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光控发酵用于微生物化学品与蛋白质生产

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DOI：

10.3791/63269

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2022年3月22日

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

光遗传学对微生物代谢的控制为发酵过程提供了灵活的动态调控手段。本方案展示了如何在不同体积规模下建立蓝光调控的发酵系统，用于化学品和蛋白质的生产。

摘要

微生物细胞工厂为利用可再生原料生产化学品和重组蛋白提供了一种可持续的替代方案。然而，对微生物施加过多的遗传改造可能会降低宿主的适应性和生产效率。这一问题可通过动态调控加以克服：通过化学物质或营养添加剂诱导酶和代谢通路的表达，以平衡细胞生长与产物合成。光遗传学提供了一种非侵入性、高度可调且可逆的基因表达动态调控方法。本文介绍了如何建立光控发酵系统，用于工程化Escherichia coli和Saccharomyces cerevisiae生产化学品或重组蛋白。我们讨论了在特定时间施加特定剂量光照以解耦微生物生长与生产过程的方法，从而实现更优的发酵控制和更高的生产效率，并阐述了获得最佳效果所需的关键优化因素。此外，还描述了在实验室规模生物反应器实验中实施光控操作的具体步骤。这些方案有助于推动光遗传调控技术在工程微生物中的应用，提升发酵性能。

引言

光遗传学利用光响应蛋白来控制生物过程，为动态调控微生物发酵以生产化学品和蛋白质提供了一种新策略1,2。工程化代谢通路带来的细胞负担以及某些中间产物和终产物的毒性常常会抑制细胞生长3。此类应激可导致生物量积累不足和生产效率下降3。这一挑战可通过将发酵过程在时间上划分为生长期和生产期来解决，这两个阶段分别将代谢资源集中用于生物量积累或产物合成4。我们近期研究表明，在这种两阶段发酵中，从生长期向生产期的转换可通过改变光照条件来诱导5,6,7。光信号具有高度可调性、可逆性和正交性8，这为光控发酵提供了独特优势，而这些优势在使用化学诱导剂对传统两阶段发酵进行动态控制时难以实现甚至无法实现4,9,10,11

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方案

1. 使用 S. cerevisiae OptoINVRT7 电路实现光控化学品生产

  1. 菌株构建
    1. 获取具有his3营养缺陷型的菌株，因为该标记对大多数现有的OptoINVRT质粒是必需的5。若需对酿酒酵母（S. cerevisiae）中天然存在的基因进行光遗传学调控，则构建一个删除了该基因内源拷贝的菌株。
    2. 将含有OptoINVRT7回路的质粒（例如EZ-L4395）线性化，并利用标准的乙酸锂转化方法将其整合至营养缺陷型菌株的 his3位点15。若使用的是EZ-L439质粒（该质粒包含在光照下抑制PGAL1 启动子、在黑暗中激活该启动子的元件），则应在PmeI限制性酶切位点处进行线性化。 
    3. 转化完成后，以150 × g离心细胞1分钟，并用200 µL新鲜的组氨酸缺陷型合成完全培养基（SC-His）轻轻重悬。
    4. 将全部细胞悬液涂布于SC-His琼脂平板上，于30 °C培养2–3天，直至菌落出现。
    5. 使用标准的乙酸锂转化方案从此菌株中制备感受态细胞，并将其与含有目标基因的质粒共转化，该基因需位于....

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结果

光遗传学调控微生物代谢已成功用于生产多种产物，包括生物燃料、大宗化学品、蛋白质和天然产物5,6,7,12,13。这些过程大多设计为在光照条件下进行细胞生长（此时细胞密度较低，光穿透的难度最小），待细胞生长完成后，再通过黑暗诱导产物合成。利用该策略，已在酵母中成功生产出多种化学品，包括乳酸（一种有价值的聚合物前体和食品添加剂）以及异丁醇（一种下一代生物燃料）。对于这两种化学品而言，一个共同的挑战源于酿酒酵母（S. cerevisiae）倾向于将葡萄糖代谢为乙醇，而非目标产物；同时，若删除乙醇发酵途径则会导致严重的生长缺陷7。研究人员已结合使用光激活的OptoEXP系统和光抑制的OptoINVRT系统，通过光照选择性激活乙醇发酵所必需的丙酮酸脱羧酶基因（.......

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讨论

动态调控长期以来已被用于提高代谢工程和重组蛋白生产的产量4。酶的表达调控通常通过化学诱导剂实现，例如 IPTG21、半乳糖22 和四环素23，但也可通过温度和 pH 等工艺条件进行调控。光遗传学基因表达调控无需改变发酵参数或培养基成分，因此成为传统诱导策略的一种易于实施的替代方案。光信号的开启与关闭操作简便，还提供了新的能力，例如快速且可逆地调节基因剂量。此外，尽管这些方案主要聚焦于蓝光响应系统，但目前已存在能够反转现有光响应24 或响应其他波长光信号的光遗传学工具25,26,27,28,2.......

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披露

作者已为本文所述的光遗传回路和方法申请了多项专利。

致谢

本研究由美国能源部科学办公室生物与环境研究项目资助，项目编号为 DE-SC0019363，同时获得美国国家科学基金会职业奖 CBET-1751840、Pew 公益信托基金以及卡米尔和亨利·德雷福斯基金会教师学者奖的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
使用光控技术进行化学品生产 S. cerevisiae
24孔培养板USA ScientificCC7672-7524
琼脂粉Thermo Fisher Scientific303991049
铝箔ReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer 配备 μ比色皿Eppendorf6135000923
蓝色LED面板高通量定量报告系统884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 质粒N/AN/A参见参考文献1
葡萄糖Thermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
微型离心机赛默飞世尔科技75002403
微量离心管USA Scientific1615-5510
轨道摇床Yamato Scientific AmericaSOU-300
培养皿Celltreat229656
PmeI新英格兰生物实验室R0560L
量子计Apogee InstrumentsMQ-510
复制平板接种装置Thomas ScientificF37848-0000
复制划线垫Sunrise Science Products3005-012
SC-His 粉末Sunrise Science Products1303-030
SC完全培养基粉末Sunrise Science Products1459-100
无菌密封膜Excel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD 琼脂平板VWR100217-054
ZeocinThermo Fisher ScientificR25005
光控蛋白生产 大肠杆菌
6X SDS上样缓冲液Cepham生命科学10502
12% 丙烯酰胺蛋白凝胶Thermo Fisher ScientificNP0341BOX
24孔培养板USA ScientificCC7672-7524
铝箔ReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer 配备 μ比色皿Eppendorf6135000923
蓝色LED面板高通量定量报告系统884667106091218
考马斯亮蓝 G-250赛默飞世尔科技20279
电泳槽Bio-Rad1658004
电泳电源Bio-Rad1645050
LB肉汤（Miller）Fisher ScientificBP97235
微型离心机赛默飞世尔科技75002403
微量离心管USA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC 质粒N/AN/A参见参考文献2
轨道摇床Yamato Scientific AmericaSOU-300
培养皿Celltreat229656
量子计Apogee InstrumentsMQ-510
SOC培养基Thermo Fisher Scientific15544034
恒温混匀仪Eppendorf5382000015
Tris 碱Fisher ScientificBP1521
三相发酵法 S. cerevisiae
与以下材料相同 "使用酿酒酵母进行光控化学品生产" 方案附加以下内容：
EZ-L580 OptoAMP4 质粒N/AN/A参见参考文献10
光控生物反应器中的化学品生产
铝箔ReynoldsB004NG90YO
消泡剂Sigma-AldrichA8311
带有控制站的生物反应器EppendorfB120110001
BioSpectrometer 配备 μ比色皿Eppendorf6135000923
漂白剂VWR Scientific89501-620 (CS)
蓝色LED面板高通量定量报告系统884667106091218
BPT 管路Fisher Scientific14-170-15
葡萄糖赛默飞世尔科技501879892 (G8270-5KG)
盐酸（HCl）Fisher Scientific7647-01-0
M9 最小盐培养基Thermo Fisher ScientificA1374401
微型离心机Thermo Fisher Scientific75002403
微量离心管USA Scientific1615-5510
NH4OH 溶液Sigma-AldrichI0503-1VL
轨道摇床Yamato Scientific AmericaSOU-300
量子计Apogee InstrumentsMQ-510
SC完全培养基粉末Sunrise Science Products1459-100

参考文献

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic control strategies and scale-up instruments. Bioengi....

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标签

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae

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