Method Article

基于激光显微切割的协议，用于神经黑色素颗粒蛋白质组学谱的LC-MS / MS分析

DOI:

10.3791/63289

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December 16th, 2021

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1Medizinisches Proteom-Center, Medical Faculty, Ruhr-University Bochum, 2Medical Proteome Analysis, Center for Proteindiagnostics (PRODI), Ruhr-University Bochum, 3Center of Mental Health; Clinic and Policlinic for Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital Wuerzburg, 4Psychiatry Department of Clinical Research, University of Southern Denmark Odense University Hospital, 5Center of Mental Health, Department of Child and Adolescent Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy, University Hospital of Wuerzburg, University of Wuerzburg

In This Article

Summary

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这里提出了一个强大的方案，用于通过激光显微切割从人死后黑质致密组织中分离神经黑色素颗粒。该修订和优化的方案大大减少了样品采集所需的时间，减少了所需的样品量，并通过LC-MS/MS分析增强了蛋白质的鉴定和定量。

Abstract

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神经黑色素是一种黑褐色色素，存在于 黑质致密的多巴胺能神经元中的所谓神经黑色素颗粒（NMG）中。除了神经黑色素，NMG 还含有多种蛋白质、脂质和金属。尽管含有NMG的多巴胺能神经元在帕金森病和路易体痴呆等神经退行性疾病中优先丢失，但对NMG形成的机制以及NMG在健康和疾病中的作用知之甚少。因此，进一步研究NMG的分子表征至关重要。不幸的是，蛋白质分离的标准方案基于密度梯度超速离心，因此需要大量的人体组织。因此，这里建立了一个基于自动激光显微切割（LMD）的协议，该协议允许以无偏，自动化的方式使用最少量的组织收集NMG和周围的 黑质 （SN）组织。随后通过质谱分析切除的样品以破译其蛋白质组组成。通过该工作流程，鉴定了 2，079 种蛋白质，其中 514 种蛋白质在 NMG 中独家鉴定，181 种在 SN 中鉴定。目前的结果已与先前使用类似基于LMD的方法的研究进行了比较，两种蛋白质组的重叠率为87.6%，验证了此处介绍的修订和优化方案的适用性。为了验证目前的发现，通过靶向质谱分析感兴趣的蛋白质，例如平行反应监测（PRM）实验。

Introduction

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每个组织都由不同细胞类型的异质混合物组成，但一种细胞类型的特异性分离对于更精确的表征通常是必不可少的。激光显微切割（LMD）将显微镜与激光应用相结合，是一种强大的工具，用于从复杂的复合材料中特异性分离组织区域、单细胞或细胞亚结构。LMD与质谱（LMD-MS）相结合的应用已经成功地应用于多个研究问题，包括DNA1，RNA2和蛋白质3，4，5的分离。在该协议中，描述了修订和优化的LMD-MS协议，用于人类死后脑组织和亚细胞成分的蛋白质组学分析，以破译帕金森病的新病理机制。

神经黑色素是一种黑色、几乎不溶性的色素，存在于黑质致密6的儿茶酚胺能、产生多巴胺的神经元中。它与蛋白质和脂质一起积聚在被双层膜包围的细胞器样颗粒中，称为神经黑色素颗粒（NMG）7，8，9。从三岁开始，可以观察到人类的NMG在衰老过程中数量和密度增加

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Protocol

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根据德国法规和指南，人类脑组织的使用得到了德国波鸿鲁尔大学伦理委员会的批准（文件编号4760-13）。该协议已应用于商业获得的 黑质致密 组织切片。所呈现协议的图形概述如图 1所示。

1. 组织切片

  1. 预冷低温恒温器室。
    注意:每种组织都需要不同的低温恒温器温度，可以在相应的供应商协议中找到。
  2. 用70%乙醇清洁不锈钢刀并将其安装到刀片架中。
  3. 使用保温盒将组织从-80°C冰箱转移到低温恒温器中，并使其调节到低温恒温器室温度15分钟。
  4. 使用铅笔明确标记膜玻片。
    注意:基于 LMD 的样品收集需要 PET/PEN 膜载玻片。小心处理PET / PEN膜载玻片，因为它们非常脆弱。
  5. 在组织支架上滴一滴商业冷冻切片培养基。在完全冷冻之前，将组织放在冷冻切片培养基上并使其变硬，使组织与组织支架连接。
  6. 在开始切片之前，将组织支架安装在低温恒温器室中并调整其方向。最佳支架方向取决于组织的方向。
    注意:可能需要修剪组织，直到达到切片所需的截面平面。
  7. 在到达感兴趣的组织区域之前，将切割设置调整为所需的组织厚度。
    注意:5 或 10 μm 是该协议的建议厚度，因为发现 20 μm 厚的切片与基于 LMD 的样品集合不兼容

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Results

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NMG和SN组织的特异性分离是成功应用该协议的最重要步骤。使用供应商提供的LMD软件中的视场分析功能，可以以颜色相关的方式自动选择NMG。因此，必须识别含有NMG的组织区域（图2A），并且必须执行具有调整颜色阈值的视场分析，从而标记NMG（图2B）。过滤覆盖面积低于100μm²的物体后，仅应保留NMG标记以进行隔离（图2C）。调整激光设置后，可实现标记NMG的精确分离（图2D）。分离NMG后（图2E），可以选择具有50倍放大倍率（图2F）和分离（图2G）的SN组织以比较蛋白质组学谱。对于SN组织，可以使用Cap检查功能可视化分离的物体（

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Discussion

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LMD是一种广泛适用的技术，用于分离特定组织区域，单细胞或亚细胞结构。在这里介绍的修订和自动化方案中，该技术应用于神经黑色素颗粒（NMG）和NMG周围组织（SN）的特异性分离。到目前为止，已经发表了两种从人类 死后 脑组织中分离NMG的不同方法并被广泛使用:

a） 消耗 1 g 黑质 组织的不连续蔗糖梯度20.由于人类 死后黑质 组织很少见，并且对几个研究问题非常感兴趣，不幸的是，如果每位患者需要大量组织，那么建立一个大型队列研究是非常具有挑战性的。因此，该方法得到了进一步改进，将NMGs26充分分离所需的组织量减少到0.15g。然而，仍然需要至少一半完整的 实质性黑质 。

b） 使用LMD切除NMG。2016年，Plum等人建立了一个基于通过LMD 精确 切除NMG的新协议。使用该协议，所需的样品量可以减少到十个10μm组织切片，从而使所需的.......

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Disclosures

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作者声明不存在利益冲突。

Acknowledgements

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这项工作得到了德的支持。NBI，德国联邦教育和研究部（BMBF）（批准号FKZ 031 A 534A）和P.U.R.E.（欧洲鲁尔蛋白质研究单位）和蛋白质诊断中心（ProDi）资助的项目，均来自德国北莱茵-威斯特法伦州创新，科学和研究部。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-二硫苏糖醇AppliChemA1101
乙腈默克1.00029.2500
碳酸氢铵Sigma-AldrichA6141
甲酸Sigma-Aldrich56302
碘乙酰胺AppliChemA1666,0100
微管 500卡尔蔡司415190-9221-000
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪Thermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFADBBHQ
PALM MicroBeam蔡司494800-0014-000
PEN 载玻片Carl Zeiss415190-9041-000
黑质 pars compacta 组织切片Navarrabiomed 生物样本库（西班牙潘普洛纳）
三氟乙酸默克91707
胰蛋白酶测序级Serva37283.01
Ultimate 3000 RSLC 纳米液相色谱系统赛默飞世尔科技ULTIM3000RSLCNANO
软件名称<strong>Weblink/CompanyVersion
FreeStyleThermo Fisher Scientific1.6
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/1.6.17.0
PALMRoboZeiss4.6 pro
Perseushttps://www.maxquant.org/perseus/1.6.15.0
Skylinehttps://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view20.2.0.343
XCaliburThermo Fisher Scientific4.3

References

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  1. Li, C., et al. DNA profiling of spermatozoa by laser capture microdissection and low volume-PCR. PloS One. 6 (8), 22316(2011).
  2. Butler, A. E., et al. Recovery of high-quality RNA from laser capture microdissected human and....

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Laser MicrodissectionNeuromelanin GranulesProteomic AnalysisMass SpectrometrySubstantia NigraProtein QuantificationLabel Free QuantificationTryptic DigestionParallel Reaction MonitoringDopaminergic Neurons

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