一种大鼠Ross手术模型：同基因肺动脉移植物在体循环位置的植入

摘要

我们演示了如何建立将肺动脉根部植入降主动脉的小鼠模型，以模拟Ross手术。该模型可用于评估肺动脉自体移植物在体循环位置下的中长期重塑情况，为开发促进其适应性的治疗策略提供基础。

摘要

由于主动脉瓣疾病外科治疗的远期效果显著，Ross手术重新引起了人们的关注。然而，当采用自体肺动脉根部置换时，可能出现肺动脉自体移植物扩张及继发性主动脉瓣反流。已有多种动物模型被提出，但这些模型通常局限于离体（ex-vivo）模型或成本较高的大型动物体内（in-vivo）实验。本研究旨在建立一种将肺动脉移植物（PAG）植入体循环位置的啮齿类动物模型。共纳入39只成年Lewis大鼠。在供体动物（n=17）安乐死后立即获取其肺动脉根部。同基因受体大鼠（n=17）和假手术对照组大鼠（n=5）均接受镇静和机械通气。在受体组中，将PAG以端对端吻合方式植入肾下腹主动脉位置；假手术组大鼠仅接受主动脉横断后再吻合。所有动物在术后连续两个月内接受系列超声检查，并在实验终点进行组织病理学分析。PAG在原始位置的中位直径为3.20 mm（IQR=3.18–3.23）。随访期间，PAG的中位直径在术后1周为4.03 mm（IQR=3.74–4.13），1个月时为4.07 mm（IQR=3.80–4.28），2个月时为4.27 mm（IQR=3.90–4.35）（p<0.01）。收缩期峰值流速在术后1周为220.07 mm/s（IQR=210.43–246.41），1个月时为430.88 mm/s（IQR=375.28–495.56），2个月时为373.68 mm/s（IQR=305.78–429.81）（p=0.02），实验结束时与假手术组相比差异无统计学意义（p=0.5）。组织学分析未发现内皮血栓形成的迹象。本研究表明，啮齿类动物模型可用于评估肺动脉根部在高压循环系统中的长期适应性变化。同基因PAG在体循环位置的植入为开发和评估新的外科技术及药物治疗提供了一个简单且可行的平台，有助于进一步改善Ross手术的临床结果。

引言

先天性主动脉瓣狭窄是先天性心脏病的一个亚型，其特征为左心室流出道梗阻，且病变位于瓣膜水平。该畸形的发病率约为每1000例活产婴儿中有0.04至0.38例¹。

目前可用的矫正方法有很多，每种方法都有其各自的优缺点。对于适合进行双心室矫正的患者²，治疗策略可能包括瓣膜修复（经皮或手术瓣膜切开术）或瓣膜置换³。当主动脉瓣被认为无法修复时，通常优先选择后者；然而，儿科患者可用的选择十分有限。事实上，生物瓣膜由于在年轻人群中易发生早期钙化，因此不适用于主动脉瓣置换⁴。另一方面，机械瓣膜的退变速度明显较慢，但需要终身抗凝治疗⁵。此外，这些假体瓣膜最主要的问题在于缺乏生长潜力，这使得患者容易需要接受多次再次干预手术。

在儿科人群中，一种颇具前景的治疗选择是将肺动脉自体移植物转移至主动脉位置，该手术称为"Ross手术"。在此手术中，肺动脉瓣随后以同种异体移植物替代（图1）⁶。该术式可能是儿童最佳的外科治疗方案，因为肺动脉自体移植物可保留其生长潜能，且无需终身抗凝治疗。此外，Ros....

方案

所有实验程序均已获得帕多瓦大学动物护理委员会（OPBA，协议编号 n° 55/2017）批准，并由意大利卫生部授权（授权编号 n° 700/2018-PR），符合欧盟指令 2010/63/UE 以及意大利关于实验动物护理与使用的第 26/2014 号法律。

1. 动物护理与实验模型

1. 确保所有Lewis大鼠均来自同一家公司（材料表）。将大鼠饲养在普通设施中，并自由摄取食物和水。
2. 确保受体组大鼠体重在320–400 g之间，供体组大鼠体重在200–250 g之间。

2. 术前方案

注意：所有操作均须在洁净条件下进行。为进行同系移植，受体和供体均应使用雄性和雌性成年 Lewis 大鼠。

1. 手术前15分钟，按5 mg/kg剂量进行曲马多腹腔注射。
2. 手术前立即按5 mg/kg剂量单次肌肉注射庆大霉素。
3. 麻醉诱导时，将动物置于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）麻醉舱中，以1 L/min的氧气流速供给4%七氟烷；麻醉维持期间，全程以1 L/min的氧气流速供给2.0–2.5%七氟烷。
4. 使用剃刀沿中线剃毛，范围自胸骨起至生殖器上方1 cm处，宽度约2....

结果

本研究共纳入39只成年Lewis大鼠：其中17只作为PAG供体，17只作为受体，5只进行假手术操作（对照组）（表1）。雄性大鼠22只（56%），雌性17只（44%）；雌性仅用于供体组。

手术过程中未发生任何死亡事件，存活率为100%。在随访期间，移植组有两只动物死亡，分别发生在术后第12天和第51天；研究结束时的生存率为91%（表1）。

受体组大鼠的中位体重为387 g（四分位距，IQR，358–394 g），供体组为328 g（IQR=304–337 g）。术后一周，中位体重为363 g（IQR=350–376 g），较术前体重下降了6%。动物在随访的第一个月内恢复了体重（中位数387 g，IQR 369–392 g），两个月时的最终体重为397 g（IQR=391–402 g）（图2）。

移植组的中位随访时间为62.5天（IQR=60-68天.......

讨论

使用自体肺动脉瓣根部进行主动脉瓣置换（Ross手术）因其良好的性能和自体移植物潜在的生长能力，成为先天性主动脉瓣狭窄修复的一种理想选择¹⁰。该手术的主要局限在于新构建的主动脉瓣可能发生扩张，从而导致远期反流的发生。研究肺动脉在承受体循环压力后所发生的结构改变，可能为理解肺动脉自体移植物功能衰竭的机制提供基础。为此，我们建立了一种在啮齿类动物模型中将同基因肺动脉移植物植入体循环位置的实验模型

报道的手术技术安全、有效且可重复。所用动物体型较小，简化了手术及术后管理，使我们能够以有限的材料和动物成本获得一个有用的模型。选择Lewis大鼠是因为作为近交系，这些大鼠具有同基因性，其等位基因固定程度超过99%。因此，它们是研究动物间肺动脉瓣移植的合适模型。我们决定将研究终点设为两个月，因为文献数据显示人类与大鼠的天数比为1:11¹¹。因此，我们可以推测我们的随访时间相当于约五年，从而能够在中长期范围内评估PAG的适应情况。

我们最初的结果显示.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠	Monico SpA	AIC 030805105	两瓶 100 mL。冷藏的一瓶（4°C）用于冲洗供体器官；温热的一瓶（39°C）用于湿润和使受体再水化
7.5% 聚维酮碘	B Braun	AIC 032151211
Barraquer	Aesculap	FD 232R	直型显微血管吻合针持，用于血管吻合
Castroviejo 针持	无货	J 4065	用于关闭动物体腔
施夹钳	Rudolf Medical	RU 3994-05	用于夹闭血管夹
棉签	Johnson & Johnson Medical SpA	N/A	市售产品，已灭菌
弯头显微镊（珠宝镊）	Rudolf Medical	RU 4240-06	用于将缝线穿过血管下方
脱毛膏	RB healthcare	N/A	市售产品
电凝仪	LED SpA	Surton 200
精细剪刀	Rudolf Medical	RU 2422-11	用于打开受体动物腹腔
细尖弯头 Vannas 显微剪刀	Aesculap	OC 497R	仅用于制备肺动脉根部、剪断腰血管和 10/0 Prolene 缝线
Fluovac 异氟烷/氟烷废气清除装置	Harvard Apparatus Ltd	K 017041	包含麻醉机、麻醉管路、诱导舱和带可吸收滤芯的废气清除装置
庆大霉素	MSD Italia Srl	AIC 020891014	抗生素，单次剂量，术中肌内注射 5 mg/kg
肝素	Pharmatex Italia Srl	AIC 034692044	向受体动物腹腔静脉注入 500 IU
静脉导管	Smiths Medical Ltd	4036	20G
胰岛素注射器，1 mL	Fisher Scientific	14-841-33	用于向供体动物注射肝素，以及冲洗受体动物切断的主动脉
珠宝镊双极电凝钳	GIMA SpA	30665	尖端 0.25 mm，用于微小血管的电凝
Lewis 大鼠 (LEW/HanHsd)	Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy	86104M	雄性或雌性，体重 200–250 g（用于肺动脉根部供体）和 320–400 g（用于受体）
Micro-Mosquito 钳	Rudolf Medical	RU 3121-10	共四把，钳尖包覆硅胶管，用于在吻合过程中牵拉 Prolene 缝线
手术显微镜	Leica Microsystems	M 400-E	术中可切换 6×、10× 和 16× 放大倍数
Perma-Hand 丝线 2-0	Johnson & Johnson Medical SpA	C026D	用于提起主动脉
凡士林眼膏	Dechra	NDC 17033-211-38
Prolene 10-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W2790	极细不可吸收缝线，配 BV75-3 圆体针，用于血管吻合
牵开器	无	N/A	两个自制牵开器
环柄显微镊	Rudolf Medical	RU 4079-14	用于精细操作
七氟烷	AbbVie Srl	AIC 031841036	与氧气混合，用于吸入麻醉
弹簧式显微剪刀	Rudolf Medical	RU 2380-14	直型，长 14 cm
标准动脉瘤夹	Rudolf Medical	RU 3980-12	两个夹子（7.5 mm；180 g；1.77 N），用于夹闭主动脉
无纺布无菌纱布	Luigi Salvadori SpA	26161V	7.5×7.5 cm，四层
直型 Doyen 剪刀	Rudolf Medical	RU/1428-16	用于供体动物
直型显微镊（珠宝镊）	Rudolf Medical	RU 4240-04	长 10.5 cm，用于整个吻合过程
注射器	Artsana SpA	N/A	20 mL（用于供体动物）和 5 mL（用于受体动物），用于生理盐水冲洗和浸泡
TiCron 4-0	Covidien	CV-331	用于缝合肌肉和皮肤
V. Mueller 组织镊	McKesson	CH 6950-009	用于皮肤和肌肉操作
曲马多	SALF SpA	AIC 044718029	镇痛药，单次剂量，5 mg/kg 肌内注射
Virgin 丝线 8-0	Johnson & Johnson Medical SpA	W818	用于动脉分支结扎