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方法文章

利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化

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DOI：

10.3791/63157

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2021年11月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 3Department of Neuroscience, Yale University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案旨在测量铺展细胞边缘突起的动态参数（突起、回缩、皱褶）。

摘要

多细胞生物的发育与稳态依赖于细胞迁移的协调调控。细胞迁移在组织构建与再生过程中至关重要，是胚胎发育、免疫应答以及伤口愈合中的关键事件。细胞运动性的失调可导致慢性炎症和癌症转移等病理性疾病。细胞迁移、组织侵袭、轴突和树突的生长均始于由肌动蛋白聚合介导的细胞边缘突起。本文介绍一种简单、高效且节省时间的方法，用于成像并定量分析细胞铺展过程中的细胞边缘突起动态。该方法可测量细胞边缘膜动态的离散特征，如突起、回缩和皱褶，并可用于评估在不同条件下对关键肌动蛋白调控因子的操作如何影响细胞边缘突起。

引言

细胞迁移是一个关键过程，调控所有生物体的发育和功能。细胞迁移既发生在生理条件下，如胚胎发生、伤口愈合和免疫应答，也发生在病理条件下，如癌症转移和自身免疫性疾病。尽管参与不同迁移事件的细胞类型存在差异，但所有细胞运动事件都具有相似的分子机制，这些机制在从原生动物到哺乳动物的进化过程中高度保守，并涉及共同的细胞骨架调控机制，能够感知环境、响应信号，并相应地调节细胞行为1。

细胞迁移的初始阶段可能是细胞前缘形成高度动态的突起。在片状伪足后方可以观察到细胞内侧区域（lamella），该区域将肌动蛋白与肌球蛋白II介导的收缩性相偶联，并介导细胞与下方基质的黏附。片状伪足可由多种胞外刺激诱导产生，例如生长因子、细胞因子以及细胞黏附受体，其形成主要依赖于肌动蛋白的聚合，这种聚合提供了推动质膜向前运动的物理力量2,3。许多信号转导蛋白和结构蛋白均参与了这一过程，其中Rho GTP酶与其他信号协同作用，激活诸如Arp 2/3复合物、WASP家族蛋白以及Formin和Spire蛋白家族成员等调控肌动蛋白的蛋白，在片状伪足中发挥功能2,4,5。

除了肌动蛋白聚合外，肌球蛋白II的活性对于在片状伪足和前侧板状区域产生收缩力也是必需的。这些收缩也被称为细胞边缘回缩，还可能由细胞周边树突状肌动蛋白的解聚引起，对于形成片状伪足前导边缘、使突起能够感知细胞外基质和其他细胞的柔韧性并决定迁移方向至关重要6,7,8。无法与基底附着的细胞边缘突起会形成周边膜皱褶，即出现在片状伪足和板状区域腹侧面的片状结构，并相对于迁移方向向后移动。当片状伪足未能与基底附着时，其下方会形成一个后侧片状伪足，机械性地将原先的片状伪足推向上方的腹侧面。皱褶中原本平行于基底的肌动蛋白纤维此时变为垂直于基底，使皱褶位于前进中的片状伪足之上。向后移动的皱褶最终回落至胞质中，代表了一种回收片状伪足肌动蛋白的细胞机制9,10。

本文介绍了一种用于测量细胞边缘突出动态的实验方法。该突出实验利用延时视频显微技术，在细胞铺展阶段持续10分钟，对单个细胞边缘的突出动态进行观测。通过这些视频生成明暗图（kymograph），以分析突出动态。原则上，明暗图可在时空图中提供运动颗粒的详细定量数据，从而定性地理解细胞边缘的动态行为。运动颗粒的强度在所有图像堆栈中被绘制于时间-空间图上，其中横轴和纵轴分别代表时间与距离11。本方法采用ImageJ软件进行手动明暗图分析，以获得详细的定量数据，能够在信噪比较低和/或特征密度较高时从视频和图像中提取信息，并适用于相差光学显微镜成像或图像质量较差的情况下的图像分析。

本文所述的细胞边缘突起动力学检测方法快速、简便且成本低廉。由于该方法已被证明与细胞迁移直接相关11,12，因此可在决定采用更耗资源的方法之前，作为检测细胞运动过程中细胞骨架动力学的初步筛选手段。此外，该方法还能够在简单易行的平台上，定量评估对细胞骨架蛋白进行遗传操作（如基因敲除、基因沉默或挽救型构建体）对细胞骨架动力学的影响。该检测方法为研究细胞迁移背景下的细胞骨架动力学提供了有益的模型，也可用于阐明细胞运动背后的分子机制及相关分子。

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方案

本方案中描述的所有方法均已获得巴伊兰大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。

注意：本节所述步骤的逐步图示见图1。

1. 细胞培养

注意：本实验方案中使用的细胞为来自野生型 C57BL/6 小鼠 E11.5-13.5 胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。初级 MEFs 的制备参照 Jacks 实验室的实验方案13。来自五个不同胚胎的细胞被混合后，通过感染表达 SV40 大 T 抗原的逆转录病毒载体进行永生化，并用 4 mM 组氨醇筛选 3 周。

  1. 在含有 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），并添加 1 g/L 葡萄糖、1% 谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素和 10% 胎牛血清（FBS）的组织培养板中培养细胞（参见材料表），于 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱中进行培养。
  2. 将细胞培养至 90%–95% 汇合度，每 2–3 天以 1:5 的比例传代一次。

2. 玻底培养皿包被

注意：玻璃底培养皿的包被应在组织培养罩内的无菌条件下进行。

  1. 在玻璃底培养皿（材料表）中央加入 2 mL 的 1N HCl 溶液，在室温（RT）下孵育 20 分钟。
    注意：此步骤旨在去除玻璃表面可能干扰后续成像的残留物。
  2. 用 2 mL 的 1× PBS（材料表）将玻璃底培养皿清洗三次，每次 2 mL。
  3. 将纤连蛋白（见 材料表）用 1× PBS 稀释至 10 µg/mL。取 200 µL 稀释后的纤连蛋白溶液加入培养皿的玻璃底部中央，在 37 °C（组织培养孵箱）孵育 1 小时。
    注意：也可将玻璃底培养皿在 4 °C 平面上过夜孵育。
  4. 在纤连蛋白包被孵育期间，用 1× PBS 配制 1% BSA（材料表）溶液，经 0.2 µm 滤膜过滤后，于预热的水浴中在 70 °C 下孵育 30 分钟以使其变性。
  5. 用 2 mL 的 1× PBS 将包被后的玻璃底培养皿清洗三次，每次 2 mL。
  6. 在玻璃底部中央加入 2 mL 变性后的 BSA 溶液，在 37 °C（组织培养孵箱）孵育 1 小时。
    注意：也可将玻璃底培养皿在 4 °C 平面上过夜孵育。
  7. 用 2 mL 的 1× PBS 将玻璃底培养皿清洗三次，每次 2 mL。
    ​注意：玻璃底培养皿与纤连蛋白的孵育应在 37 °C 下至少进行 1 小时，以确保表面充分包被。孵育时间过短可能导致包被不充分，从而使得细胞表型与整联蛋白激活无关。BSA 层为惰性层，不会影响细胞突起动力学，其作用是封闭非整联蛋白介导的细胞黏附的潜在结合位点。BSA 在包被前必须经过变性处理，以防止其诱导细胞凋亡，进而影响细胞边缘动力学。

3. 成像用细胞的制备

  1. 实验前16至18小时，接种细胞，使其在次日达到70%–80%的融合度。对于小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），在实验前一天，每10 cm直径的组织培养皿中接种0.7 × 106个细胞。
    注意：为了成功进行突起实验，必须在细胞的对数生长期使用。为此，实验当天细胞应达到70%–80%的融合度。细胞密度过高将导致更长的铺展时间，和/或在实验过程中影响贴附。
  2. 实验当天，每10 cm直径的组织培养皿中加入2 mL胰蛋白酶溶液（材料表），在组织培养孵育箱中孵育2–3分钟，直至细胞脱落。加入5 mL完全培养基以终止胰蛋白酶的消化作用。
  3. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将20,000个细胞接种于2 mL完全培养基中，置于如上文（第2节）所述包被的玻璃底培养皿中。
    注意：接种细胞数量取决于细胞的大小和类型。对于较大或更易铺展的细胞，仅接种10,000个细胞即可，以确保有足够的细胞用于成像。应选择不相互接触的单个细胞，因为细胞间的接触可能改变细胞固有的铺展行为。
  4. 将接种了细胞的玻璃底培养皿置于组织培养孵育箱中孵育15分钟。
    ​注意：在此阶段，细胞会黏附于纤连蛋白基质并在其上铺展。在测量细胞铺展过程中的突起时，接种后应让细胞铺展15分钟再开始成像。成像可在接种后15分钟至约1小时的时间窗口内进行，且必须在细胞开始迁移之前完成。

4. 显微镜设置与成像

注意：市面上有多种活细胞显微镜系统可供选择。本实验所使用的系统为配备 CO2 和加热装置的 Leica AF6000 倒置显微镜，并连接 ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机。

  1. 在成像前至少1小时打开加热装置，并将其设定为37 °C。
  2. 在成像前至少10分钟打开CO2装置，并将其设定为5% CO2。
  3. 打开显微镜、相机和计算机。
  4. 启动显微镜采集软件（参见材料表）。选择保存图像的文件夹并输入文件名。每次保存视频时均应使用新文件名。
  5. 将放大倍数设置为40倍干镜，相差模式。时间间隔设为5秒，总视频时长为10分钟。
  6. 细胞接种后孵育15分钟，将含有贴壁细胞的玻底培养皿放入适配器中并固定，然后将适配器连同培养皿插入显微镜载物台的对应插槽中。
  7. 取下培养皿盖，换上CO2专用盖，并打开CO2阀门。
    ​注意：在将CO2盖置于玻底培养皿上方之前，务必确保其清洁。脏污的盖子会降低视频质量。使用浸有70%乙醇的无尘擦拭布擦拭CO2盖的内表面以去除灰尘和污物，再用一块干燥的无尘擦拭布进行第二次擦拭。
  8. 观察细胞并选择适合成像的细胞。确保细胞处于焦点位置，然后开始视频采集。

5. 图像分析

注意：图像分析使用 ImageJ（材料表）按以下步骤进行：

  1. 在 ImageJ 中打开获取的视频文件。
  2. 使用主工具栏中的直线工具，以45°为间隔，在细胞突起（包括片状伪足和细胞边缘）周围呈放射状绘制八条相互垂直的直线，每条长度为20个任意单位，如图2A所示。
  3. 在主工具栏中，依次选择图像 > 图像栈 > 重新切片。此操作将生成一张显微运动图（kymograph），用于描述细胞膜内单个点的运动情况（图2B）。该操作需对八条直线分别独立执行。
  4. 从相应的显微运动图图像中，手动提取并统计细胞八个区域（由网格线标记）中突起、回缩和皱褶的数量。这些数值代表每10分钟内突起、回缩和皱褶的发生频率（图2C、D）。
    注意：在相差显微镜下，皱褶因其较暗的形态以及从细胞边缘开始并向细胞体边界进行的向心运动而可与其他结构区分开来，这些特征可在获取的视频中观察到。值得注意的是，在量化突起、回缩和皱褶频率时，应结合原始视频进行对照观察，尤其用于准确界定皱褶。
  5. 通过显微运动图分析确定突起的持续时间、距离和速度。对于每张生成的显微运动图，X轴表示距离，Y轴表示时间。
  6. 测量突起距离，请按步骤5.6.1–5.6.2进行：
    1. 从突起的基部向其最高点绘制一条垂直线。在 ImageJ 中按下 M 键，测量该线的像素长度。
    2. 为将像素长度转换为 μm，需已知像素与 μm 的换算比例。
      注意：μm 与像素的比值 = CCD 相机上单个像素的物理长度 / 总放大倍数。像素尺寸因相机类型而异。例如，本研究所用相机的像素尺寸为 6.5 μm × 6.5 μm，单个像素的物理长度为 6.5 μm，使用的放大倍数为 40 倍。因此，本相机的 μm/像素比值为 0.1625 μm/像素。在分析中，若某条线长度为 30 像素，则突起距离为 30 像素 × 0.1625 μm/像素 = 4.875 μm（图3）。
  7. 测量突起时间（即持续时间；指突起在回缩前持续延伸的时间），请按步骤5.7.1–5.7.2进行：
    1. 从突起起始处（从左至右）向其最高点区域绘制一条水平线。在 ImageJ 中按下M键，测量该线的像素长度。
    2. 为将像素长度转换为分钟，需计算像素与分钟的换算比例。该数值取决于图像采集的时间间隔。
      注意：在本示例中，图像采集间隔为 5 秒，因此 min/像素比值为 0.0833，水平线长度为 8 像素。因此，突起时间为 8 像素 × 0.0833 min/像素 = 0.6664 分钟。
  8. 回缩时间的测量与计算方法与突起时间类似，需在突起基部绘制一条水平线，从突起峰值位置向右延伸至其基部（即图3中的 X2 线），并进行相同处理。
  9. 通过将突起距离除以突起时间，计算突起速度；通过将突起距离除以回缩时间，计算回缩速度。在本示例中，突起速度为 4.875 μm / 0.6664 min = 7.315 μm/min；由于表示时间的线段长度相同，回缩速度亦相同。
    注意：在比较不同类型细胞（例如表达同一蛋白的野生型与突变型构建体的细胞）时，必须进行盲法分析，以避免引入偏倚。

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结果

在图2所述实验中，将永生化的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）接种于预先包被纤连蛋白的玻璃底培养皿中，以激活整合素介导的信号通路，并用变性BSA封闭，从而阻断不依赖于整合素活化的细胞黏附潜在位点。为使实验当天细胞达到对数生长期且融合度为70%-80%，在实验前16小时将0.7 × 106个MEFs接种于直径10 cm的组织培养皿中。实验当天，用胰蛋白酶消化细胞并计数后，将20,000个细胞接种至经纤连蛋白/BSA包被的玻璃底培养皿中。将培养皿在37 °C条件下孵育15分钟，以允许细胞贴附和铺展，随后开始成像。孵育结束后，将培养皿置于显微镜孵育腔（37 °C，5% CO2）中，使用40倍干镜在相差光下对单个细胞进行成像。在接种后15分钟至1小时之间、细胞开始迁移之前进行成像。每5秒采集一次图像，持续10分钟，共获得每个细胞121帧图像（补充视频1）。

使用 ImageJ 进行图像分析。在主工具栏中使用直线工具，在所有细...

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讨论

细胞边缘突出动态过程包含突出、回缩和皱褶，既是细胞运动的前提条件，也可能是其潜在的限速步骤。本文介绍一种快速且简便的方法，用于测量细胞铺展过程中细胞边缘突出的动态变化。该方法支持短时间成像，可产生大量数据，无需对细胞进行荧光标记或使用昂贵的荧光显微镜设备，可作为在决定开展更耗资源的方法前，检测细胞运动中细胞骨架动态变化的初步筛选手段。此外，本实验可利用基因敲除或基因沉默细胞和/或蛋白质突变体，作为一种快速简便的工具，识别参与细胞骨架动态的关键蛋白及潜在的信号传导机制。

值得注意的是，选择用于凸起分析的正确细胞非常重要。在开始采集图像前，需将细胞孵育15分钟，以使其充分铺展。如果研究目的是测量细胞铺展过程中的凸起（而非迁移过程中的凸起），则应仅对在成像期间仍处于铺展阶段的细胞进行成像。尚未开始铺展的细胞不适合用于线扫描分析。已完成铺展但尚未开始移动的细胞（图4）同样不适合用于分析。这些细胞可通过其细胞核的运动状态加以区分：在铺展过程中，细胞核保持静止；而在细胞迁移过程中，细胞核具有动态性，并定位在细胞后侧，形成朝向迁移方向的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 MH115939、NS112121、NS105640 和 R56MH122449-01A1（资助对象：Anthony J. Koleske）以及以色列科学基金会（资助编号 1462/17 和 2142/21）（资助对象：Hava Gil-Henn）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 厘米细胞培养板GreinerP7612-360EA
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7906
Dulbecco’s 改良 Eagle 培养基（DMEM）Biological Industries，以色列01-055-1A培养基含高浓度葡萄糖（4.5 g/L D-葡萄糖）
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（1xDPBS）Biological Industries，以色列02-023-1A
胎牛血清（FBS）Biological Industries，以色列04-001-1A
人血浆来源纤连蛋白，液体，0.1%，适用于细胞培养Sigma-AldrichF0895
玻璃底培养皿CellvisD35-20-1.5-N35 毫米玻璃底培养皿，皿直径 35 毫米，孔径 20 毫米，#1.5 盖玻片（0.16–0.19 毫米）
ImageJ 软件NIH可免费下载：https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica 应用套件 3.2显微镜采集软件，配备 ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机
Leica AF6000Leica倒置明场显微镜（40x，NA 1.3），配备相差光学系统、培养箱和 CO2 控制单元，搭载 LAS AF 采集软件及 ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机
L-谷氨酰胺溶液Biological Industries，以色列03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 数字 CMOS 相机Hamamatsu Photonics
青霉素-链霉素溶液Biological Industries，以色列03-031-1B
胰蛋白酶-EDTA 溶液 B（0.25%），EDTA（0.05%）Biological Industries，以色列03-052-1A

参考文献

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