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方法文章

一种大鼠Ross手术模型：同基因肺动脉移植物在体循环位置的植入

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DOI：

10.3791/63179

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2022年4月1日

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1Pediatric and Congenital Cardiac Surgery Unit, Department of Cardiac, Thoracic and Vascular Sciences and Public Health, University of Padua, 2Pediatric Cardiology Unit, Departments of Women’s and Children’s Health, University of Padua, 3Labatt Family Heart Centre, Department of Cardiovascular Surgery, The Hospital for Sick Children, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们演示了如何建立将肺动脉根部植入降主动脉的小鼠模型，以模拟Ross手术。该模型可用于评估肺动脉自体移植物在体循环位置下的中长期重塑情况，为开发促进其适应性的治疗策略提供基础。

摘要

由于主动脉瓣疾病外科治疗的远期效果显著，Ross手术重新引起了人们的关注。然而，当采用自体肺动脉根部置换时，可能出现肺动脉自体移植物扩张及继发性主动脉瓣反流。已有多种动物模型被提出，但这些模型通常局限于离体（ex-vivo）模型或成本较高的大型动物体内（in-vivo）实验。本研究旨在建立一种将肺动脉移植物（PAG）植入体循环位置的啮齿类动物模型。共纳入39只成年Lewis大鼠。在供体动物（n=17）安乐死后立即获取其肺动脉根部。同基因受体大鼠（n=17）和假手术对照组大鼠（n=5）均接受镇静和机械通气。在受体组中，将PAG以端对端吻合方式植入肾下腹主动脉位置；假手术组大鼠仅接受主动脉横断后再吻合。所有动物在术后连续两个月内接受系列超声检查，并在实验终点进行组织病理学分析。PAG在原始位置的中位直径为3.20 mm（IQR=3.18–3.23）。随访期间，PAG的中位直径在术后1周为4.03 mm（IQR=3.74–4.13），1个月时为4.07 mm（IQR=3.80–4.28），2个月时为4.27 mm（IQR=3.90–4.35）（p<0.01）。收缩期峰值流速在术后1周为220.07 mm/s（IQR=210.43–246.41），1个月时为430.88 mm/s（IQR=375.28–495.56），2个月时为373.68 mm/s（IQR=305.78–429.81）（p=0.02），实验结束时与假手术组相比差异无统计学意义（p=0.5）。组织学分析未发现内皮血栓形成的迹象。本研究表明，啮齿类动物模型可用于评估肺动脉根部在高压循环系统中的长期适应性变化。同基因PAG在体循环位置的植入为开发和评估新的外科技术及药物治疗提供了一个简单且可行的平台，有助于进一步改善Ross手术的临床结果。

引言

先天性主动脉瓣狭窄是先天性心脏病的一个亚型，其特征为左心室流出道梗阻，且病变位于瓣膜水平。该畸形的发病率约为每1000例活产婴儿中有0.04至0.38例1。

目前可用的矫正方法有很多，每种方法都有其各自的优缺点。对于适合进行双心室矫正的患者2，治疗策略可能包括瓣膜修复（经皮或手术瓣膜切开术）或瓣膜置换3。当主动脉瓣被认为无法修复时，通常优先选择后者；然而，儿科患者可用的选择十分有限。事实上，生物瓣膜由于在年轻人群中易发生早期钙化，因此不适用于主动脉瓣置换4。另一方面，机械瓣膜的退变速度明显较慢，但需要终身抗凝治疗5。此外，这些假体瓣膜最主要的问题在于缺乏生长潜力，这使得患者容易需要接受多次再次干预手术。

在儿科人群中，一种颇具前景的治疗选择是将肺动脉自体移植物转移至主动脉位置，该手术称为"Ross手术"。在此手术中，肺动脉瓣随后以同种异体移植物替代（图1）6。该术式可能是儿童最佳的外科治疗方案，因为肺动脉自体移植物可保留其生长潜能，且无需终身抗凝治疗。此外，Ross手术对于年轻成人同样具有重要价值，可避免使用机械瓣或生物瓣，有望成为最佳的外科治疗方案。

肺动脉自体移植用于主动脉瓣置换术后效果良好，生存率超过98%，且远期预后良好7。文献研究报道，术后4年和12年肺动脉同种异体移植物免于再次置换的比例分别为93%和90%8。

该手术方法的主要局限性在于自体移植物长期存在扩张倾向，尤其是作为独立的主动脉根部置换时。这可能导致瓣膜功能不全，从而需要再次干预。事实上，迄今为止最长随访时间的研究报告显示，自体移植物置换术后10年免于再次手术率为88%，20年免于再次手术率为75%9。

在实验条件下重现Ross手术的可能性是研究肺动脉自体移植物适应体循环压力潜在机制的基本前提。过去已提出多种模型，但这些模型通常受限于 离体 实验或 体内 动物模型中使用相对昂贵的大型动物成本较高。在本研究中，我们旨在建立一种将肺动脉移植物（PAG）作为独立主动脉根部植入体循环位置的啮齿类动物模型。

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方案

所有实验程序均已获得帕多瓦大学动物护理委员会（OPBA，协议编号 n° 55/2017）批准，并由意大利卫生部授权（授权编号 n° 700/2018-PR），符合欧盟指令 2010/63/UE 以及意大利关于实验动物护理与使用的第 26/2014 号法律。

1. 动物护理与实验模型

  1. 确保所有Lewis大鼠均来自同一家公司（材料表）。将大鼠饲养在普通设施中，并自由摄取食物和水。
  2. 确保受体组大鼠体重在320–400 g之间，供体组大鼠体重在200–250 g之间。

2. 术前方案

注意：所有操作均须在洁净条件下进行。为进行同系移植，受体和供体均应使用雄性和雌性成年 Lewis 大鼠。

  1. 手术前15分钟，按5 mg/kg剂量进行曲马多腹腔注射。
  2. 手术前立即按5 mg/kg剂量单次肌肉注射庆大霉素。
  3. 麻醉诱导时，将动物置于聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）麻醉舱中，以1 L/min的氧气流速供给4%七氟烷；麻醉维持期间，全程以1 L/min的氧气流速供给2.0–2.5%七氟烷。
  4. 使用剃刀沿中线剃毛，范围自胸骨起至生殖器上方1 cm处，宽度约2 cm；随后用碘溶液对皮肤进行消毒。
  5. 为防止动物在手术过程中受潮及热量散失，应用透明塑料薄膜覆盖动物体表。
  6. 在开始操作前，通过评估动物对有害刺激是否无反应来确认麻醉深度。

3. 供体手术

  1. 动物与心脏准备：
    1. 将麻醉后的动物置于软木托盘上，尾端朝向手术者。做一条长约5-6 cm的剑突至耻骨切口，并将两侧肌皮瓣向外侧牵开。
    2. 通过腹腔静脉注入1 mL含500 IU肝素的4 °C生理盐水溶液。
    3. 1分钟后，从左至右剪开膈肌，并行前侧开胸术以暴露心脏。
    4. 通过滴加4 °C生理盐水冷却跳动的心脏。
    5. 行心包切除术和胸腺切除术，以充分暴露主动脉弓。清除主动脉周围残留的脂肪组织。
    6. 在无名动脉起始处上方的主动脉弓处切断；同时切断该无名动脉。
    7. 剪开胸段下腔静脉（IVC），插入22 G套管，施加轻柔压力，用20–25 mL的4 °C生理盐水灌注心脏。当心脏停止跳动且主动脉流出液变清亮时，停止灌注。
  2. 肺动脉移植物（PAG）取材：
    注意：准确获取并轻柔处理肺动脉移植物（PAG）对于在受体中实现最佳植入至关重要。切勿直接用器械接触移植物，应使用棉签操作。
    1. 进行超声检查，评估肺动脉在其原位时的直径。
    2. 将微型镊子插入血管后壁下方，尽可能靠近其分叉处，使用显微剪刀切断血管，以最大限度保留PAG长度。
    3. 用带环状尖端的显微镊子轻轻夹持肺动脉，用显微弹簧剪刀将其与右心室分离。取下PAG，保留部分右心室肌组织。
  3. PAG制备：
    1. 将PAG置于手术台上浸有冷生理盐水的纱布上，在手术显微镜下检查血管。
    2. 切除多余的周围组织，仅保留1 mm的心室肌。将血管长度设定为5 mm。

4. 肺动脉移植物（PAG）植入

  1. 受体动物的准备：
    1. 将麻醉后的动物置于软木托盘上，尾部朝向手术者。
    2. 行正中纵切口，并使用两个小型拉钩保持腹腔开放。
    3. 用两根棉签取出肠管，并用浸有39 °C生理盐水的纱布覆盖，以暴露后腹膜区域，显露肾下腹主动脉（AA）。
      注意：手术过程中，需使用含有39 °C生理盐水的注射器不时润湿肠管，以防止低体温，这是啮齿类动物常见的严重状况。
    4. 使用两根棉签剥离两侧肾动脉之间至髂动脉分叉处的后壁腹膜，并清除肾下腹主动脉周围的脂肪组织。仅在腹主动脉上方保留少量脂肪，以便于血管操作。
    5. 将腹主动脉（AA）与下腔静脉（IVC）分离。操作时，先用一把弯头镊子从腹主动脉后壁后方穿过，打开AA与IVC之间的通路。然后使用2-0丝线在AA周围制作一个环形结扎线，以抬起血管并分离AA与IVC。使用6/0丝线结扎从肾下AA发出的任何腰动脉，并将其切断。
    6. 将动物逆时针旋转90°，使头部位于操作者左侧。此时AA在显微镜视野中呈水平位置。
    7. 使用两个Yasargil夹夹闭肾下腹主动脉，并使其相距1.5 cm。在两个夹子之间的中点横断腹主动脉。
    8. 用含肝素（1 UI/mL）的生理盐水冲洗血管两端，以清除任何血凝块。清除血管上的任何外膜碎片。
  2. PAG植入：
    1. 将PAG置于两个断端之间，其心室端朝向动物的头侧部分。
    2. 使用10-0聚丙烯缝线，在PAG两端各做两个定位单缝线，将移植物（PG）与腹主动脉（AA）连接。在PAG的每一端，将缝线置于血管周径的对侧位置。
    3. 从远端开始，进行PAG与AA之间的端对端吻合。利用远端定位缝线的一端，采用受体到移植物“外进内/内出外”的顺序，连续缝合约六针，完成后壁吻合。
    4. 当缝线到达近端定位点时，利用该缝线及近端定位缝线的其中一端，打双半结并以方结收尾。使用带橡胶头的蚊式钳夹住缝线以提供牵引力。
    5. 以相同方式完成前壁吻合。随后在PAG的近端进行整个吻合过程。进行近端吻合时需特别注意，避免将任何组织瓣膜纳入缝合线中。
    6. 首先松开远端夹子，使PAG由逆向血流（低压血流）充盈，以检查吻合口情况。如有渗血，用单针缝合修复。待远端吻合口评估完成后，对近端吻合口进行相同操作。
  3. 受体动物手术的最后阶段：
    1. 评估PAG的通畅性，必要时在PAG两侧的缝合线处覆盖两片明胶海绵。用两根棉签轻轻按压数秒，以促进止血。
    2. 将肠管复位至腹腔内，使用4/0聚丙烯连续缝合关闭腹壁。

5. 假手术操作步骤

  1. 对供体动物进行与受体大鼠相同的准备工作。
  2. 在肾动脉与髂动脉起始点之间的中点处切断肾下腹主动脉（AA）。
  3. 采用先前所述的端对端吻合方式重新连接腹主动脉的两端。移除两个血管夹，并进行精确的止血操作。
  4. 将肠管复位，并分层缝合腹壁，操作方式与受体动物相同。

6. 术后护理与随访

  1. 向动物背部皮下组织注射温生理盐水溶液（5 mL）以补充水分。将大鼠置于加热灯下，并在麻醉停止后持续观察直至其苏醒，通常需要最多5分钟。将动物放入温度为22–24 °C的笼子中，并立即自由取用食物和饮水。
  2. 术后前48小时内，每日两次肌肉注射曲马多（5 mg/kg）以进行镇痛治疗。此后，应每日定期监测受体动物的健康状况和体重变化。
  3. 随访：在随访期间，分别于术后一周、一个月和两个月进行系列超声检查，以评估人工血管移植物（PAG）功能。在每次检查中，测量血管直径、收缩期峰值流速（PSV）以及舒张末期流速。这些参数应在PAG内部以及近端和远端腹主动脉（AA）水平处进行测量。
  4. 随访两个月后，先用CO2处死动物数分钟，随后取出PAG并进行组织病理学分析。

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结果

本研究共纳入39只成年Lewis大鼠：其中17只作为PAG供体，17只作为受体，5只进行假手术操作（对照组）（表1）。雄性大鼠22只（56%），雌性17只（44%）；雌性仅用于供体组。

手术过程中未发生任何死亡事件，存活率为100%。在随访期间，移植组有两只动物死亡，分别发生在术后第12天和第51天；研究结束时的生存率为91%（表1）。

受体组大鼠的中位体重为387 g（四分位距，IQR，358–394 g），供体组为328 g（IQR=304–337 g）。术后一周，中位体重为363 g（IQR=350–376 g），较术前体重下降了6%。动物在随访的第一个月内恢复了体重（中位数387 g，IQR 369–392 g），两个月时的最终体重为397 g（IQR=391–402 g）（图2）。

移植组的中位随访时间为62.5天（IQR=60-68天...

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讨论

使用自体肺动脉瓣根部进行主动脉瓣置换（Ross手术）因其良好的性能和自体移植物潜在的生长能力，成为先天性主动脉瓣狭窄修复的一种理想选择10。该手术的主要局限在于新构建的主动脉瓣可能发生扩张，从而导致远期反流的发生。研究肺动脉在承受体循环压力后所发生的结构改变，可能为理解肺动脉自体移植物功能衰竭的机制提供基础。为此，我们建立了一种在啮齿类动物模型中将同基因肺动脉移植物植入体循环位置的实验模型

报道的手术技术安全、有效且可重复。所用动物体型较小，简化了手术及术后管理，使我们能够以有限的材料和动物成本获得一个有用的模型。选择Lewis大鼠是因为作为近交系，这些大鼠具有同基因性，其等位基因固定程度超过99%。因此，它们是研究动物间肺动脉瓣移植的合适模型。我们决定将研究终点设为两个月，因为文献数据显示人类与大鼠的天数比为1:1111。因此，我们可以推测我们的随访时间相当于约五年，从而能够在中长期范围内评估PAG的适应情况。

我们最初的结果显示...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由2019年部门间研究综合预算（BIRD）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠Monico SpAAIC 030805105两瓶 100 mL。冷藏的一瓶（4°C）用于冲洗供体器官；温热的一瓶（39°C）用于湿润和使受体再水化
7.5% 聚维酮碘B BraunAIC 032151211
BarraquerAesculapFD 232R直型显微血管吻合针持，用于血管吻合
Castroviejo 针持无货J 4065用于关闭动物体腔
施夹钳Rudolf MedicalRU 3994-05用于夹闭血管夹
棉签Johnson & Johnson Medical SpAN/A市售产品，已灭菌
弯头显微镊（珠宝镊）Rudolf MedicalRU 4240-06用于将缝线穿过血管下方
脱毛膏RB healthcareN/A市售产品
电凝仪LED SpASurton 200
精细剪刀Rudolf MedicalRU 2422-11用于打开受体动物腹腔
细尖弯头 Vannas 显微剪刀AesculapOC 497R仅用于制备肺动脉根部、剪断腰血管和 10/0 Prolene 缝线
Fluovac 异氟烷/氟烷废气清除装置Harvard Apparatus LtdK 017041包含麻醉机、麻醉管路、诱导舱和带可吸收滤芯的废气清除装置
庆大霉素MSD Italia SrlAIC 020891014抗生素，单次剂量，术中肌内注射 5 mg/kg
肝素Pharmatex Italia SrlAIC 034692044向受体动物腹腔静脉注入 500 IU
静脉导管Smiths Medical Ltd403620G
胰岛素注射器，1 mLFisher Scientific14-841-33用于向供体动物注射肝素，以及冲洗受体动物切断的主动脉
珠宝镊双极电凝钳GIMA SpA30665尖端 0.25 mm，用于微小血管的电凝
Lewis 大鼠 (LEW/HanHsd)Envigo RMS SRL, San Pietro al Natisone, Udine, Italy86104M雄性或雌性，体重 200–250 g（用于肺动脉根部供体）和 320–400 g（用于受体）
Micro-Mosquito 钳Rudolf MedicalRU 3121-10共四把，钳尖包覆硅胶管，用于在吻合过程中牵拉 Prolene 缝线
手术显微镜Leica MicrosystemsM 400-E术中可切换 6×、10× 和 16× 放大倍数
Perma-Hand 丝线 2-0Johnson & Johnson Medical SpAC026D用于提起主动脉
凡士林眼膏DechraNDC 17033-211-38
Prolene 10-0Johnson & Johnson Medical SpAW2790极细不可吸收缝线，配 BV75-3 圆体针，用于血管吻合
牵开器无N/A两个自制牵开器
环柄显微镊Rudolf MedicalRU 4079-14用于精细操作
七氟烷AbbVie SrlAIC 031841036与氧气混合，用于吸入麻醉
弹簧式显微剪刀Rudolf MedicalRU 2380-14直型，长 14 cm
标准动脉瘤夹Rudolf MedicalRU 3980-12两个夹子（7.5 mm；180 g；1.77 N），用于夹闭主动脉
无纺布无菌纱布Luigi Salvadori SpA26161V7.5×7.5 cm，四层
直型 Doyen 剪刀Rudolf MedicalRU/1428-16用于供体动物
直型显微镊（珠宝镊）Rudolf MedicalRU 4240-04长 10.5 cm，用于整个吻合过程
注射器Artsana SpAN/A20 mL（用于供体动物）和 5 mL（用于受体动物），用于生理盐水冲洗和浸泡
TiCron 4-0CovidienCV-331用于缝合肌肉和皮肤
V. Mueller 组织镊McKessonCH 6950-009用于皮肤和肌肉操作
曲马多SALF SpAAIC 044718029镇痛药，单次剂量，5 mg/kg 肌内注射
Virgin 丝线 8-0Johnson & Johnson Medical SpAW818用于动脉分支结扎

参考文献

  1. Botto, L. D., Correa, A., Erickson, J. D. Racial and temporal variations in the prevalence of heart defects. Pediatrics. 107 (3), 32(2001).
  2. Vergnat, M., et al. Aortic stenosis of the neonate: A single-center experience. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (1), 318-326 (2019).
  3. Hraška, V., et al. The long-term outcome of open valvotomy for critical aortic stenosis in neonates. The Annals of Thoracic Surgery. 94 (5), 1519-1526 (2012).
  4. Kaza, A. K., Pigula, F. A. Are bioprosthetic valves appropriate for aortic valve replacement in young patients. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. 19 (1), 63-67 (2016).
  5. Myers, P. O., et al. Outcomes after mechanical aortic valve replacement in children and young adults with congenital heart disease. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 157 (1), 329-340 (2019).
  6. Donald, J. S., et al. Ross operation in children: 23-year experience from a single institution. The Annals of thoracic surgery. 109 (4), 1251-1259 (2020).
  7. Khwaja, S., Nigro, J. J., Starnes, V. A. The Ross procedure is an ideal aortic valve replacement operation for the teen patient. Seminars in Thoracic and Cardiovascular Surgery: Pediatric Cardiac Surgery Annual. , 173-175 (2005).
  8. Elkins, R. C., Lane, M. M., McCue, C. Ross operation in children: late results. The Journal of Heart Valve Disease. 10 (6), 736-741 (2001).
  9. Chambers, J. C., Somerville, J., Stone, S., Ross, D. N. Pulmonary autograft procedure for aortic valve disease: long-term results of the pioneer series. Circulation. 96 (7), 2206-2214 (1997).
  10. Mazine, A., et al. Ross procedure in adults for cardiologists and cardiac surgeons: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 72 (22), 2761-2777 (2018).
  11. Sengupta, P. The laboratory rat: Relating its age with humans. International Journal of Preventive Medicine. 4 (6), 624-630 (2013).
  12. Ashfaq, A., Leeds, H., Shen, I., Muralidaran, A. Reinforced ross operation and intermediate to long term follow up. Journal of Thoracic Disease. 12 (3), 1219-1223 (2020).
  13. Vida, V. L., et al. Age is a risk factor for maladaptive changes of the pulmonary root in rats exposed to increased pressure loading. Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 21 (3), 199-205 (2012).
  14. Nappi, F., et al. An experimental model of the Ross operation: Development of resorbable reinforcements for pulmonary autografts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 149 (4), 1134-1142 (2015).
  15. Vanderveken, E., et al. Mechano-biological adaptation of the pulmonary artery exposed to systemic conditions. Scientific Reports. 10 (1), 2724(2020).

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