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光控发酵用于微生物化学品与蛋白质生产

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DOI：

10.3791/63269

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2022年3月22日

 ,  , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Princeton University, 2The Andlinger Center for Energy and the Environment, Princeton University, 3Department of Molecular Biology, Princeton University, 4High Meadows Environmental Institute, Princeton University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

光遗传学对微生物代谢的控制为发酵过程提供了灵活的动态调控手段。本方案展示了如何在不同体积规模下建立蓝光调控的发酵系统，用于化学品和蛋白质的生产。

摘要

微生物细胞工厂为利用可再生原料生产化学品和重组蛋白提供了一种可持续的替代方案。然而，对微生物施加过多的遗传改造可能会降低宿主的适应性和生产效率。这一问题可通过动态调控加以克服：通过化学物质或营养添加剂诱导酶和代谢通路的表达，以平衡细胞生长与产物合成。光遗传学提供了一种非侵入性、高度可调且可逆的基因表达动态调控方法。本文介绍了如何建立光控发酵系统，用于工程化Escherichia coli和Saccharomyces cerevisiae生产化学品或重组蛋白。我们讨论了在特定时间施加特定剂量光照以解耦微生物生长与生产过程的方法，从而实现更优的发酵控制和更高的生产效率，并阐述了获得最佳效果所需的关键优化因素。此外，还描述了在实验室规模生物反应器实验中实施光控操作的具体步骤。这些方案有助于推动光遗传调控技术在工程微生物中的应用，提升发酵性能。

引言

光遗传学利用光响应蛋白控制生物过程，为动态调控微生物发酵以生产化学品和蛋白质提供了一种新策略1,2。工程化代谢通路带来的细胞负担以及某些中间产物和终产物的毒性常常会抑制细胞生长3。此类应激可导致生物量积累不足和生产效率下降3。这一挑战可通过将发酵过程在时间上划分为生长期和生产期来解决，使代谢资源分别优先用于生物量积累或产物合成4。我们近期研究表明，通过改变光照条件可诱导这种两阶段发酵中由生长期向生产期的转换5,6,7。光信号具有高度可调性、可逆性和正交性8，在光控发酵中展现出独特优势，而这些优势使用化学诱导剂进行常规两阶段发酵的动态调控时难以实现甚至无法实现4,9,10,11。

源自蓝光响应蛋白EL222 Erythrobacter litoralis 已用于开发多种用于代谢工程的光遗传回路 酿酒酵母5,7,12,13EL222 包含一个光-氧-电压感受域（LOV），在蓝光（465 nm）激活下会发生构象变化，从而能够与其对应的DNA序列（C120）结合13将EL222与病毒VP16激活域融合（VP16-EL222）可获得一种对蓝光响应的转录因子，该因子能够可逆地激活基因表达 S. cerevisiae7 及其他生物体14 来自合成启动子PC120基于EL222构建的多个电路已被开发并用于化学品生产 S. cerevisiae 例如基础的光激活OptoEXP系统7，其中目的基因直接从P表达C120 (图1A）。然而，考虑到在发酵生产阶段通常遇到的高细胞密度下光穿透受限的问题，我们开发了在黑暗条件下被诱导的倒置回路，例如 OptoINVRT 和 OptoQ-INVRT 回路（图1B)5,7,13这些系统利用了来自半乳糖（GAL）或奎宁酸（Q）调控子 S. cerevisiae 和 N. crassa分别通过VP16-EL222控制其相应的阻遏蛋白（GAL80和QS），实现光下抑制基因表达、暗处强烈诱导表达。将OptoEXP与OptoINVRT电路联用，可实现基因表达的双向调控，从而支持两阶段发酵：生长阶段由蓝光诱导，生产阶段则在黑暗中进行。图2A)5,7.

使用光照而非黑暗来诱导生产阶段的基因表达将极大拓展光遗传学控制的应用能力，但也需要克服发酵生产阶段通常遇到的高细胞密度所带来的光穿透限制问题。为此，我们开发了名为 OptoAMP 和 OptoQ-AMP 的基因回路，可放大对蓝光刺激的转录响应。这些回路利用 VP16-EL222 的野生型或超敏突变体来控制产物的生成 转录激活因子 Gal4p 或 GAL或Q调控子的QF2，实现光控下的高灵敏度和更强的基因表达12,13 (图1C). OptoAMP 电路可在5 L生物反应器中实现完全且均匀的光诱导，光密度（在600 nm处测量；OD600至少40的值，仅需约0.35%的光照（在整体表面约7%的区域上施加5%的光剂量）。这表明其灵敏度高于OptoEXP，后者需要接近100%的光照12在高细胞密度下利用光有效诱导基因表达的能力为发酵过程的动态调控开辟了新的机遇。这包括以两个以上的时间阶段运行发酵过程，例如三阶段发酵，其中通过特定的光照程序分别建立生长期、诱导期和产物合成期，从而优化化学品的生产。图2B)12.

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图 1：用于动态调控 S. cerevisiae 的光遗传回路。 OptoEXP、OptoINVRT 和 OptoAMP 回路基于光敏感的 VP16-EL222 系统。（A）在 OptoEXP 回路中，蓝光照射引起 VP16-EL222 的构象变化和二聚化，从而暴露出 DNA 结合结构域，启动 PC120 启动子驱动的转录。该图改编自 Zhao 等人7。（B）OptoINVRT 回路利用 GAL（图示）或 Q 调控子实现在黑暗中的基因表达。在基于 GAL 的回路中，VP16-EL222 和 GAL4 组成型表达，而 PC120 驱动 GAL80 抑制因子的表达（在基于 Q 的回路中，GAL4 和 GAL80 分别被 QF2 和 QS 取代，并使用含合成 QUAS 的启动子替代 GAL 启动子）。在光照条件下，Gal80p 阻止目标基因从 PGAL1 启动子的激活；在黑暗中，GAL80 不表达，并通过融合至一个组成型降解决定子结构域（小棕色结构域）而迅速降解， 从而使 Gal4p 激活 PGAL1 启动子。该图改编自 Zhao 等人5。（C）OptoAMP 回路同样利用 VP16-EL222 控制 GAL（图示）或 Q 调控子。在这些回路中，GAL80 抑制因子（或 QS）组成型表达，并融合至一个光敏感降解决定子（小蓝色结构域），确保在黑暗中实现紧密抑制。PC120 与一种超敏感的 VP16-EL222 突变体共同控制 GAL4（或 QF2）的光控表达，从而在光照下强烈激活 PGAL1 （或含 QUAS 的启动子）。基于 GAL 的回路可使用工程化形式的 PGAL1，例如 PGAL1-M 或 PGAL1-S（具有更高活性），也可使用由 GAL 调控子控制的野生型启动子（PGAL1、PGAL10、PGAL2、PGAL7）。该图改编自 Zhao 等人12。 请点击此处查看此图的放大版本。

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图2：随时间变化的两相与三相发酵过程。（A）采用反向回路操作的两相发酵包括一个光驱动的生长期和一个黑暗条件下的产物生成期。在生长期，生物量不断积累，而产物合成通路处于抑制状态。当达到目标OD600值后，细胞转入黑暗环境进行代谢适应，随后重悬于新鲜培养基中进入产物生成期。（B）在三相发酵过程中，生长期、孵育期和产物生成期由不同的光照程序定义，可能包括黑暗生长期、脉冲式光照孵育期以及完全光照的产物生成期。该图使用Biorender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

光遗传回路也已开发用于动态调控化学物质和蛋白质的生产 E. coli光控LacI电路利用光响应性pDawn电路调控细菌LacI阻遏蛋白，该电路基于YF1/FixJ双组分系统6 (图3）。与 OptoINVRT 相似5，OptoLAC 电路设计用于在光照条件下抑制基因表达，在黑暗条件下诱导基因表达。使用 OptoLAC 电路实现的表达水平可达到或超过标准异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导，从而在保持化学诱导强度的同时，提供更强的可调节性和可逆性6因此，OptoLAC电路可实现对代谢工程的有效光遗传学调控 E. coli.

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图3光控LAC电路用于动态调控 E. coli. OptoLAC 电路通过改造 pDawn 系统和 lac 操纵子，实现黑暗条件下激活、光照条件下抑制的功能。在黑暗中，YF1 磷酸化 FixJ，后者进而激活 PFixK2 启动子以表达 cI 阻遏蛋白。该 cI 阻遏蛋白抑制基因的表达 lacI 阻遏蛋白 来自 PR 启动子，可允许目的基因的转录 lacO含启动子。相反，蓝光会降低YF1的净激酶活性，逆转FixJ的磷酸化，从而 cI 表达，从而解除对表达的抑制 lacI 并阻止来自 lacO含启动子。该图已根据 Lalwani 等人的研究修改。6. 请点击此处以查看此图的放大版本。

本文介绍了利用光控发酵技术进行酿酒酵母（S. cerevisiae）和大肠杆菌（E. coli）化学物质或蛋白质生产的常规实验方案。针对酵母和细菌，我们首先聚焦于采用OptoINVRT和OptoLAC光遗传回路实现的光驱动生长期与暗诱导生产期的发酵过程。随后，描述了利用OptoAMP回路实现三阶段（生长期、诱导期、生产期）光控发酵的实验方案。此外，我们还阐述了如何将光遗传学控制的发酵从微孔板规模放大至实验室规模生物反应器。本方案旨在为开展化学物质或蛋白质生产的光控发酵提供一套完整且易于重复的操作指南。

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方案

1. 使用 S. cerevisiae OptoINVRT7 电路实现光控化学品生产

  1. 菌株构建
    1. 获取具有his3营养缺陷型的菌株，因为该标记对大多数现有的OptoINVRT质粒是必需的5。若需对酿酒酵母（S. cerevisiae）中天然存在的基因进行光遗传学调控，则构建一个删除了该基因内源拷贝的菌株。
    2. 将含有OptoINVRT7回路的质粒（例如EZ-L4395）线性化，并利用标准的乙酸锂转化方法将其整合至营养缺陷型菌株的 his3位点15。若使用的是EZ-L439质粒（该质粒包含在光照下抑制PGAL1 启动子、在黑暗中激活该启动子的元件），则应在PmeI限制性酶切位点处进行线性化。 
    3. 转化完成后，以150 × g离心细胞1分钟，并用200 µL新鲜的组氨酸缺陷型合成完全培养基（SC-His）轻轻重悬。
    4. 将全部细胞悬液涂布于SC-His琼脂平板上，于30 °C培养2–3天，直至菌落出现。
    5. 使用标准的乙酸锂转化方案从此菌株中制备感受态细胞，并将其与含有目标基因的质粒共转化，该基因需位于PGAL1-M或PGAL1-S 启动子下游，以实现光遗传学控制5。
      注：使用可在δ位点整合并以Zeocin进行筛选的质粒（如YARCdelta5），可实现稳定的多拷贝整合7,16,17,18。
    6. 转化后，以150 × g离心培养物1分钟，并用200 µL新鲜SC缺陷型培养基轻轻重悬。
      注：PGAL1-M 启动子是PGAL1启动子的一种合成版本，其Mig1p抑制位点已被删除；而PGAL1-S是PGAL1-M的工程化版本，额外引入了Gal4p激活因子结合位点。常规PGAL1启动子也可用于控制基因表达，但其表达强度低于这些工程化启动子。
    7. 若在δ位点进行整合，则将全部细胞悬液涂布于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）琼脂平板；若使用含筛选标记的质粒进行转化，则涂布于SC缺陷型平板。于30 °C在持续蓝光下培养16小时，以保持光遗传学控制基因的抑制状态。
      注：对于某些菌株，采用蓝光脉冲（例如1秒开/79秒关、5秒开/75秒关、10秒开/70秒关等）而非持续光照可能促进菌落更快生长，具体条件需根据每种菌株通过实验确定。
    8. 使用任意465 nm光源，将LED面板置于平板上方约40 cm处，使光照强度约为80–110 µmol/m2/s。使用量子计测量光照强度（见材料表）。
    9. 若在δ位点进行整合，可将平板复制至含有Zeocin浓度梯度（400 µg/mL至1,200 µg/mL）的YPD平板上，以筛选不同整合拷贝数的菌株5,7,12,16,17,18。将复制平板于30 °C在持续或脉冲蓝光下培养2–3天，直至菌落出现。
  2. 初步筛选最佳菌落
    1. 从每个平板上挑选八个菌落，分别接种至24孔板的各个孔中，每孔含1 mL添加2%葡萄糖的SC-His培养基。于30 °C、200 rpm（轨道直径19 mm）振荡条件下，在持续蓝光照射下过夜培养（16–20小时） 。
    2. 次日早晨，将各培养物用新鲜SC-His培养基（含2%葡萄糖）稀释至OD600值在0.01–0.3范围内，继续在24孔板中于30 °C、200 rpm振荡、持续或脉冲光照下培养，直至细胞密度达到OD600值2–9之间（图4A）。此生长阶段所需时间取决于菌株特性。
    3. 关闭光源并将平板用铝箔包裹，在30 °C、200 rpm振荡条件下避光培养4小时。
      注：此步骤可使细胞在重悬于生产培养基前完成代谢向生产阶段的转换。
    4. 启动生产阶段时，将24孔板中的培养物以234 × g离心5分钟，弃上清后用1 mL含2%葡萄糖的新鲜SC缺陷型培养基重悬细胞。使用无菌微孔板封口膜密封平板，防止目标产物蒸发。
    5. 将密封的平板在30 °C、200 rpm振荡条件下避光发酵48小时。确保平板用铝箔包裹，避免任何光照。
      注：铝箔包裹不会限制发酵过程中的氧气或气体交换；但无菌封口膜会限制气体传递。必要时可在封口膜上刺小孔以引入氧气。
  3. 收获与分析
    1. 收获发酵产物时，将平板以234 × g离心5分钟，取800 µL上清液转移至1.5 mL微量离心管中。
    2. 根据目标化合物的性质，采用高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）或其他分析方法，并结合所用仪器最适宜的样品前处理技术进行分析。

2. 利用光控蛋白表达系统进行蛋白质生产的 大肠杆菌 OptoLAC 系统

  1. 菌株构建
    1. 将含有 OptoLAC1B 或 OptoLAC2B 电路的质粒6 与一个在 PT7 启动子下表达目标重组蛋白的质粒19，共同转化至电转感受态 BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 细胞中。
    2. 转化后，在 1 mL 的含分解代谢阻遏的超优肉汤（SOC；2% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、20 mM 葡萄糖）中，于 37 °C 旋转或振荡培养 1 小时以恢复细胞。
      注意：含有目标蛋白的质粒必须与 OptoLAC 质粒兼容（即具有不同的抗性标记和复制起点），且不得含有 lacI 基因拷贝。
    3. 在 4845 × g 下离心细胞 3 分钟，并将沉淀浓缩于 200 µL 的溶菌肉汤（LB）培养基中。将全部浓缩后的细胞涂布于含适当抗生素的 LB 琼脂平板上，并在持续蓝光照射下于 37 °C 过夜培养，以保持蛋白表达的抑制状态。
  2. 初步筛选以验证表达
    1. 挑取三个单菌落，分别接种至 24 孔板中含适当抗生素的 1 mL LB 培养基各孔中。在持续蓝光照射下，于 37 °C、200 rpm 振荡培养过夜（16–20 小时）（图 4A）。
    2. 次日，取 1.5 µL 培养物，使用微量检测法在分光光度计中测定 OD600。将各培养物稀释至 24 孔板中的新鲜 LB 培养基中，使 OD600 值介于 0.01–0.1 之间。
    3. 在蓝光照射下，于 37 °C、200 rpm 振荡培养 2–3 小时。从第二小时开始，每 15 分钟测定一次 OD600，确保培养物的 OD600 不超过 0.1–1.5 范围。
    4. 当培养物达到目标 OD600 时，关闭光源面板并将培养板用铝箔包裹，以启动蛋白生产阶段。在黑暗条件下继续振荡培养（200 rpm），培养时间与温度分别为：8 小时（37 °C）、20 小时（30 °C）或 48 小时（18 °C）。
    5. 测定并记录每种培养物的最终 OD600 值。
  3. 收获与分析
    1. 将每种培养物的 800 µL 转移至 1.5 mL 微量离心管中，在 17,000 × g 下离心 5 分钟。
    2. 将细胞沉淀重悬于 200 µL 重悬缓冲液（50 mM Tris，pH 8.0，300 mM NaCl）中。
      注意：NaCl 浓度可根据所分析的重组蛋白进行调整。
    3. 加入 50 µL 6× 十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液（375 mM Tris，pH 6.8，9% SDS，50% 甘油，0.03% 溴酚蓝，9% DTT）。在恒温混匀仪中，于 100 °C 孵育 10 分钟，同时以 700 rpm 振荡。
    4. 将约 3–20 µL 培养物样品上样至 12% SDS-PAGE 凝胶中。根据最终 OD600 值进行归一化，使各样品上样蛋白量大致相等（相当于最终 OD600 为 1 时的 10 µL 样品）。使用电泳仪在 100 V 条件下进行电泳，直至凝胶完全分离。
    5. 将凝胶置于考马斯亮蓝 G-250 溶液中，在微波炉中加热 30–40 秒，随后在旋转平台上孵育至少 15 分钟进行染色。
    6. 用去离子水冲洗两次，并在旋转平台上脱色至少 30 分钟（或过夜），可加入两个打结的清洁擦拭布以帮助吸收染料。在微波炉中用足量水煮沸凝胶 15 分钟，以加速脱色过程。

利用 S. cerevisiae OptoAMP 系统进行三相发酵

  1. 菌株构建
    1. 获取带有his3营养缺陷型标记的菌株，因为该标记是使用现有OptoAMP质粒所必需的5。若需对酿酒酵母（S. cerevisiae）内源基因进行光遗传学调控，则构建一个该基因内源拷贝已被敲除的菌株。
    2. 线性化含有OptoAMP4回路的质粒（例如EZ-L58012），并通过标准的乙酸锂转化方法将其整合至营养缺陷型菌株的his3 位点15。若使用EZ-L580，应在PmeI限制性酶切位点处线性化该质粒。
    3. 转化完成后，以150 × g离心1分钟，将细胞轻柔重悬于200 µL新鲜SC-His培养基中。
    4. 将全部细胞体积涂布于选择性培养基（SC-His-琼脂）上，于30 °C培养2–3天，直至菌落出现。
    5. 从该菌株制备感受态细胞，并转化含有目标基因的质粒，该基因应位于PGAL1-S启动子下游以实现光遗传学控制12。
      注：使用可在δ位点整合并以Zeocin进行筛选的质粒，可实现稳定的多拷贝整合与筛选。
    6. 转化后，以150 × g离心培养物1分钟，轻柔重悬于200 µL新鲜SC-缺失培养基中。
      注：PGAL1-S启动子是PGAL1 启动子 的一种合成版本，其Mig1p抑制位点已被删除，并额外添加了Gal4p激活因子结合位点。也可使用常规PGAL1启动子，但其表达强度低于该工程化启动子。
    7. 将全部细胞体积涂布于YPD或SC-缺失琼脂平板上，于30 °C避光（用铝箔包裹）培养16小时。避光培养可保持光遗传学控制基因的抑制状态，使细胞将代谢资源用于生长而非化合物生产。
    8. 若在δ位点进行整合，可通过影印接种法将菌落转移至含不同浓度Zeocin的YPD平板上，以筛选具有不同整合拷贝数的菌株。于30 °C避光（用铝箔包裹）培养2–3天，直至菌落出现。
  2. 最佳菌落的初步筛选
    1. 从每个平板上挑选八个菌落，分别接种至24孔板的各个孔中，每孔含1 mL SC-His培养基（含2%葡萄糖）。于30 °C避光、200 rpm振荡条件下过夜培养（16–20小时）。
    2. 次日早晨，将各培养物用含2%葡萄糖的新鲜SC-His培养基稀释至0.1 OD600，于30 °C避光、200 rpm振荡条件下继续培养至OD600达到3。用铝箔包裹培养板以避免光照。此阶段所需时间取决于菌株特性。
    3. 启动诱导阶段：将培养板置于脉冲光照条件下（例如，开5秒/关95秒），于30 °C、200 rpm振荡条件下培养12小时。使用任意465 nm光源，将LED面板置于培养板上方，使光照强度约为80–110 µmol/m2/s，以获得最佳效果（图4A）。
      注：最佳光照脉冲持续时间因所产化合物而异。建议筛选从0.1%（例如，开1秒/关999秒）到100%（持续光照）范围内的多种光照程序。
    4. 启动生产阶段：以234 × g离心5分钟，弃上清，将菌体重悬于含2%葡萄糖的新鲜SC-His培养基中。使用无菌微孔板封膜密封培养板，防止目标产物蒸发。
    5. 将密封后的培养板在光照、30 °C、200 rpm振荡条件下发酵48小时。在此阶段优化光照程序，因某些化合物在脉冲光照生产阶段比持续光照更优。
  3. 收获与分析
    1. 将发酵液以234 × g离心5分钟，取800 µL上清液转移至1.5 mL微量离心管中。
    2. 根据目标化合物的性质，采用HPLC、GC-MS或其他分析方法进行检测，并使用最适合所用仪器的样品前处理技术。

在光控生物反应器中利用 E. coli 生产化学物质（甲羟戊酸）

  1. 初始接种与生物反应器设置
    1. 将一株经基因工程改造、可由光控化学产物合成的 E. coli 菌落接种至5 mL M9 最小盐培养基中（含 3.37 mM Na2HPO4、2.2 mM KH2PO4、0.855 mM NaCl、0.935 mM NH4Cl），并补充 0.2% w/v 酪蛋白氨基酸、5% w/v 葡萄糖及微量金属混合物20（0.0084 g/L EDTA、0.0025 g/L CoCl2、0.015 g/L MnCl2、0.0015 g/L CuCl2、0.003 g/L H3BO3、0.0025 g/L Na2MoO4、0.008 g/L ZnCl2、0.06 g/L 柠檬酸铁(III)、0.0045 g/L 硫胺素、1.3 g/L MgSO4），置于50 mL 锥形管中。
    2. 在蓝光照射下，于30 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养。
    3. 安装生物反应器罐体顶板，确保以下接口已安装到位：温度探针插入口；溶解氧（DO）探针；气体分布器——通过0.2 µm 滤膜连接气源；搅拌桨；气体冷凝器——连接至0.2 µm 滤膜；冷却管路（×2）；进料管路（×2）——一路用于添加培养基，另一路用于pH 控制；取样管路——确保其伸至罐体底部；空置接口；pH 探针——安装前使用 pH = 4 和 pH = 7 的标准缓冲液校准，可选择与罐体一同高压灭菌，或用95%乙醇灭菌后无菌插入。
    4. 向罐体内加入1 L 过滤水，安装并拧紧顶板，确保O型密封圈紧密贴合并密封良好。
    5. 用铝箔覆盖反应器上所有开口。
    6. 准备三段管路：一段用于排水，一段用于进料，一段用于pH 控制。将管路两端及整段均用铝箔包裹。
      注：用于pH 调节的 NH4OH 在硅胶管路中流动不畅，可能导致流速不准确及培养物过度碱化。为避免此问题，NH4OH 进料应使用生物相容性泵管（BPT）。
    7. 对生物反应器及管路进行高压灭菌，采用30分钟液体循环程序。
    8. 从高压灭菌器中取出材料，待冷却至可安全操作后，将搅拌桨、pH 和 DO 探针、气源、冷凝器进/出口、冷却水进/出口连接至控制站。
    9. 插入温度探针，并为罐体套上加热夹套。将夹套固定在罐体上部，以避免遮挡光照。
    10. 将一根无菌管路连接至取样管路，并通过取样泵固定。将另一端置于可容纳至少1 L 液体的空容器中，排空罐体内水分。
    11. 将另一根无菌管路连接至一条进料管路，并通过一个进料泵固定。将管路另一端连接至M9 培养基瓶，向反应器中泵入培养基。
    12. 将第三根无菌管路连接至另一条进料管路，并通过一个进料泵固定。将管路另一端连接至盛有28%-30% NH4OH 的瓶子。
      注意：NH4OH 具有腐蚀性。转移至进料瓶时应在通风橱内操作，并确保进料瓶置于二次防漏容器中。
    13. 将三块光源面板以三角形排列置于反应器周围，距离约20 cm，确保罐体表面每侧光照强度达到约80–110 µmol/m2/s（图4B）。
    14. 次日，启动生物反应器系统及冷却器。设定反应器温度为37 °C，pH 设定值为7.0，搅拌速度为200 rpm。加热夹套应自动启动。
    15. 校准DO 探针：首先等待温度和DO 测量值稳定（此为100%设定点）。随后将探针从系统中断开（此为0%设定点）。重复此过程，直至探针连接时DO 测量值稳定在100%，然后将DO 设定值设为20%。
  2. 光控化学产物合成
    1. 将种子液接种至生物反应器中，初始OD600 控制在0.001–0.1。开启光源面板以启动细胞生长。
    2. 3小时后，开始通过取样管路定期取样测定OD600，以避免细胞密度超过诱导最佳值（ρs）。当达到最佳ρs（甲羟戊酸生产的最佳值为0.17）时，关闭光源面板，用铝箔包裹反应器，并整体覆盖黑色布料，进入暗期生产阶段。
    3. 转入黑暗条件8小时后，加入50 µL 消泡剂。拧开空置接口，用移液器将消泡剂直接加入反应器中。
    4. 通过取样口定期取样，用于HPLC 或 GC 分析。
  3. 拆卸与分析
    1. 实验结束后关闭系统。小心拆下DO 和 pH 探针，用肥皂水清洗。拆下顶板，用刷子蘸肥皂水清洗。
    2. 将培养物转移至空容器中，加入漂白剂至终浓度为10% v/v。置于通风橱中静置30分钟后处理。
    3. 用刷子蘸肥皂水清洗反应器罐体。
    4. 根据目标产物准备样品。对于甲羟戊酸生产，将560 µL 培养物与140 µL 0.5 M HCl 混合，高速涡旋1分钟，使甲羟戊酸转化为(±)-甲羟戊酸内酯。
      注意：HCl 具有健康危害。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），并在涡旋前确保样品管盖紧。
    5. 在4 °C 条件下，以17,000 x g 离心45分钟。取250 µL 上清液转移至HPLC 进样瓶中。
    6. 对于甲羟戊酸，使用有机酸离子交换柱进行样品分析。采用示差折光检测器（RID）定量，通过与(±)-甲羟戊酸内酯标准品的峰面积比较计算产量。

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结果

光遗传学调控微生物代谢已成功用于生产多种产物，包括生物燃料、大宗化学品、蛋白质和天然产物5,6,7,12,13。这些过程大多设计为在光照条件下进行细胞生长（此时细胞密度较低，光穿透的挑战最小），待细胞生长完成后，再通过黑暗诱导产物合成。利用该策略，已从酵母中成功生产出多种化学品，包括乳酸（一种有价值的聚合物前体和食品添加剂）以及异丁醇（一种 下一代生物燃料）。对于这两种化学品，一个共同的挑战源于酿酒酵母（S. cerevisiae）倾向于将葡萄糖代谢为乙醇，而非目标产物，且无法在不引起严重生长缺陷的情况下敲除乙醇发酵途径7。研究人员已结合使用光激活的OptoEXP系统和光抑制的OptoINVRT系统，通过光照选择性激活乙醇发酵所必需的丙酮酸...

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讨论

动态调控长期以来已被用于提高代谢工程和重组蛋白生产的产量4。酶的表达调控通常通过化学诱导剂实现，例如 IPTG21、半乳糖22 和四环素23，但也可通过温度和 pH 等工艺条件进行调控。光遗传学基因表达调控无需改变发酵参数或培养基成分，因此成为传统诱导策略的一种易于实施的替代方案。光信号的开启与关闭操作简便，还提供了新的能力，例如快速且可逆地调节基因剂量。此外，尽管这些方案主要聚焦于蓝光响应系统，但目前已存在能够反转现有光响应24 或响应其他波长光信号的光遗传学工具25,26,27,28,2...

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披露

作者已为本文所述的光遗传回路和方法申请了多项专利。

致谢

本研究由美国能源部科学办公室生物与环境研究项目资助，项目编号为 DE-SC0019363，同时获得美国国家科学基金会职业奖 CBET-1751840、Pew 公益信托基金以及卡米尔和亨利·德雷福斯基金会教师学者奖的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
使用光控技术进行化学品生产 S. cerevisiae
24孔培养板USA ScientificCC7672-7524
琼脂粉Thermo Fisher Scientific303991049
铝箔ReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer 配备 μ比色皿Eppendorf6135000923
蓝色LED面板高通量定量报告系统884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 质粒N/AN/A参见参考文献1
葡萄糖Thermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
微型离心机赛默飞世尔科技75002403
微量离心管USA Scientific1615-5510
轨道摇床Yamato Scientific AmericaSOU-300
培养皿Celltreat229656
PmeI新英格兰生物实验室R0560L
量子计Apogee InstrumentsMQ-510
复制平板接种装置Thomas ScientificF37848-0000
复制划线垫Sunrise Science Products3005-012
SC-His 粉末Sunrise Science Products1303-030
SC完全培养基粉末Sunrise Science Products1459-100
无菌密封膜Excel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD 琼脂平板VWR100217-054
ZeocinThermo Fisher ScientificR25005
光控蛋白生产 大肠杆菌
6X SDS上样缓冲液Cepham生命科学10502
12% 丙烯酰胺蛋白凝胶Thermo Fisher ScientificNP0341BOX
24孔培养板USA ScientificCC7672-7524
铝箔ReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer 配备 μ比色皿Eppendorf6135000923
蓝色LED面板高通量定量报告系统884667106091218
考马斯亮蓝 G-250赛默飞世尔科技20279
电泳槽Bio-Rad1658004
电泳电源Bio-Rad1645050
LB肉汤（Miller）Fisher ScientificBP97235
微型离心机赛默飞世尔科技75002403
微量离心管USA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC 质粒N/AN/A参见参考文献2
轨道摇床Yamato Scientific AmericaSOU-300
培养皿Celltreat229656
量子计Apogee InstrumentsMQ-510
SOC培养基Thermo Fisher Scientific15544034
恒温混匀仪Eppendorf5382000015
Tris 碱Fisher ScientificBP1521
三相发酵法 S. cerevisiae
与以下材料相同 "使用酿酒酵母进行光控化学品生产" 方案附加以下内容：
EZ-L580 OptoAMP4 质粒N/AN/A参见参考文献10
光控生物反应器中的化学品生产
铝箔ReynoldsB004NG90YO
消泡剂Sigma-AldrichA8311
带有控制站的生物反应器EppendorfB120110001
BioSpectrometer 配备 μ比色皿Eppendorf6135000923
漂白剂VWR Scientific89501-620 (CS)
蓝色LED面板高通量定量报告系统884667106091218
BPT 管路Fisher Scientific14-170-15
葡萄糖赛默飞世尔科技501879892 (G8270-5KG)
盐酸（HCl）Fisher Scientific7647-01-0
M9 最小盐培养基Thermo Fisher ScientificA1374401
微型离心机Thermo Fisher Scientific75002403
微量离心管USA Scientific1615-5510
NH4OH 溶液Sigma-AldrichI0503-1VL
轨道摇床Yamato Scientific AmericaSOU-300
量子计Apogee InstrumentsMQ-510
SC完全培养基粉末Sunrise Science Products1459-100

参考文献

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标签

Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae

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