基于适配体亲和微珠的微流控声泳技术用于革兰氏阴性菌的流通式分离

摘要

本文介绍了利用微流控声泳技术以及适配体修饰的微珠，制备和操作微流控声泳芯片的方法，该芯片可用于从培养基中快速、高效地分离革兰氏阴性菌。

摘要

本文介绍了一种利用微流控声泳技术及适配体修饰的微珠，用于从培养基中快速、高效分离革兰氏阴性菌的微流控声泳芯片的制备与操作方法。该方法通过结合长方形微通道结构，提高了分离效率。在该系统中，样品和缓冲液通过流量控制器注入进样口。为实现微珠的居中定位和样品分离，通过信号发生器和功率放大器向压电换能器施加交流电，从而在微通道内产生声辐射力。芯片的进样口和出样口均设有分叉通道，可同时实现分离、纯化和浓缩。该装置的回收率高达>98%，纯度可达97.8%，且可实现最高10倍的浓度富集。本研究展示的回收率和纯度均优于现有细菌分离方法，表明该装置能够高效分离细菌。

引言

除了基于介电转移、磁泳、微珠提取、过滤、离心微流控、惯性效应以及表面声波的方法外，微流控平台也正在被开发用于从医学和环境样本中分离细菌^1,2。 对致病菌的检测通常采用聚合酶链式反应（PCR）进行，但该方法通常耗时较长、操作繁琐且复杂^3,4。微流控声泳系统提供了一种替代方案，可实现适中的通量和非接触式的细胞分离^5,6,7。声泳是一种利用声波引起物质移动现象来分离或富集微珠的技术。当声波进入微通道时，微珠会根据其尺寸、密度等特性被分选，同时细胞也可依据悬浮介质的生化和电学特性实现分离^7,8。因此，近年来已有大量关于声泳技术的研究被积极展开^9,10,11，并且最近已提出针对驻波表面声波微流控中由边界驱动声流诱导的声泳运动的三维数值模拟方法¹²。

多个研究领域正在探索如何替代抗体^2,3。适配体是一种具有高选择性和特异性的靶向分子，目前已有大量相关研究^2,9,10,13。与抗体相比，适配体具有分子量小、生物稳定性好、成本低和可重复性高等优势，现正被广泛应用于诊断和治疗领域的研究中^2,3,14。

本文介绍了一种微流控声泳技术方案，可用于利用适配体修饰的微珠快速、高效地从培养基中分离革兰氏阴性（GN）细菌。该系统通过单一压电驱动，同时激发长方形微通道内的两个正交共振模式，产生二维（2D）声驻波，使连接适配体的微珠在波节和波腹位置排列并聚焦，从而提高分离效率^2,11,15,16 。在入口和出口处均设有分叉通道，可实现分离、纯化和浓缩的同步进行。

该方案可能对细菌性传染病的早期诊断领域具有帮助，同时可通过实时水质监测，对致病性细菌感染实现快速、选择性强且灵敏的响应。

方案

1. 微流控声泳芯片设计

注意：图1 展示了通过声泳法从微通道中分离和收集目标微珠的示意图。微流控声泳芯片使用CAD程序进行设计。

1. 设计一种微流控声泳芯片，使用适配体修饰的微珠与对应细菌尺寸的链霉亲和素包被聚苯乙烯（PS）微珠的混合物，以研究该装置的分离性能。
2. 设计一种微流控声泳芯片，在将PS样品混合物注入样品入口后，使PS微珠被收集至目标出口，其余组分则通过废液出口排出（见图2和Table 1）。
   注意：为此，声流控芯片设计包含两个用于注入样品和缓冲液的入口、一条主通道以及附着的压电换能器（PZT），以使微珠在通道中心对齐，同时还设有两个出口，分别用于收集目标样本和排出废液（图3A）
3. 设计一种微流控声泳芯片，使微珠、缓冲液、细菌和适配体共同流经主通道，并通过PZT诱导的片上声泳效应使微珠在通道中心对齐（图3B、C）

2. 微流控声泳芯片的制备

注意：按以下顺序组装四层结构：硼硅酸盐玻璃-硅层、硅层、硼硅酸盐玻璃层和PZT层，如图3A、B所示。

1. 使用喷砂法¹⁷在硼硅酸盐玻璃（最上层）的入口和出口处制备直径为 2 mm 的孔，用于连接聚醚醚酮（PEEK）管。硼硅酸盐玻璃的尺寸为 20 × 80 × 0.5 mm³。
2. 准备一层厚度为 200 µm 的硅通道层，该层通过光刻胶和深反应离子刻蚀（RIE）获得的硅图案形成横截面积为 0.2 × 0.2 mm² 的微通道¹⁸。在反应离子刻蚀过程中，为样品和缓冲液入口通道以及收集和废液出口通道钻出直径为 1 mm 的孔。
   注：此处离子刻蚀采用 RIE 工艺形成微通道。在硅片上涂覆呈通道形状的光刻胶（PR），用于制备硅通道层。将涂有光刻胶的硅片置于等离子体中进行刻蚀，等离子体通过向氟气施加 13.56 MHz 频率产生¹⁸。
3. 将步骤 2.2 中制备的硅层（20 × 80 × 0.5 mm³）上下各键合一层硼硅酸盐玻璃（尺寸同为 20 × 80 × 0.5 mm³），其中下层硼硅酸盐玻璃在步骤 2.1 中已与硅层结合，第三层硼硅酸盐玻璃则通过在 1,000 V 和 400 °C 条件下进行阳极键合完成¹⁹。
4. 使用氰基丙烯酸酯胶粘剂（10 µL 或更少）将压电陶瓷（PZT，尺寸为 20 × 40 mm²）沿微流控通道方向粘附至硼硅酸盐玻璃层上。
   ​注：使用棉签将胶粘剂以极薄的一层涂布于通道区域，以尽量减少高度变化。图 3C 为该装置的照片。

3. 细菌菌株与培养

注意：请参考表2选择并培养革兰氏阴性（GN）和革兰氏阳性（GP）细菌用于实验。培养方法参见步骤3.1–3.4。所有细菌均需在有氧条件下培养，直至在600 nm处的吸光度达到0.4（OD₆₀₀）。

1. 对于革兰氏阴性菌（GN细菌），例如 大肠杆菌 DH5α, 大肠杆菌 KCTC2571 Sphingomonas insulae，以及 Pseudomonas pictorum 以及革兰氏阳性菌（GP细菌），例如 表皮葡萄球菌 和 Staphylococcus pasteuri在LB培养基中，37 °C、220 rpm条件下振荡培养16小时。
2. 对于 肠杆菌属 （GN）和 Bacillus megaterium （GP；KCTC 1021），在37 °C、220 rpm条件下于营养肉汤培养基中培养16小时。
3. 对于 Enterococcus thailandicus （GP），在37 °C、220 rpm条件下于脱脂乳、罗果斯和夏普（MRS）培养基中孵育16小时。
4. 对于 Listeria grayi （GP），在37 °C、220 rpm条件下于脑心浸液培养基中孵育16 h。
5. 离心机（9056 × g） g在室温（RT）下将培养的细菌处理1分钟，然后用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。
6. 将所选的革兰氏阴性（GN）和革兰氏阳性（GP）细菌重悬于PBS缓冲液中以进行分析。

4. 微珠及适配体在微珠上的固定

1. 使用前将链霉亲和素包被的微珠（10 µm）混合物（材料表）重新悬浮（通过涡旋混合20秒）。
2. 将适配体在95 °C下变性3分钟，然后在0 °C下复性2分钟，以进行制备。
3. 将250 µL重悬后的链霉亲和素包被微珠混合物转移至1.5 mL离心管中，用Tris-HCl缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，1 mM MgCl₂，5 mM KCl，100 mM NaCl）在室温下洗涤。然后向管中加入100 µL生物素标记的DNA适配体。
4. 将混合物在室温下孵育30分钟，同时旋转（25 rpm）。
5. 离心（9056 × g）后，在室温下用200 µL Tris-HCl缓冲液洗涤管内样品两次。
6. 向洗涤后的样品管中加入10 µL BSA（100 mg/mL），在室温下旋转孵育30分钟（25 rpm）。
7. 最后，通过离心（9056 × g）在室温下用Tris-HCl缓冲液洗涤适配体修饰的微珠两次。

5. 声泳装置的设置与操作

1. 将PEEK管连接至两个用于注入样品和缓冲液的入口，以及两个用于收集和排放废液的出口（图4）。
2. 使用10 mL注射器手动将无气泡的去离子水注入微流控声泳通道中。
3. 准备一个具有两个或更多输出通道的精密压力控制器以控制流体流动。然后，分别将样品和缓冲液注入带有两个孔的瓶盖的样品瓶和缓冲液瓶中，并连接至芯片入口。
   注意：具有两个或以上输出通道的精密压力控制器可用多个独立的精密压力控制器替代。在缓冲液入口处，通过流量控制器注入能够形成层流的缓冲液，以防止样品注入过程中样品向通道中心移动。
4. 设备准备就绪后，使用精密压力控制装置在样品入口施加2 kPa压力，在缓冲液入口施加4 kPa压力，以注入样品和缓冲液。
   注意：此时，为了实现平稳的层流，缓冲液的注入压力应高于样品的注入压力。流速由固定在连接至入口通道的吸液装置上的流量控制器调节。
5. 通过显微镜观察，同时利用PZT调节使微珠聚焦并移动至微流控通道的中心位置。
   注意：微珠尺寸越大，对声波的影响越显著，因此更容易与波节对齐。函数发生器配合放大器向PZT供电，在微通道内产生正弦波。由于微通道上下部分由玻璃制成，产生的正弦波会被反射，从而形成波节⁷。
6. 使用单通道函数发生器产生3.66 MHz的共振频率，并通过功率放大器将信号放大16 dB（约9倍）（图4）。
   注意：驱动器的共振频率必须与通道尺寸匹配；由于通道为方形结构，PZT需在精确频率下工作以形成单一波节。
7. 使用荧光显微镜和以1,200帧/秒运行的高速相机观察声流控芯片上的分离与富集过程。
8. 通过检查荧光显微镜相机拍摄的与细菌结合的微珠图像，以及从收集口和废液出口排出的样品中的细菌图像，定量分析革兰氏阴性菌（GN细菌）和革兰氏阳性菌（GP细菌）的存在与否。
   注意：含有缓冲液、细菌和适配体的微珠流经主通道，在PZT诱导的芯片内声泳作用下，微珠被集中至通道中央。最终，结合了GN细菌的微珠从收集出口被收集，未被捕获的细菌则通过废液出口排出。

结果

图5展示了微珠流动图像随PZT电压（关闭、0.1 V、0.5 V、5 V）变化的情况。在本研究介绍的声泳芯片中，随着PZT电压的增加，10 µm微珠在通道中心的聚集程度也随之增强。在PZT电压为5 V时，大部分10 µm微珠均集中于通道中央。根据该结果，在单通道函数发生器中产生了3.66 MHz的共振频率，并通过功率放大器将信号放大了16 dB（约9倍）。

表3显示了将1 µm（细胞大小）和10 µm（适配体结合微珠）的微珠混合物注入本研究使用的声流控芯片后，根据出口流速（400、450和475 µL/min）评估的芯片分离性能结果。回收率是指在出口收集到的10 µm微珠数量与注入的总微珠数量之比，分别为98% ± 2.2%、98% ± 2.5%和90% ± 9.8%。纯度是指收集到的微珠中10 µm微珠所占的比例，分别为97.1% ± 3.6%、97.6% ± 2.4%和99.4% ± 0.6%。这表明该装置对尺寸为10 µm的微珠具有较高的分离效率。

讨论

我们开发了一种基于连续运行方法的声悬浮微流控装置，可根据革兰氏阴性菌（GN细菌）的尺寸、类型以及适配体修饰的微珠，快速从培养样品中捕获并转移目标细菌。该装置采用长方形微通道，相较于先前报道的方案^{20,21,22,23,24,25,26}，在二维声泳应用中具有更简化的结构设计和更高的成本效益。该装置在最高达10倍剂量浓度条件下，回收率可达>98%。本研究在细菌分离方面表现出高于现有无标记方法^20,21,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 µm 聚苯乙烯微珠	Bang Laboratories	PS04001	细胞尺寸微珠
10 µm 链霉亲和素包被微珠	Bang Laboratories	CP01007	适配体亲和微珠
4英寸硅片/SU-8模具	4science	29-03573-01	芯片组件
适配体	Integrated DNA Technologies	GN3-6'	用于细菌偶联的RNA
硼硅酸盐玻璃	Schott	BOROFLOAT 33	芯片组件
离心机	Daihan	CF-10	洗涤颗粒
氰基丙烯酸酯胶水	3M	AD100	将PZT粘附至微芯片
大肠杆菌 DH5α	KCTC	KCTC2571	目标细菌
函数发生器	GW Instek	AFG-2225	生成频率
高速相机	Photron	FASTCAM Mini	观察分离过程
加热板	As one	HI-1000	用于固化液态PDMS的加热板
KOVAX-SYRINGE 10 mL 注射器	Koreavaccine	22G-10ML	用无气泡的去离子水填充微流控声泳通道
液态聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	芯片组件
LB肉汤（Miller配方）	BD Difco	244620	细胞培养（Luria-Bertani培养基）
显微镜	Olympus Corp.	IX-81	观察分离过程
PBS缓冲液	Capricorn scientific	PBS-1A	洗涤细菌
PEEK管	Saint-Gobain Ppl Corp.	AAD04103	注入或收集颗粒
压电换能器	Fuji Ceramics	C-213	在通道中产生特定波形
功率放大器	Amplifier Research	75A250A	放大频率
压力控制器/μflucon	AMED	AMED-μflucon	空气压力/流量控制
Tris-HCl缓冲液	invitrogen	15567027	洗涤颗粒
管式旋转仪	SeouLin Bioscience	SLRM-3	修饰适配体与微珠