级联反应：病理过程始于血液在蛛网膜下腔的积聚，进而触发多种脑实质内效应，例如神经炎症、神经元和内皮细胞凋亡、皮层扩布性去极化以及脑水肿形成7,8。
临床研究受到多种因素的限制，因此动物模型在持续且准确地模拟疾病病理机....
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方案
实验按照德国柏林州卫生与社会事务局（Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, LaGeSo）制定的指南和规定进行（批准号：G0063/18）。本研究使用8至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠，体重为25 ± 0.286 g（平均值 ± 标准误）。
1. 动物准备
- 通过腹腔注射氯胺酮（70 mg/kg）和赛拉嗪（16 mg/kg）诱导麻醉。维持正常体温，有助于快速进入深度麻醉状态。通过疼痛刺激（如脚趾夹捏）测试镇静程度，并确认无反应。
- 用剃刀小心剃除小鼠颈部毛发，依次用70%乙醇和聚维酮碘/氯己定清洁皮肤，并在皮肤表面涂抹1%利多卡因以实现局部镇痛。
- 将小鼠置于仰卧位，用胶带固定四肢和尾巴，轻轻将颈部皮肤向手术对侧拉伸，同时轻微抬高颈部。
- 使用眼科软膏（例如5%泛醇）防止术中眼球脱水。
2. 蛛网膜下腔出血（SAH）诱导
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结果
死亡率
本研究共对92只8至12周龄的雄性C57Bl/6J小鼠进行了蛛网膜下腔出血（SAH）手术；其中观察到总体死亡率为11.9%（n = 12）。死亡事件均发生在术后6至24小时内，提示围手术期死亡以及SAH出血本身是最可能的致死因素。
SAH出血分级
共有50只小鼠在术后24小时接受MRI检查，以确认SAH并检测其他可能同时发生的病理状况，包括亚急性缺血性卒中和脑积水。其余动物用于更早期的扫描，以确定术后MRI检查的最佳时间点。在术后24小时检查的50只小鼠中，有n=7只未出现SAH（出血等级0），以及n=5只小鼠被检测到合并卒中和/或脑内出血（出血等级IV）。SAH出血等级根据T2加权MRI扫描结果进行量化，如下所示（图2A，B）：
0级：未发现蛛网膜下腔出血或出血（14%）
I级：蛛网膜下腔出血厚度≤0.80 mm（24%）
I.......
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讨论
综上所述，本研究建立了一种通过血管内细丝穿孔法诱导的标准化蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型，该模型具有创伤小、手术时间短和死亡率可接受的优点。术后24小时进行磁共振成像（MRI）检查，以确认出血部位准确，并排除其他相关颅内病变。此外，我们对不同SAH出血等级进行了分类，并测量了出血量，从而可根据出血等级进行进一步的亚组分析。
小鼠的适当体位会影响穿刺成功与否。应将小鼠颈部稍向手术对侧拉伸，头部略抬高，以暴露三分叉处，使穿刺路径更易于接近。若导丝前进受阻，可将其稍许回撤至三分叉处，并调整头部位置，直至导丝能无阻力地顺利推进。
术中神经保护至关重要。迷走神经和颈丛的损伤可能导致呼吸和心率节律改变，部分小鼠甚至可能因恶性心律失常而死亡。若出现上述症状，必须暂停操作数分钟，直至呼吸和心率稳定。
减少术中失血对于提高小鼠存活率至关重要。根据我们的经验，双重结扎应尽可能靠近颈外动脉（ECA）进行。我们在两个结扎点之间的中段切断ECA，以防止远端ECA残端的血液反流。当将线栓插入ECA.......
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致谢
SL 由中国国家留学基金管理委员会资助。KT 由柏林健康研究所（Berlin Institute of Health）的 BIH-MD 奖学金和 Sonnenfeld-Stiftung 基金会资助。RX 由柏林健康研究所-夏里特临床科学家项目（BIH-Charité Clinician Scientist Program）资助，该项目资金来自夏里特-柏林大学医学中心（Charité - Universitätsmedizin Berlin）和柏林健康研究所（Berlin Institute of Health）。我们感谢德国研究基金会（DFG）以及夏里特-柏林大学医学中心开放获取出版基金对本研究的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 眼霜 | Bayer | 815529836 | Bepanthen |
| 图像分析软件 | ImageJ | 捆绑 Java 1.8.0_172 | |
| 结扎缝线（5-0） | SMI | 黑色丝线 USP | |
| 显微镜光源 | Zeiss | CL 6000 LED | |
| 氯胺酮 | CP-pharma | 797-037 | 100 mg/mL |
| 磁共振成像仪 | Bruker | Pharmascan 70/16 | 7 Tesla |
| 磁共振成像采集软件 | Bruker | Bruker Paravision 5.1 | |
| 对乙酰氨基酚（40 mg/mL） | bene Arzneimittel | 4993736 | |
| 普理灵缝线（5-0） | Erhicon | EH7255 | |
| 剃刀 | Wella | HS61 | |
| 手术器械（精细剪刀） | FST | 14060-09 | |
| 手术器械（镊子#1） | AESCULAP | FM001R | |
| 手术器械（镊子#2） | AESCULAP | FD2855R | |
| 手术器械（镊子#3） | Hammacher | HCS 082-12 | |
| 手术器械（持针器） | FST | 91201-13 | |
| 手术器械（Vannas弹簧剪） | FST | 15000-08 | |
| 手术显微镜 | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| 通气监测系统 | Stony Brook | Small Animal Monitoring & Gating System | |
| 伤口缝合线（4-0） | Erhicon | CB84D | |
| 赛拉嗪 | CP-pharma | 797-062 | 20 mg/mL |
参考文献
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
- van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. The Lancet. 369 (9558), 306-318 (2007).
- Abraham, M. K., Chang, W. -T. W.
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重印与许可
