本方案旨在测量铺展细胞边缘突起的动态参数（突起、回缩、皱褶）。
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方法文章
利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
多细胞生物的发育与稳态依赖于细胞迁移的协调调控。细胞迁移在组织构建与再生过程中至关重要，是胚胎发育、免疫应答以及伤口愈合中的关键事件。细胞运动性的失调可导致慢性炎症和癌症转移等病理性疾病。细胞迁移、组织侵袭、轴突和树突的生长均始于由肌动蛋白聚合介导的细胞边缘突起。本文介绍一种简单、高效且节省时间的方法，用于成像并定量分析细胞铺展过程中的细胞边缘突起动态。该方法可测量细胞边缘膜动态的离散特征，如突起、回缩和皱褶，并可用于评估在不同条件下对关键肌动蛋白调控因子的操作如何影响细胞边缘突起。
引言
细胞迁移是一个关键过程，调控所有生物体的发育和功能。细胞迁移既发生在生理条件下，如胚胎发生、伤口愈合和免疫应答，也发生在病理条件下，如癌症转移和自身免疫性疾病。尽管参与不同迁移事件的细胞类型存在差异，但所有细胞运动事件都具有相似的分子机制，这些机制在从原生动物到哺乳动物的进化过程中高度保守，并涉及共同的细胞骨架调控机制，能够感知环境、响应信号，并相应地调节细胞行为1。
细胞迁移的初始阶段可能是细胞前缘形成高度动态的突起。在片状伪足后方可以观察到细胞内侧区域（lamella），该区域将肌动蛋白与肌球蛋白II介导的收缩性相偶联，并介导细胞与下方基质的黏附。片状伪足可由多种胞外刺激诱导产生，例如生长因子、细胞因子以及细胞黏附受体，其形成主要依赖于肌动蛋白的聚合，这种聚合提供了推动质膜向前运动的物理力量2,3。许多信号转导蛋白和结构蛋白均参与了这一过程，其中Rho GTP酶与其他信号协同作用，激活诸如Arp 2/3复合物、WASP家族蛋白以及Formin和Spire蛋白家族成员等调控肌动蛋白的蛋白，在片状伪足中发挥功能2,4,5。
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方案
本方案中描述的所有方法均已获得巴伊兰大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
注意：本节所述步骤的逐步图示见图1。
1. 细胞培养
注意：本实验方案中使用的细胞为来自野生型 C57BL/6 小鼠 E11.5-13.5 胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。初级 MEFs 的制备参照 Jacks 实验室的实验方案13。来自五个不同胚胎的细胞被混合后，通过感染表达 SV40 大 T 抗原的逆转录病毒载体进行永生化，并用 4 mM 组氨醇筛选 3 周。
- 在含有 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），并添加 1 g/L 葡萄糖、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 10% 胎牛血清（FBS）的组织培养板中培养细胞（参见材料表），于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中进行培养。
- 将细胞培养至 90%–95% 汇合度，每 2–3 天以 1:5 的比例传代一次。
2. 玻底培养皿包被
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结果
在图2所述实验中，将永生化的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种于预先包被纤连蛋白的玻璃底培养皿中，以激活整合素介导的信号通路，并用变性BSA封闭，从而阻断不依赖于整合素活化的细胞黏附潜在位点。为使实验当天细胞达到对数生长期且融合度为70%-80%，在实验前16小时将0.7 × 106个MEFs接种于直径10 cm的组织培养皿中。实验当天，用胰蛋白酶消化细胞并计数后，将20,000个细胞接种至经纤连蛋白/BSA包被的玻璃底培养皿中。将培养皿在37 °C条件下孵育15分钟，以允许细胞贴附和铺展，随后开始成像。孵育结束后，将培养皿置于显微镜孵育腔（37 °C，5% CO2）中，使用40倍干镜在相差光下对单个细胞进行成像。在接种后15分钟至1小时之间、细胞开始迁移之前进行成像。每5秒采集一次图像，持续10分钟，共获得每个细胞121帧图像（补充视频1）。
使用 ImageJ 进行图像分析。在主工具栏中使用直线工具，在所有细.......
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讨论
细胞边缘突出动态过程包含突出、回缩和皱褶，既是细胞运动的前提条件，也可能是其潜在的限速步骤。本文介绍一种快速且简便的方法，用于测量细胞铺展过程中细胞边缘突出的动态变化。该方法支持短时间成像，可产生大量数据，无需对细胞进行荧光标记或使用昂贵的荧光显微镜设备，可作为在决定开展更耗资源的方法前，检测细胞运动中细胞骨架动态变化的初步筛选手段。此外，本实验可利用基因敲除或基因沉默细胞和/或蛋白质突变体，作为一种快速简便的工具，识别参与细胞骨架动态的关键蛋白及潜在的信号传导机制。
值得注意的是，选择用于凸起分析的正确细胞非常重要。在开始采集图像前，需将细胞孵育15分钟，以使其充分铺展。如果研究目的是测量细胞铺展过程中的凸起（而非迁移过程中的凸起），则应仅对在成像期间仍处于铺展阶段的细胞进行成像。尚未开始铺展的细胞不适合用于线扫描分析。已完成铺展但尚未开始移动的细胞（图4）同样不适合用于分析。这些细胞可通过其细胞核的运动状态加以区分：在铺展过程中，细胞核保持静止；而在细胞迁移过程中，细胞核具有动态性，并定位在细胞后侧，形成朝向迁移方向的.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 MH115939、NS112121、NS105640 和 R56MH122449-01A1（资助对象：Anthony J. Koleske）以及以色列科学基金会（资助编号 1462/17 和 2142/21）（资助对象：Hava Gil-Henn）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 厘米细胞培养板 | Greiner | P7612-360EA | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM） | Biological Industries，以色列 | 01-055-1A | 培养基含高浓度葡萄糖（4.5 g/L D-葡萄糖） |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（1xDPBS） | Biological Industries，以色列 | 02-023-1A | |
| 胎牛血清（FBS） | Biological Industries，以色列 | 04-001-1A | |
| 人血浆来源纤连蛋白，液体，0.1%，适用于细胞培养 | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| 玻璃底培养皿 | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35 毫米玻璃底培养皿，皿直径 35 毫米，孔径 20 毫米，#1.5 盖玻片（0.16–0.19 毫米） |
| ImageJ 软件 | NIH | 可免费下载：https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica 应用套件 3.2 | 显微镜采集软件，配备 ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机 | ||
| Leica AF6000 | Leica | 倒置明场显微镜（40x，NA 1.3），配备相差光学系统、培养箱和 CO2 控制单元，搭载 LAS AF 采集软件及 ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机 | |
| L-谷氨酰胺溶液 | Biological Industries，以色列 | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机 | Hamamatsu Photonics | ||
| 青霉素-链霉素溶液 | Biological Industries，以色列 | 03-031-1B | |
| 胰蛋白酶-EDTA 溶液 B（0.25%），EDTA（0.05%） | Biological Industries，以色列 | 03-052-1A |
参考文献
- Kurosaka, S., Kashina, A. Cell biology of embryonic migration. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112<....
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重印与许可
