一种用于从人类中分离神经黑色素颗粒的可靠方案 死后黑质致密部 组织 通过 激光显微切割。该经过修订和优化的实验方案大幅缩短了样品采集所需时间，减少了所需样品量，并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析提高了蛋白质的鉴定与定量能力。
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方法文章
基于激光显微切割的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱LC-MS/MS分析方案
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摘要
摘要
神经黑色素是一种黑褐色色素，存在于黑质致密部多巴胺能神经元的所谓神经黑色素颗粒（NMGs）中。substantia nigra pars compacta。除了神经黑色素外，NMGs 还含有多种蛋白质、脂质和金属。尽管含有 NMGs 的多巴胺能神经元在帕金森病和路易体痴呆等神经退行性疾病中优先丢失，但目前对 NMGs 的形成机制及其在健康与疾病中的作用仍知之甚少。因此，进一步开展 NMGs 的分子特征研究至关重要。遗憾的是，常规的蛋白质分离方案依赖于密度梯度超速离心法，因而需要大量的人体组织。为此，本文建立了一种基于自动化激光显微切割（LMD）的方案，可使用极少量组织以无偏倚、自动化的方式收集 NMGs 及其周围的黑质（SN）组织。substantia nigra。随后通过质谱分析所获取的样本，以解析其蛋白质组组成。通过该工作流程共鉴定出 2,079 种蛋白质，其中 514 种蛋白质仅在 NMGs 中检测到，181 种仅在 SN 中检测到。将本研究结果与先前采用类似 LMD 方法的研究进行比较，两种蛋白质组的重叠率达到 87.6%，验证了本文所提出修订并优化方案的适用性。为验证当前发现，还通过靶向质谱（如平行反应监测（PRM）实验）对感兴趣的蛋白质进行了分析。
引言
每种组织均由多种不同细胞类型组成的异质性混合物，但针对特定细胞类型的分离往往是实现更精确表征的关键步骤。激光显微切割（LMD）将显微镜与激光技术相结合，是一种从复杂组织中特异性分离特定组织区域、单个细胞或细胞亚结构的有力工具。LMD与质谱技术联用（LMD-MS）已在多个研究领域成功应用，包括DNA的分离1，RNA2 和蛋白质3,4,5. 在本方案中，描述了一种经过修订和优化的激光显微切割-质谱（LMD-MS）方案，用于人类样本的蛋白质组学分析 死后 脑组织和亚细胞组分，以揭示帕金森病的新型发病机制。
神经黑色素是一种黑色、几乎不溶的色素，存在于儿茶酚胺能的多巴胺生成神经元中 黑质致密部6与蛋白质和脂质一起，它积聚在由双层膜包围的类细胞器颗粒中，称为神经黑色素颗粒（NMGs）。7,8,9从人类三岁起即可观察到神经元胞质中的包涵体（NMGs），其数量和密度随着衰老过程而增加10,11迄今为止，关于神经黑色素的形成尚无明确假说，但有一种假设认为，神经黑色素是通过多巴胺的氧化形成的。12其他假说基于神经黑色素的酶促生成（例如酪氨酸酶）13神经黑色素本身被发现对脂质、毒素、金属离子和农药具有高结合亲和力。基于这些发现，推测神经黑色素颗粒（NMGs）的形成可保护细胞免受毒性物质、氧化物质及环境毒素的蓄积危害。14,15除了这种神经保护功能外，有证据表明神经黑色素可能引起神经退行性效应，例如通过铁饱和及其随后对自由基的催化作用16,17此外，神经退行性过程释放的神经黑色素可被过氧化氢分解，从而释放出此前与神经黑色素结合的活性金属及其他有毒化合物，可能加速细胞坏死，并促进神经炎症和细胞损伤。18然而，迄今为止，NMGs 在帕金森病等神经退行性过程中的确切作用仍不明确。尽管如此，NMGs 似乎参与了帕金森病的发病机制，对其开展特异性分析对于揭示其在神经退行性变中的作用至关重要。遗憾的是，常用的实验动物（如小鼠和大鼠）及细胞系均缺乏 NMGs19因此，研究人员尤其依赖于 死后 用于分析的脑组织。过去，通过密度梯度离心法分离NMG依赖于大量组织的可获得性 黑质 组织20,21如今，激光显微切割（LMD）作为一种多功能工具，可从人脑样本中特异性分离无髓鞘神经元簇（NMGs），随后通过液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对其进行分析。
本方案介绍了一种先前方案22的改进型自动化版本，用于分离神经元周围网络（NMGs）及其周围组织（SN），可实现更快的样本制备、鉴定和定量的蛋白质数量显著增加，并大幅减少所需组织量。
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方案
人脑组织的使用已根据德国相关规定和指南，获得德国波鸿鲁尔大学伦理委员会批准（文件编号 4760-13）。本方案已应用于商业获取的黑质致密部组织切片。图 1 展示了本方案的示意图。
1. 组织切片
- 预冷冷冻切片机腔室。
注意：每种组织所需的冷冻切片机温度不同，具体温度可参考相应供应商的操作说明。 - 用70%乙醇清洁不锈钢刀片，并将其安装到刀片夹持器中。
- 将组织从-80 °C冰箱中取出，放入冰盒并转移至冷冻切片机，使其在腔室内适应温度15分钟。
- 使用铅笔明确标记膜片载玻片。
注意：激光显微切割（LMD）样本收集需使用PET/PEN膜片载玻片。操作时应小心处理PET/PEN膜片载玻片，因其极为脆弱。 - 在组织固定器上滴加一滴商用冷冻切片包埋介质。在介质完全冻结前，将组织置于其上并使其固化，从而使组织与固定器牢固连接。
- 将组织固定器安装至冷冻切片机腔室内，并在开始切片前调整其方向。最佳固定器方向取决于组织的取向。
注意：可能需要修剪组织，直至达到所需切片平面。 - 在到达目标组织区域前，将切片厚度调节至所需值。
注意：本方案建议切片厚度为5或10 µm，因20 µm厚的切片已被发现不适用于基于LMD的样本收集22。 - 先切下两片组织并弃去。
- 放下防卷板。
- 切取一片组织，小心打开防卷板，取一张膜片载玻片，并在将组织切片放置于膜片载玻片上时防止组织折叠。
注意：在粘附前将膜片载玻片存放于室温下，有助于样本准确附着。同一张膜片载玻片上可放置多个切片，但必须避免组织重叠。 - 将已放置组织切片的膜片载玻片保留在冷冻切片机中，直至完成全部切片操作。
- 将冷冻切片后的组织存放于-20 °C直至后续处理，或直接进行下述操作。将已切片的组织载玻片存放于-80 °C直至进一步使用。
2. 激光显微切割与压力弹射
注意：由于神经黑色素颗粒具有黑褐色，无需染色即可观察，因此本方案无需进行染色。然而，如有需要，可将本方案与其他不同的染色步骤联合使用。需注意的是，封闭液或抗体的使用将影响LC-MS/MS分析结果。
- 开启显微切割系统，并在计算机上打开相关软件（参见材料表）。
- 将组织膜玻片放入RoboStage的载物夹持器中，使组织面朝上。
注意：根据不同的激光显微切割（LMD）设备，可能需要将膜玻片的组织面朝下放置。通常情况下，样品采集应在温度受控的环境中进行，以确保最佳且可重复的实验条件。 - 将显微镜调至所需的放大倍数（此处使用50倍）以进行概览扫描。
- 在软件界面的Navigator窗口中使用“扫描”功能，获取组织切片的概览图像。在软件界面中找到目标区域的左上角和右下角并进行选择，然后点击扫描所有感兴趣区域（Scan all ROIs）以执行扫描。
注意：概览扫描并非必需，但有助于更好地定位玻片上的区域，且可保存供后续使用。 - 根据具体组织调整显微镜的放大倍数，本实验中黑质神经黑色素颗粒（neuromelanin granules）的放大倍数为400倍。
- 寻找含有神经黑色素颗粒的区域。在软件界面中选择视野分析（Field of View Analysis），勾选反转结果（Invert Result），并设置RGB通道的阈值，使预览窗口中仅神经黑色素颗粒以红色高亮显示。点击确定以应用调整后的设置进行视野分析。
注意：可能会出现其他深色小物体也被选中的情况。为避免此问题，在分离神经黑色素颗粒前，应删除所有面积小于100 µm2的物体。具体操作为：点击工具栏图标打开元素列表（Element List），选择当前玻片并按面积排序，选中面积小于100 µm2的元素并将其删除。 - 使用玻片上仅被膜覆盖的区域来调整激光参数。
注意：建议使用切割激光校准向导（Cut Laser Adjustment Wizard），并按照软件提示进行操作。不同玻片所需的激光参数可能有所不同。对于5 µm厚的切片在400倍放大下，典型的切割参数为能量32、聚焦51，激光脉冲弹射（LPC）参数为能量28、聚焦-1。 - 调整定位和切割的速度设置，以确保有效分离。
注意：实验发现30%的速度最适合神经黑色素颗粒（NMG）的分离。 - 在样品收集管盖中加入50 µL超纯水，并将管盖插入RoboMover的收集器中。
注意：本实验所用的管收集器一次只能容纳一个样品收集管。 - 通过软件界面将RoboMover移至RoboStage II上方，开始样品收集。
注意：具体操作为打开RoboMover窗口，该窗口会显示收集器。点击RoboMover窗口中显示的样品收集管盖，将其移至工作区域。在RoboMover窗口中调整合适的移动和工作高度，否则管盖中的水可能滴落到玻片上，或弹射出的样品无法进入管盖。 - 启动激光。在激光操作过程中监控能量和聚焦参数，并根据需要进行调整。确保前至少十个目标物体被正确分离并弹射至样品收集管盖中。
注意：必须通过视觉检查确认分离和弹射是否成功。成功操作应在组织切片上形成一个与预选目标物体大小一致的无组织区域（见图2C、D）。如果切割和弹射后目标仍附着在组织切片上，需调整激光参数。对于弹射操作，CenterRoboLPC模式被证明非常适合神经黑色素颗粒（NMG）的分离。每个选定目标的弹射参数可在元素列表（Element List）中单独调整。 - 采样完成后，将RoboMover移回起始位置，取出样品收集管。
注意：当收集的目标数量较少且个体较大时，可通过点击管盖检查（Cap Check）功能，将样品收集管盖置于显微镜下，以便计数管盖水中所含的目标数量（见图2H）。 - 使用离心机对样品进行离心。实验发现，以逐渐增加离心力的方式进行5秒的短时离心已足够。此时可将样品保存于-80 °C，所有样品应统一进行后续处理。
注意：为比较蛋白质组谱型，在切除神经黑色素颗粒（NMG）后，也对周围组织进行了分离。周围组织的分离在50倍放大下进行。 - 在真空浓缩仪中干燥样品。对于50 µL的水样，1.5小时的干燥时间已足够。
- 用40 µL甲酸在室温下溶解并裂解组织，持续20分钟。
- 将样品置于超声水浴中，在45 kHz（千赫兹）频率下超声5分钟以增强组织裂解效果。超声水浴中需加入冰块，防止离心管受热熔化。样品在进一步处理前应保存于-80 °C。
3. 胰蛋白酶消化
- 将样品置于冰上解冻。
- 使用真空浓缩仪将样品完全干燥。
- 加入50 µL合适的消化缓冲液（例如50 mM碳酸氢铵）重悬样品。
- 加入1.25 µL 200 mM的1,4-二硫苏糖醇后，将样品在60 °C、300 rpm条件下于恒温混匀仪中孵育30分钟，随后冷却至室温（RT）。
- 再加入1.36 µL 0.55 M碘乙酰胺，在避光条件下室温孵育30分钟。
- 向样品中加入适量胰蛋白酶，在37 °C孵育过夜（约16小时）。
注：对于1,000,000 µm2的样品面积，0.1 µg胰蛋白酶已足够。 - 向样品中加入2.6 µL 10%三氟乙酸（TFA）以终止消化反应（终浓度为0.5% TFA）。
- 使用真空浓缩仪将样品完全干燥，然后用0.1% TFA定容至特定体积。NMG样品定容至20 µL，每次质谱（MS）实验使用5 µL。
- 将样品储存于-80 °C直至后续使用。通过氨基酸分析或其他合适的定量方法（如Direct Detect）测定肽段浓度。
注：样品量较小时，上述方法可能无法准确定量。为确保上样量一致，每个样品应含有相同量的分离组织，并且所有样品应接受相同的处理。
4. 高效液相色谱与质谱分析
注意：以下高效液相色谱（HPLC）质谱（MS）分析方法是针对本实验所用的带有捕获柱装置的液相色谱系统和质谱仪进行优化的（参见材料表）。对于其他液相色谱和质谱系统，建议调整参数。
- 使用软件 Xcalibur，按如下方式调整高效液相色谱（HPLC）设置：
- 捕获柱：设置温度为 60 °C，流速为 30 µL/min，运行缓冲液为 0.1% 三氟乙酸。
- 分析用 C18 反相色谱柱：设置温度为 60 °C，流速为 30 µL/min，运行缓冲液 A 为 0.1% 三氟乙酸，运行缓冲液 B 为 84% 乙腈，梯度设置为在 98 分钟内由 5%–30% 的运行缓冲液 B 进行洗脱。
注意：当使用不同组织或细胞时，调整梯度可能是不可避免的，强烈建议进行优化。由于梯度开始前的样品上样及梯度结束后的样品清洗步骤，总梯度时间可能有所变化。本方案中的总梯度包括 7 分钟的样品上样和额外 15 分钟的色谱柱清洗，因此总梯度时间为 120 分钟。
- 在 HPLC 软件路线图菜单中找到 XCalibur 仪器设置，创建数据依赖性采集（DDA）方法。
- 在 全局参数 选项卡中，定义进样模式为 液相色谱，预期液相色谱峰宽（30 秒），以及 默认电荷态（2）。
- 进入 扫描参数 选项卡，并按顺序添加以下扫描和过滤条件：MS OT、MIPS、强度、电荷态、动态排除 和 ddMS2 OT HCD。
注意：各扫描和过滤条件的详细参数设置见 补充表 1。最佳质谱及 DDA 设置可能因所用质谱仪型号以及样品类型的不同而有所差异，因此应进行相应调整。 - 将 200–400 ng 样品肽溶解于含有 0.1% TFA 的惰性质谱玻璃进样小瓶中的确定体积内，以制备样品。若因样品量过少而无法准确测定浓度，可通过比较总离子流（TIC）来确认各样品上样量一致。
注意：为此，可在合适的软件（例如 FreeStyle）中打开质谱检测结果文件，并检查色谱图。所有样品的信号强度应具有可比性。图 3 展示了一个典型的 TIC 图谱。 - 使用适合蛋白质组学分析的软件（例如 MaxQuant23、Progenesis QI for Proteomics 或 Proteome Discoverer）对获得的原始数据进行分析，并根据研究问题开展统计学数据分析。
使用 MaxQuant 分析蛋白质组原始数据
注意：MaxQuant 参数的详细信息见补充表 2，下文对其进行简要描述。
- 通过点击“Load”按钮，在原始数据标题下将原始文件加载到 MaxQuant 软件中。
- 通过点击 Set Experiment 来分配样本名称。
- 定义组别特异性参数。首先，添加修饰。由于样品处理过程，选择 Deamidation (NQ)、Oxidation (M) 和 Carbamidomethylation (N-term) 作为可变修饰，并添加 Carbamidomethylation (C) 作为固定修饰。
- 在 Digestion 选项卡中选择 Trypsin 作为消化酶。
- 在 Label Free Quantification 选项卡中添加标签自由定量选项 LFQ。如果需要处理的文件超过 10 个，选择 Fast LFQ 选项以缩短处理时间。添加 iBAQ 选项作为蛋白质定量的度量标准24。
- 确保所有其他组别特异性参数保持出厂设置。
- 进入 Global Parameters 选项卡，在 Sequences 选项卡中添加从 uniprot.org 获取的 FASTA 文件。相应地修改标识符规则，并添加分类学 ID，本例中为 homo sapiens 的 9606。
- 对于蛋白质定量，选择 Unique and Razor 肽段。
- 确保所有其他全局参数保持出厂设置。
- 点击 Start，并在 MaxQuant 分析完成后获取 proteingroups.txt 输出文件，用于在 Perseus 中进行进一步分析。
使用 Perseus 进行统计分析
- 在 Perseus 中载入 proteingroups.txt 文件，将 iBAQ 值添加为主列，并根据类型对所有其他列进行分类排序。
- 通过基于分类列的行筛选，去除诱饵（decoys）和污染物（contaminants）。
- 根据有效值对结果进行筛选。在当前分析中仅包含两个样本的情况下，选择的最小有效值数量为 1。
- 将 Perseus 的输出结果以 .txt 格式导出，以便在 Excel 等软件中进一步处理，并针对研究问题对结果进行评估。
7. 验证选定的蛋白质
注意：质谱数据验证的常用方法包括免疫组织化学染色或蛋白质印迹（Western Blot）。由于神经黑色素具有深色特性及其自发荧光性质，使用辣根过氧化物酶或荧光染料标记的抗体对神经黑色素颗粒内的蛋白质进行免疫染色均不可行。对于蛋白质印迹分析，需要极大量的 死后 因此，需要通过靶向质谱技术对所选蛋白质进行验证，在本研究中建立了平行反应监测（PRM）实验。
- 选择用于验证的蛋白质。选择这些蛋白质在DDA实验中已检测到的肽段。肽段应不含漏切位点或修饰，以确保定量结果可靠。
注意：验证某一特定蛋白质可能有多种原因，例如在所研究条件下其丰度存在差异。在代表性结果中，选择了细胞质动力蛋白1重链1（cytoplasmic dynein 1 heavy chain 1）作为验证对象，该蛋白在NMG和SN样品中丰度相当，因此可作为参考，用于确保样品上样量一致。 - 使用选定的肽段，通过HPLC软件建立PRM方法的初始版本。色谱条件和全局参数设置应与DDA方法保持一致。
- 将MS OT和tMS2 OT HCD添加为扫描类型。确保MS OT的设置与DDA方法相同。PRM方法的详细参数见补充表1。
- 对于tMS2 OT HCD，将选定的肽段作为包含列表添加。需输入氨基酸序列以及在DDA测量中观察到的m/z值。在首次PRM实验中，无需添加保留时间窗口，或可将t start设为0，t stop设为120（适用于120分钟梯度）。
- 使用合适的软件（例如Skyline）在测量后评估PRM方法，并获取包含列表中肽段的保留时间。对于包含的肽段，应确认在MS1扫描中至少有三个前体离子出现可比峰，在MS2扫描中至少有五个碎片离子峰可见，且质量误差较低（±5 ppm）。
- 优化PRM方法，例如通过提高tMS2 OT HCD扫描的分辨率，并在包含列表中添加保留时间窗口。
注意：在本研究实验中，3分钟的保留时间窗口被证明是合适的（即首次PRM实验中观察到的保留时间±1.5分钟）。 - 使用优化后的PRM方法，通过合适的软件在MS1和MS2水平上基于峰面积对目标肽段和蛋白质进行定量。
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结果
特异性分离 NMGs 和 SN 组织是成功应用本方案的最重要步骤。利用 LMD 仪器配套软件中的视野分析功能，可依据颜色自动选择 NMGs。因此，需先识别包含 NMGs 的组织区域（图 2A），然后执行设定适当颜色阈值的视野分析，从而实现对 NMGs 的标记（图 2B）。在过滤掉面积小于 100 µm² 的对象后，仅保留用于分离的 NMGs 标记（图 2C）。在调整激光参数后，即可实现对标记 NMGs 的精确分离（图 2D）。完成 NMGs 的分离后（图 2E），可在 50 倍放大条件下选择 SN 组织（图 2F），并进行分离（图 2G），以比较其蛋白质组谱型。对于 SN 组织，可通过
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讨论
激光显微切割（LMD）是一种广泛适用的技术，可用于分离特定组织区域、单个细胞或亚细胞结构。本文介绍了一种经过改进且自动化的操作流程，该技术被应用于特异性分离神经黑色素颗粒（NMGs）以及NMG周围组织（SN）。迄今为止，已有两种不同的方法用于从人组织中分离NMGs。 死后 脑组织已被发表并被广泛使用：
a) 一种不连续蔗糖梯度法，需消耗1 g substantia nigra 组织20。由于人脑死后substantia nigra组织稀有且对多个研究问题具有重要价值，若每位患者需要大量组织，则建立大样本队列研究将非常困难。因此，该方法被进一步优化，使分离足量NMGs所需的组织量减少至0.15 g26。然而，仍至少需要一整侧substantia nigra pars compacta的一半组织。
b) 利用LMD技术切除NMG。2016年，Plum等人建立了一种基...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF）的 de.NBI 项目（资助号 FKZ 031 A 534A）、欧洲鲁尔区蛋白质研究单位（P.U.R.E.）以及德国北莱茵-威斯特法伦州创新、科学与研究部资助的蛋白质诊断中心（ProDi）项目共同资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇 | AppliChem | A1101 | |
| 乙腈 | Merck | 1.00029.2500 | |
| 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | A6141 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | 56302 | |
| 碘乙酰胺 | AppliChem | A1666,0100 | |
| 500 微量离心管 | Carl Zeiss | 415190-9221-000 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | |
| PALM 显微切割系统 | Zeiss | 494800-0014-000 | |
| PEN 膜载玻片 | Carl Zeiss | 415190-9041-000 | |
| substantia nigra pars compacta 组织切片 | Navarrabiomed 生物样本库（西班牙潘普洛纳） | ||
| 三氟乙酸 | Merck | 91707 | |
| 胰蛋白酶（测序级） | Serva | 37283.01 | |
| Ultimate 3000 RSLC nano 液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | ULTIM3000RSLCNANO | |
| 软件名称 | 网址/公司 | 版本 | |
| FreeStyle | Thermo Fisher Scientific | 1.6 | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | 1.6.17.0 | |
| PALMRobo | Zeiss | 4.6 pro | |
| Perseus | https://www.maxquant.org/perseus/ | 1.6.15.0 | |
| Skyline | https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view | 20.2.0.343 | |
| XCalibur | Thermo Fisher Scientific | 4.3 |
参考文献
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