使用活细胞显微镜测量扩散过程中的细胞边缘突起动力学

摘要

该协议旨在测量扩散细胞边缘突起的动态参数（突起，缩回，褶皱）。

摘要

多细胞生物的发育和稳态依赖于细胞迁移的协调调节。细胞迁移是组织构建和再生中必不可少的事件，对胚胎发育、免疫反应和伤口愈合至关重要。细胞运动失调会导致病理障碍，如慢性炎症和癌症转移。细胞迁移、组织侵袭、轴突和枝晶生长均以肌动蛋白聚合介导的细胞边缘突起开始。在这里，我们描述了一种简单，高效，省时的方法，用于在扩散过程中对细胞边缘突起动力学进行成像和定量分析。该方法测量细胞边缘膜动力学的离散特征，例如突起，缩回和褶皱，并可用于评估关键肌动蛋白调节剂的操作如何在不同情况下影响细胞边缘突起。

引言

细胞迁移是控制所有生物体发育和功能的关键过程。细胞迁移发生在生理条件下，如胚胎发生，伤口愈合和免疫反应，以及病理条件，如癌症转移和自身免疫性疾病。尽管参与不同迁移事件的细胞类型存在差异，但所有细胞运动事件都具有相似的分子机制，这些机制在从原生动物到哺乳动物的进化中是保守的，并且涉及常见的细胞骨架控制机制，这些机制可以感知环境，响应信号并响应调节细胞行为¹。

细胞迁移的初始阶段可能是在细胞的前缘形成高度动态的突起。在薄片后面，人们可以找到薄片，它将肌动蛋白与肌球蛋白II介导的收缩力耦合，并介导对底层底物的粘附。薄片由生长因子、细胞因子和细胞粘附受体等细胞外刺激诱导，并由肌动蛋白聚合驱动，肌动蛋白聚合提供推动质膜前进的物理力^2，3。许多信号传导和结构蛋白与此有关;其中包括Rho GTPases，它与其他信号协调作用以激活肌动蛋白调节蛋白，例如Arp 2/3复合物，WASP家族蛋白以及Lamellipodia中的Formin和Spire家族的成员^2，4，5。

除了肌动蛋白聚合外，....

方案

该协议中描述的所有方法均已获得巴伊兰大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意:本节中描述的过程的分步图形描述如图 1 所示。

1. 细胞培养

注意:该协议中使用的细胞是从野生型C57BL / 6小鼠的E11.5-13.5胚胎产生的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）。初级 MEF 是根据 Jacks 实验室协议生成的¹³。将来自五个不同胚胎的细胞汇集在一起，并通过感染表达SV40大T抗原的逆转录病毒载体进行永生化，然后用4mM组氨酸选择3周。

1. 在含有1g / L葡萄糖，1%谷氨酰胺，1%青霉素 - 链霉素和10%胎牛血清（FBS）的组织培养板中培养细胞（见 材料表），在37°C下具有5%CO ₂ 的加湿培养箱中培养细胞。
2. 培养细胞直到90%-95%汇合，并以每2-3天1:5的比例分裂。

2. 玻璃底碟形镀膜

注意:无菌条件下，应在组织培养罩中进行玻璃底皿涂层。

结果

在 图2中描述的实验中，将永生的MEF镀在预先涂有纤连蛋白的玻璃底培养皿上，以激活被变性BSA阻断的整合素介导的信号传导，以阻断细胞粘附的游离潜在位点，该位点不依赖于整合素活化。为了在实验当天达到70%-80%细胞汇合处的对数生长阶段，在实验前¹⁶ 小时将0.7×106 MEF接种在直径为10cm的组织培养板中。在实验当天，将细胞进行胰蛋白酶消化并计数，并将20，000个细胞接种在纤连蛋白/ BSA涂层的玻璃底培养皿上。将培养皿在37°C下孵育15分钟，以允许细胞在成像前附着和扩散。孵育后，将板置于显微镜培养箱室（37°C，5%CO ₂）中，并使用相光下的40x干透镜对单细胞进行成像。在细胞开始迁移之前，在接种后15分钟至1小时之间进行成像。每5秒采集一次图像，持续10分钟，每个细胞产生121张图像（补充电影1）。

使用ImageJ执行图像分析。使用主工具栏中的"直线"工具，在所有单元格中，每 45 度在相同位置.......

讨论

细胞边缘突出动力学，包括突起，缩回和褶皱，既是细胞运动的先决条件，也是潜在的限速事件。在这里，我们描述了一种快速而简单的方法，用于测量扩散过程中细胞边缘突起的动态。该方法可实现短时间成像，生成大量数据，不需要细胞的荧光标记或昂贵的荧光显微镜设备，并且可以用作在决定执行更多资源要求的方法之前测试细胞运动中涉及的细胞骨架动力学的初步方法。此外，可以在该测定中使用敲除或敲低细胞和/或蛋白质突变体作为快速简单的工具来鉴定细胞骨架动力学中涉及的关键蛋白质和潜在信号传导机制。

值得注意的是，选择正确的细胞进行突出分析非常重要。在获得电影之前，将细胞孵育15分钟以允许扩散。如果决定在传播过程中测量突起（而不是在迁移过程中测量突起），则只应对电影采集期间处于扩散阶段的细胞进行成像。未开始扩散的细胞不适合进行kymography分析。完成扩散阶段但未开始移动的细胞（图4）也不适合分析。它们的细胞核的运动可以区分这些细胞:在扩散过程中，细胞核是静止的，而在细胞迁移过程中，细胞核是动态的，并定位于细胞的后侧，以构建一个前缘 - 中心体 - 核轴.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 细胞培养板	Greiner	P7612-360EA
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco's 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	Biological Industries， Israel	01-055-1A	含有高葡萄糖（4.5 g/L D-葡萄糖）
Dulbecco' 的培养基磷酸盐缓冲盐水 （1xDPBS）	以色列生物工业	02-023-1A
胎牛血清 （FBS）	以色列生物工业	04-001-1A
来自人血浆的纤连蛋白，液体，0.1%，适用于细胞培养	Sigma-Aldrich	F0895
玻璃底培养皿	Cellvis	D35-20-1.5-N	35 mm 玻璃底培养皿，培养皿尺寸 35 mm，孔尺寸 20 mm，#1.5 盖玻片 （0.16-0.19 mm）。
ImageJ 软件	NIH		Feely 可从以下位置获得： https://imagej.nih.gov/ij/download.html
ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS	LAS-AF 徕卡应用程序套件 3.2
徕卡 AF6000	徕卡		倒置明场显微镜（40x，NA 1.3），配备相差光学元件、培养箱和 CO2 装置，配备 LAS AF 采集软件ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机 .
L-谷氨酰胺溶液	以色列生物工业	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机	滨松光子
青霉素-链霉素溶液	以色列生物工业	03-031-1B
胰蛋白酶-EDTA 溶液 B （0.25%）、EDTA （0.05%）	以色列生物工业	03-052-1A