使用活细胞显微镜测量扩散过程中的细胞边缘突起动力学

摘要

该协议旨在测量扩散细胞边缘突起的动态参数（突起，缩回，褶皱）。

摘要

多细胞生物的发育和稳态依赖于细胞迁移的协调调节。细胞迁移是组织构建和再生中必不可少的事件，对胚胎发育、免疫反应和伤口愈合至关重要。细胞运动失调会导致病理障碍，如慢性炎症和癌症转移。细胞迁移、组织侵袭、轴突和枝晶生长均以肌动蛋白聚合介导的细胞边缘突起开始。在这里，我们描述了一种简单，高效，省时的方法，用于在扩散过程中对细胞边缘突起动力学进行成像和定量分析。该方法测量细胞边缘膜动力学的离散特征，例如突起，缩回和褶皱，并可用于评估关键肌动蛋白调节剂的操作如何在不同情况下影响细胞边缘突起。

引言

细胞迁移是控制所有生物体发育和功能的关键过程。细胞迁移发生在生理条件下，如胚胎发生，伤口愈合和免疫反应，以及病理条件，如癌症转移和自身免疫性疾病。尽管参与不同迁移事件的细胞类型存在差异，但所有细胞运动事件都具有相似的分子机制，这些机制在从原生动物到哺乳动物的进化中是保守的，并且涉及常见的细胞骨架控制机制，这些机制可以感知环境，响应信号并响应调节细胞行为¹。

细胞迁移的初始阶段可能是在细胞的前缘形成高度动态的突起。在薄片后面，人们可以找到薄片，它将肌动蛋白与肌球蛋白II介导的收缩力耦合，并介导对底层底物的粘附。薄片由生长因子、细胞因子和细胞粘附受体等细胞外刺激诱导，并由肌动蛋白聚合驱动，肌动蛋白聚合提供推动质膜前进的物理力^2，3。许多信号传导和结构蛋白与此有关;其中包括Rho GTPases，它与其他信号协调作用以激活肌动蛋白调节蛋白，例如Arp 2/3复合物，WASP家族蛋白以及Lamellipodia中的Formin和Spire家族的成员^2，4，5。

除了肌动蛋白聚合外，肌球蛋白II活性还需要在薄片和前薄片上产生收缩力。这些收缩，也被定义为细胞边缘缩回，也可能是细胞外围树突状肌动蛋白解聚的结果，对于发育薄片前缘和允许突起感知细胞外基质和其他细胞的灵活性并确定迁移方向至关重要^6，7，8.不能附着在基质上的细胞边缘突起将形成外周膜褶皱，片状结构，出现在薄片和薄片的腹面上，并相对于迁移方向向后移动。当薄片未能附着在基板上时，在其下方形成后薄片，并机械地将第一个薄片推向上腹面。褶皱中以前与基质平行的肌动蛋白细丝现在变得垂直于它，并且褶皱现在位于前进的薄片上方。向后移动的褶皱落回细胞质基质中，代表了回收薄片肌动蛋白的细胞机制^9，10。

在这里，我们描述了一种用于测量细胞边缘突起动力学的测定方法。突起测定使用延时视频显微镜在细胞扩散阶段测量单细胞边缘突起动力学10分钟。通过从这些电影中生成运动记录仪来分析突出动力学。原则上，运动记录仪在时空图中提供移动粒子的详细定量数据，以对细胞边缘动力学进行定性理解。在时间与空间图中为所有图像堆栈绘制移动粒子的强度，其中 X 轴和 Y 轴分别表示时间和距离¹¹。该方法使用带有ImageJ的手动运动记录仪分析来获得详细的定量数据，从而能够在低信噪比和/或高特征密度的情况下从电影和图像中检索信息，并分析在相差光学显微镜下获得的图像或图像质量差。

本文所述的细胞边缘突起动力学测定是一种快速、简单且经济高效的方法。因此，并且由于它已被证明与细胞迁移直接相关^11，12，因此在决定执行更多资源要求的方法之前，它可以用作测试细胞运动中涉及的细胞骨架动力学的初步方法。此外，它还能够定量测量细胞骨架蛋白的遗传操作（敲除，敲低或拯救构建体）如何使用简单的平台影响细胞骨架动力学。该测定是探索细胞迁移背景下细胞骨架动力学的指导性模型，可用于阐明细胞运动背后的机制和分子。

方案

该协议中描述的所有方法均已获得巴伊兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意:本节中描述的过程的分步图形描述如图 1 所示。

1. 细胞培养

注意:该协议中使用的细胞是从野生型C57BL / 6小鼠的E11.5-13.5胚胎产生的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。初级 MEF 是根据 Jacks 实验室协议生成的¹³。将来自五个不同胚胎的细胞汇集在一起，并通过感染表达SV40大T抗原的逆转录病毒载体进行永生化，然后用4mM组氨酸选择3周。

1. 在含有1g / L葡萄糖，1%谷氨酰胺，1%青霉素 - 链霉素和10%胎牛血清（FBS）的组织培养板中培养细胞（见 材料表），在37°C下具有5%CO ₂ 的加湿培养箱中培养细胞。
2. 培养细胞直到90%-95%汇合，并以每2-3天1:5的比例分裂。

2. 玻璃底碟形镀膜

注意:无菌条件下，应在组织培养罩中进行玻璃底皿涂层。

1. 在玻璃底培养皿（材料表）的中心加入2mL 1N HCl溶液，并在室温（RT）下孵育20分钟。
   注:此载物台旨在清除玻璃上的残留物，这些残留物可能会在以后中断成像。
2. 用2 mL 1x PBS（材料表）洗涤玻璃底皿三次。
3. 将纤连蛋白（见 材料表）稀释至10μg/mL，加入1x PBS。将200μL稀释的纤连蛋白溶液加入培养皿的玻璃中心。在37°C（组织培养箱）下孵育1小时。
   注意:或者，玻璃底培养皿可以在平坦的表面上在4°C下孵育过夜。
4. 在纤连蛋白涂层孵育期间，在1x PBS中制备1%BSA（材料表）溶液，过滤0.2μm，并通过在预热的水浴中在70°C下孵育30分钟而变性。
5. 将镀膜玻璃底培养皿洗涤三次，每次2 mL，每次1x PBS。
6. 向玻璃中心加入2mL变性BSA溶液，并在37°C（组织培养箱）下孵育1小时。
   注意:或者，玻璃底培养皿可以在平坦的表面上在4°C下孵育过夜。
7. 用2 mL 1x PBS洗涤玻璃底培养皿3次。
   注意:在37°C下，用纤连蛋白孵育玻璃底培养皿至少1小时，以正确涂覆表面。较短的孵育时间可能无法产生适当的包衣，因此，细胞表型可能与整合素活化无关。BSA层是惰性的，不会影响突出动力学，旨在阻断整合素非依赖细胞粘附的自由潜在位点。BSA必须在包衣前变性，以防止其诱导细胞凋亡，从而影响细胞边缘动力学。

3. 制备用于成像的细胞

1. 实验前16至18小时，将细胞接种至第二天达到70%-80%汇合。对于MEF，在进行实验前一天每10厘米直径的组织培养板0.7×10 ⁶ 个细胞。
   注意:对于成功的突出实验，重要的是细胞将在对数生长阶段使用。为了实现这一点，细胞应该在实验当天达到70%-80%的汇合度。细胞密度越高，在实验过程中会导致更长的扩散时间和/或附着障碍。
2. 在实验当天，每10厘米直径的组织培养板加入2mL胰蛋白酶溶液（材料表），并在组织培养箱中孵育2-3分钟，直到细胞分离。通过加入5mL完整培养基使胰蛋白酶失活。
3. 使用血细胞计数器计数细胞，并将20，000个细胞加入2mL完整培养基中，涂覆在上面的玻璃底培养皿上（第2节）。
   注:电镀的电池数量取决于电池的大小和类型。对于更大或更多的扩散细胞，仅板10，000个细胞以具有足够的细胞用于成像。选择不接触的单个细胞很重要，因为细胞间接触会改变细胞内在的扩散行为。
4. 在组织培养箱中用电镀细胞孵育玻璃底培养皿15分钟。
   注意:在这个阶段，细胞粘附在纤连蛋白底物上并扩散到其上。当测量细胞扩散过程中的突起时，应允许细胞在接种后和成像前扩散15分钟。成像可以在接种后15分钟至~1小时之间的时间窗口内进行，并且在任何情况下，在细胞开始迁移之前进行。

4. 显微镜设置和成像

注:有各种活细胞显微镜系统可供选择。这里使用的系统是一台徕卡AF6000倒置显微镜，配备了_CO2 和加热单元，并连接到ORCA-Flash 4.0 V2数码CMOS相机。

1. 在成像前至少1小时打开加热装置，并将其设置为37°C。
2. 在成像前至少10分钟打开_CO2 装置，并将其设置为5%_CO2。
3. 打开显微镜、照相机和计算机。
4. 打开显微镜采集软件（见 材料表）。选择要保存捕获图像的文件夹并键入文件名。将每部电影另存为新文件。
5. 在40倍干式镜头上设置放大倍率，相衬。将时间间隔设置为5秒，总电影时长10分钟。
6. 在接种细胞孵育15分钟后，将带有粘附细胞的玻璃底培养皿放入适配器中并固定。将带有培养皿的适配器插入显微镜载物台的插槽中。
7. 取下碟形盖，改为放置 _CO2 盖。打开 _CO2 阀。
   注意:在将 CO2 盖放在玻璃底盘的顶部之前，请确保 _CO2 盖板是干净的。肮脏的封面会降低电影的质量。用浸泡有70%乙醇的无绒湿巾擦拭_CO2 盖的底部，以去除灰尘和污垢。用无绒干擦拭巾擦拭第二次。
8. 查看细胞并找到适合成像的细胞。确保单元格处于焦点中并开始电影采集。

5. 图像分析

注:使用ImageJ（材料表）执行图像分析，如下所示:

1. 在 ImageJ 中打开获取的影片。
2. 使用主工具栏中的 "直线 "工具，以每 45° 的径向排列，使 8 条直线（每条直线 20 个任意单元）垂直于突起，包括薄片和单元边缘，如图 2A 所示。
3. 在主工具栏中，转到 "图像>堆栈>"重新许可"。这将产生运动记录仪图像，该图像描述了细胞膜内单个点的运动（图2B）。应分别对八行中的每一行执行此操作。
4. 从各自的运动记录仪图像中提取并手动计数单元格中八个区域中每个区域的突起，缩回和褶皱的数量，由网格线标记。这些数字表示每10分钟突出，收缩和褶皱的频率（图2C，D）。
   注意:褶皱可以根据其在相差显微镜中的深色外观及其向心运动与其他结构区分开来，其从细胞边缘开始，在细胞体的边界结束，这可以在获得的电影中观察到。值得注意的是，在量化突出、缩回和褶皱频率时，应观察电影作为量化的控制，特别是定义褶皱的对照。
5. 通过关节影像学分析确定突出物的持久性、距离和速度。对于每个生成的运动记录仪，X 轴表示距离，Y 轴表示时间。
6. 要测量突出距离，请执行步骤 5.6.1-5.6.2。
   1. 绘制一条从突起底部到突起最高峰的垂直线。在 ImageJ 中按 M 以像素为单位测量线的长度。
   2. 要将长度从像素转换为μm，请确保像素与μm的比率是已知的。
      注:μm与像素比是CCD相机上像素的物理长度/总放大倍率。像素大小是每种类型的相机的特征。例如，对于本研究中使用的相机，像素尺寸为6.5μm x 6.5 μm，物理长度为6.5 μm，我们使用的放大倍率为40x。因此，我们相机的μm与像素比为0.1625μm/像素。在分析中，对于长度为 30 像素的线，突出距离为 30 像素 x 0.1625 μm/像素 = 4.875 μm（图 3）。
7. 要测量突出时间（持久性;突出物在缩回之前突出的时间），请按照步骤 5.7.1-5.7.2 进行操作。
   1. 绘制一条从突出部分的开始（从左到右）到最高峰区域的水平线。在 ImageJ 中按 M 以像素为单位测量线的长度。
   2. 要将长度从像素转换为分钟，请计算像素与最小比率。此值取决于图像之间的间隔。
      注意:在此示例中，图像之间的间隔为 5 秒，最小/像素比率为 0.0833，水平线长度为 8 像素。因此，突出时间为 8 像素 x 0.0833 分钟/像素 = 0.6664 分钟。
8. 测量和计算缩回时间，类似于在突出部分底部水平绘制的线的伸缩时间，从突出物的峰值到右侧的底部（ 图 3 中的 X2 线）。
9. 通过将突出距离除以突出时间来计算突出速度。通过将突出距离除以缩回时间来计算收缩速度。在本例中，突出速度计算为4.875 μm/0.6664 min = 7.315 μm/min.，并且缩回速度相同，因为表示时间的线长度相同。
   注意:在比较不同的细胞类型时，即表达野生型的细胞和相同蛋白质的突变体构建体，必须进行盲法分析，因此不会引入偏倚。

结果

在 图2中描述的实验中，将永生的MEF镀在预先涂有纤连蛋白的玻璃底培养皿上，以激活被变性BSA阻断的整合素介导的信号传导，以阻断细胞粘附的游离潜在位点，该位点不依赖于整合素活化。为了在实验当天达到70%-80%细胞汇合处的对数生长阶段，在实验前¹⁶ 小时将0.7×106 MEF接种在直径为10cm的组织培养板中。在实验当天，将细胞进行胰蛋白酶消化并计数，并将20，000个细胞接种在纤连蛋白/ BSA涂层的玻璃底培养皿上。将培养皿在37°C下孵育15分钟，以允许细胞在成像前附着和扩散。孵育后，将板置于显微镜培养箱室（37°C，5%CO ₂）中，并使用相光下的40x干透镜对单细胞进行成像。在细胞开始迁移之前，在接种后15分钟至1小时之间进行成像。每5秒采集一次图像，持续10分钟，每个细胞产生121张图像（补充电影1）。

使用ImageJ执行图像分析。使用主工具栏中的"直线"工具，在所有单元格中，每 45 度在相同位置...

讨论

细胞边缘突出动力学，包括突起，缩回和褶皱，既是细胞运动的先决条件，也是潜在的限速事件。在这里，我们描述了一种快速而简单的方法，用于测量扩散过程中细胞边缘突起的动态。该方法可实现短时间成像，生成大量数据，不需要细胞的荧光标记或昂贵的荧光显微镜设备，并且可以用作在决定执行更多资源要求的方法之前测试细胞运动中涉及的细胞骨架动力学的初步方法。此外，可以在该测定中使用敲除或敲低细胞和/或蛋白质突变体作为快速简单的工具来鉴定细胞骨架动力学中涉及的关键蛋白质和潜在信号传导机制。

值得注意的是，选择正确的细胞进行突出分析非常重要。在获得电影之前，将细胞孵育15分钟以允许扩散。如果决定在传播过程中测量突起（而不是在迁移过程中测量突起），则只应对电影采集期间处于扩散阶段的细胞进行成像。未开始扩散的细胞不适合进行kymography分析。完成扩散阶段但未开始移动的细胞（图4）也不适合分析。它们的细胞核的运动可以区分这些细胞:在扩散过程中，细胞核是静止的，而在细胞迁移过程中，细胞核是动态的，并定位于细胞的后侧，以构建一个前缘 - 中心体 - 核轴...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 细胞培养板	Greiner	P7612-360EA
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Biological Industries， Israel	01-055-1A	含有高葡萄糖（4.5 g/L D-葡萄糖）
Dulbecco' 的培养基磷酸盐缓冲盐水 （1xDPBS）	以色列生物工业	02-023-1A
胎牛血清 （FBS）	以色列生物工业	04-001-1A
来自人血浆的纤连蛋白，液体，0.1%，适用于细胞培养	Sigma-Aldrich	F0895
玻璃底培养皿	Cellvis	D35-20-1.5-N	35 mm 玻璃底培养皿，培养皿尺寸 35 mm，孔尺寸 20 mm，#1.5 盖玻片 （0.16-0.19 mm）。
ImageJ 软件	NIH		Feely 可从以下位置获得： https://imagej.nih.gov/ij/download.html
ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS	LAS-AF 徕卡应用程序套件 3.2
徕卡 AF6000	徕卡		倒置明场显微镜（40x，NA 1.3），配备相差光学元件、培养箱和 CO2 装置，配备 LAS AF 采集软件ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机 .
L-谷氨酰胺溶液	以色列生物工业	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机	滨松光子
青霉素-链霉素溶液	以色列生物工业	03-031-1B
胰蛋白酶-EDTA 溶液 B （0.25%）、EDTA （0.05%）	以色列生物工业	03-052-1A