乳酸菌（LAB）培养物的质量控制评估已被证实是提高乳酸菌菌株在发酵过程中存活率和功能性的有效方法。为支持这一观点，我们制定了一项方案，阐明了乳酸菌培养物如何被激活并培养用于发酵和生物加工过程。
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摘要
摘要
乳酸菌（LAB）是乳制品发酵过程中必不可少的起始菌种，广泛用于酸奶和奶酪等发酵乳制品的生产。乳酸菌主要将乳酸作为发酵的主要终产物，并合成多种重要代谢物，赋予发酵食品特有的感官特性。乳酸菌为营养要求苛刻的细菌，当营养条件充足时，可在多种环境中良好生长。食品和乳品工业对高品质乳酸菌起始菌种的需求日益增长，因而需要为所有生物加工过程提供具有活性且存活良好的菌种。因此，建立一套标准操作规程，以确保乳酸菌菌种在实验室及乳品加工环境中的存活率和功能增强，具有极其重要的意义。针对弱化、应激或受损乳酸菌细胞复苏的相关问题，制定一套清晰详尽的操作流程，以恢复菌体活力、促进细胞再生并提升其代谢功能，显得尤为关键。同时，维持乳酸菌起始菌种的纯度、功能性和存活率也同样重要。因此，遵循统一的操作规程，将有助于提升多种乳酸菌菌株在发酵及生物技术工艺中的发酵性能。为此，北卡罗来纳农业和技术州立大学食品微生物学与生物技术实验室已开发出一套针对特定乳酸菌菌株的活化与质量控制标准操作规程，成功获得了高活性、高存活率的乳酸菌菌株，并将其应用于发酵相关研究。在乳品和食品工业中推广并采用此类标准规程 ，将有助于确保乳酸菌在多种应用中的存活能力与功能表现。
引言
乳酸菌（LAB）是一类具有独特多样性的细菌，具有工业应用潜力。属于德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的菌株通常被用作发酵乳制品（如酸奶）的乳品发酵剂1。某些选定的乳酸菌菌株还被归类为益生菌，因为在适当剂量下可对人体健康产生有益作用2。乳酸菌也是革兰氏阳性、不形成孢子、不进行呼吸但耐氧的微生物，通常以产生乳酸作为主要发酵产物为其特征。乳酸菌还能合成多种必需代谢物，例如有机酸、细菌素及其他抗菌化合物3，这些物质可抑制多种食源性病原菌4。乳酸是碳水化合物分解代谢的主要终产物，也是乳酸菌发酵的副产物，是一种具有抗菌特性的有机代谢物，在食品生物防腐领域具有潜在应用价值3,5,6。此外，乳酸菌产生的有机酸还能赋予食品风味、质地和香气，从而改善其整体感官特性5,6。乳酸菌具有独特的营养需求且分布广泛，因此能够在乳制品、发酵食品、蔬菜以及人体肠道等多种环境中易于生长繁殖7。
随着乳酸菌（LAB）在酸奶生产及多种乳制品应用中对发酵剂培养物的需求不断增长8,9，因此在乳酸菌菌株的培养过程中，尤其是在冻干菌株和分离菌株的活化过程中，必须给予充分重视并遵循既定的科学方法，因为该操作对提升发酵性能至关重要。为此，食品微生物学与生物技术实验室积极致力于开发适宜的技术，以促进从发酵乳制品及用于酸奶生产的工业发酵剂中分离得到的乳酸菌菌株的活化、优良生长及其发酵特性。此外，值得注意的是，工业生产的乳酸菌培养物通常会经历冷冻干燥和冷冻保存等保护性处理，这些过程会使细胞遭受冷激，从而导致细胞应激和损伤10。为了减轻乳酸菌菌株在分离食品或冻干产品中可能出现的活力下降问题，并提升其功能特性，对这些菌种进行适当的活化作为质量控制手段显得尤为重要，以增强其发酵能力8。本研究旨在建立一套实验室内部的质量控制方案，用于L. delbrueckii subsp. bulgaricus菌株的活化与生长，从而促进乳酸菌的可存活生长，并提高其发酵性能和代谢功能。该方案可通过使用最佳培养基和适宜的培养条件，进一步推广应用于其他乳酸菌菌株的培养，服务于发酵研究、工业用途或生物加工操作。因此，这一乳酸菌活化与质量控制方案将确保获得高活力且具备潜在功能性的乳品发酵剂，在全球乳制品和食品工业的多种应用中发挥重要作用。
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方案
1. 通用材料与方法
- 德氏乳杆菌的来源 亚种 bulgaricus
- 获取 L. bulgaricus 来自可靠来源的菌株。
注意：在本研究中，共五名（5） L. bulgaricus 菌株用于质量控制研究（表1）。两种冻干菌株 L. bulgaricus 用于发酵乳制品工业化生产的菌种由保加利亚普罗夫迪夫食品技术大学生物技术系的Albert Krastanov博士提供。从美国市场上销售的商业酸奶产品中分离得到的两个菌株来自-80 °C 北卡罗来纳州立大学食品微生物学与生物技术实验室的菌种保藏&州立大学，另一株冻干菌株由供应商C提供。所有乳酸菌（LAB）菌株均保存于-80 °C。80 °C 直至进一步使用。另一种细菌菌株（Limosilactobacillus reuteri) 从 - 获得80 °C 北卡罗来纳州立大学食品微生物学与生物技术实验室的菌种保藏&中国台湾州立大学也接受了评估。
- 获取 L. bulgaricus 来自可靠来源的菌株。
- 标准L. MRS发酵肉汤培养基
- 将55 g MRS培养基和0.5 g L-半胱氨酸完全溶解于1 L去离子水（DW）中，配制deMan、Rogosa和Sharpe（MRS）培养基。
- 将制备好的MRS溶液分别取7 mL和2 mL加入试管中，于 121 °C 15分钟，然后在室温（RT）下冷却。
- MRS 琼脂培养基
- 将55 g MRS和0.5 g L-半胱氨酸完全溶解于1 L去离子水中，加入15 g琼脂粉，于 121 °C 15分钟，然后在水浴中冷却。
- 将所有新配制的培养基倒入无菌培养皿中，并于 4 °C 直至进一步需要时
- 改良强化梭菌培养基-丙酮酸（mRCM-PYR）
- 根据 Oyeniran 等人的方法优化强化梭菌培养基13 和 Nwamaioha 与 Ibrahim18，用于选择性及准确计数 L. bulgaricus 通过溶解10 g胰蛋白胨#3、10 g牛肉浸膏、5 g酵母提取物、5 g氯化钠、3 g乙酸钠和2 g磷酸氢二钾, 0.1 g 尿嘧啶，0.25 g 氯化钙，5 g 葡萄糖，5 g 果糖，10 g 麦芽糖，2 g 丙酮酸钠，0.2% 吐温 80，以及 0.5 g L-半胱氨酸，溶于 1 L 去离子水中。
- 使用6 N HCl将溶液的最终pH值调节至6.0 ± 0.2，然后加入0.008%苯胺蓝和15 g琼脂。将培养基在高压灭菌器中灭菌 121 °C 15分钟，然后在水浴中冷却，倒入无菌培养皿中。将所有新配制的培养基置于无菌培养皿中保存于 4 °C 直到需要时
- 乳酸菌培养物的甘油菌种保存液
- 制备甘油 stocks（50% 甘油），将 100% 甘油与 DW 等体积混合稀释，并在 100 °C 使用干热灭菌循环处理30分钟。将甘油菌种冷却至室温，并在无菌条件下保存以备后续使用。
- 使用细菌生长（单个菌落） L. bulgaricus 使用所开发的QC方案从过夜培养物中获得。
- 移液器 500 µL 将过夜培养物转移至含有50%甘油的2 mL离心管中，轻轻混匀。将含有乳酸菌（LAB）培养物的甘油冻存液于-80 °C超低温条件下冷冻保存。80 °C 直到需要时
注意：图示展示了乳酸菌（LAB）培养物质量控制与活化的实验流程方案。 图1.
| 编号 | 产品编号 | 样品 | 来源 | 标注的细菌组成1 |
| 1 | S9 | 纯工业菌株 | 保加利亚 | Lb. bulgaricus |
| 2 | LB6 | 纯工业菌株 | 保加利亚 | Lb. bulgaricus, |
| 3 | ATCC 11842 | 纯工业菌株 | ATCC | Lb. bulgaricus |
| 4 | DAW | 酸奶 | 美国 | Lb. bulgaricus，其他活性菌种 |
| 5 | E22 | 酸奶 | 美国 | Lb. bulgaricus，其他活性菌种 |
| 6 | Reuteri | 酸奶 | 美国 | Limosilactobacillus reuteri |
| 1Lb. =Lactobacillus | ||||
表1：益生菌菌株。 本表列出了本研究中使用的益生菌菌株。
2. LAB 菌种活化与质量控制方案
- 从-80 °C超低温冰箱中取出已制备好的乳酸菌（LAB）菌株甘油保藏管（置于2 mL离心管中），使用前切勿使其融化。
- 用70%酒精清洁并消毒离心管管口，使用前轻轻涡旋混匀。
- 用移液器将约250 µL（0.25 mL）保藏菌液从离心管转移至新鲜的2 mL MRS试管中。
- 轻轻涡旋混匀，用封口膜密封试管，并在42 °C下厌氧培养过夜12-16小时。
- 从2 mL MRS试管中取约500 µL（0.5 mL）过夜培养物，转移至新鲜的7 mL MRS试管中，涡旋混匀后在42 °C下厌氧培养过夜12-16小时。
- 使用紫外-可见分光光度计在610 nm波长下测定培养物的光密度（OD）或生长情况，记录OD值在0.7至0.9之间的结果为可接受范围。
- 将7 mL MRS试管中的过夜培养物划线接种于MRS和MRCM-PYR琼脂平板上，在42 °C下厌氧培养72小时。
- 从琼脂平板上挑取单菌落，转移至新鲜的7 mL MRS试管中，轻轻涡旋混匀，并在42 °C下厌氧培养过夜12-16小时。
- 将含有分离菌株的琼脂平板在4 °C冰箱中保存一周。
- 测定并确认从划线平板分离的乳酸菌在7 mL MRS试管中培养后的OD值（610 nm波长下，OD值应在0.7至0.9之间），并将这些培养物作为后续相关实验的工作菌种。
- 使用9 mL蛋白胨水（一种生理缓冲液）对最终7 mL MRS试管中培养的乳酸菌进行十倍系列稀释（连续稀释），以获得1:10的稀释比例。
- 最后，从适当的系列稀释液中取约250 µL（0.25 mL）用于所有发酵实验。
- 将步骤2.12中含菌株的液体培养基（250 µL）转移至新鲜的7 mL MRS液体培养基中，在42 °C下厌氧培养16小时以激活菌种。
- 继续重复步骤2.6-2.12，以确保乳酸菌培养物具有良好的活性和优异的细胞生长状态。
注：所有 L. bulgaricus 菌株均在新配制的MRS液体培养基中活化，并在42 °C下厌氧培养16小时，使其细菌生长光密度（OD610 nm）达到0.7至0.9之间。细菌生长通过紫外-可见分光光度计在610 nm波长下测定。由于乳酸菌发酵产生乳酸这一有机终产物，过夜培养物的pH值范围为3.5至5.3。实验过程中严格遵守安全操作规程，如确保生物安全柜内气流正常流通，使用本生灯时避免烫伤等。
图1：乳酸菌（LAB）培养物活化方案的示意图。 该示意图提供了操作和活化乳酸菌菌株所需的详细步骤及基本仪器。 请点击此处查看此图的放大版本。
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结果
采用质量控制方案培养的乳酸菌（LAB）菌株的细胞生长情况与未采用该标准方案培养的菌株相比存在显著差异（P < 0.05）。针对 L. bulgaricus 和 L. reuteri 的质量控制方案均采用多次传代方法（在划线接种至琼脂平板前连续传代三次），而对照组仅传代一次，其余培养条件保持一致。使用该标准质量控制方案培养的菌株在生长培养基平板上的菌落生长更为旺盛且形态清晰。这证实了该方案可通过促进发酵肉汤中的细胞分裂，有效增强乳酸菌的生长，从而促进乳酸菌菌株的细胞代谢。采用和未采用所建立的质量控制方案培养的两种菌株的生长情况如图2所示。在观察并测定到旺盛生长（OD610 nm为0.7–0.9）后，将菌株划线接种至琼脂平板，并在42 °C下厌氧培养72小时，随后沿划线区域观察到清晰分离的菌落。另一项研究（图3）进一步验证了该质量控制方案在TPY培养基中培养Lactobacillus reuteri时的有效性，培养温度为37 °C。采用质量控...
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讨论
所有菌株在使用质量控制方案与未使用该方案条件下的实验结果一致，因此仅展示了与特定菌株（S9和LB6）相关的结果。经活化的乳酸菌（LAB）菌株表现出更优的细胞生长，其特征为细胞生物量浓度高，从而使试管中的MRS发酵肉汤呈现浑浊外观11。在42 °C的厌氧发酵温度下，培养活化后的细胞生长在12至16小时之间表现明显。此外，根据本方案活化的LAB菌株在多次连续传代培养过程中，其菌落形态持续发生变化12，沿划线区域可见清晰分离的单菌落。对照实验未采用该标准方案，仅进行一次传代培养；尽管其生长水平仍在光密度OD610 nm值0.7–0.9的可接受范围内，但发酵肉汤中未出现明显的浑浊现象。值得注意的是，将对照菌株在琼脂平板上划线并按照标准程序相同的条件进行厌氧培养后，所形成的菌落较标准方案相比更小且数量更少13。
这可能是由于乳酸菌（LAB）细胞具有较弱的活力和非理想的存活特性所致。因此，对乳酸菌菌株进行多次传代培养并在琼脂平板上...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本出版物由美国国家食品与农业研究所（NIFA）资助项目（项目编号 NC.X-267-5-12-170-1）完成，并部分得到荷兰 NIZO 食品研究有限公司、美国 Jarrow Formulas 公司以及北卡罗来纳农业与技术州立大学家庭与消费者科学系和农业研究站（美国北卡罗来纳州格林斯伯勒，邮编 27411）的支持。本工作还部分获得了1890年能力建设项目资助（项目编号 2020-38821-31113，项目 accession 编号 021765）的支持。此外，本工作还部分得到了保加利亚教育与科学部在2018年8月17日第577号政府决议批准的国家研究计划“健康食品促进强大生物经济与生活质量”的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 苯胺蓝 | Thermo Scientific | R21526 | 25 g |
| 牛肉浸膏 | Research Products International | 50-197-7509 | 500 g |
| 酵母提取物 | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| 氯化钙二水合物 | Fisher Scientific | C79-500 | 500 g |
| 无水葡萄糖 | Fisher Scientific | BP350500 | 500 g |
| D-果糖 | ACROS Organics | AC161355000 | 500 g |
| Difco 琼脂粉 | Difco | DF0812-07-1 | 2 kg |
| TPY 琼脂 | Difco | 211921 | 500 g |
| Eppendorf 微量离心管（Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock） | Fisher Scientific | 05-402-12 | 2 mL |
| 甘油 | Thermo Scientific | PI17904 | 500 mL |
| 红外 CO₂ 培养箱 | Forma Scientific | ||
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | American Type Culture Collection (ATCC) | ATCC 11842 | |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | 保加利亚 | S9 | |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | 保加利亚 | LB6 | |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | 食品微生物学与生物技术实验室（NCATSU） | DAW | |
| 德氏乳杆菌保加利亚亚种 | 食品微生物学与生物技术实验室（NCATSU） | E22 | |
| 罗伊氏粘液乳杆菌 | Biogai, Raleigh / 食品微生物学与生物技术实验室（NCATSU） | RD2 | |
| 盐酸半胱氨酸一水合物 | Sigma-Aldrich | C6852-25G | 25 g |
| 麦芽糖一水合物 | Fisher Scientific | M75-100 | 100 g |
| MRS 肉汤 | Neogen | 50-201-5691 | 5 kg |
| 蛋白胨 No. 3 | Hach | 50-199-6719 | 500 g |
| 磷酸氢二钾（K₂HPO₄） | Research Products International | 50-712-761 | 500 g |
| 三水合乙酸钠 | Fisher Scientific | S220-1 | 1 kg |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-1 | 1 kg |
| 丙酮酸钠 | Fisher Scientific | BP356-100 | 100 g |
| 带橡胶衬里螺旋盖的试管 | Fisher Scientific | FB70125150 | 25 × 150 mm |
| 吐温 80 | Fisher Scientific | T164-500 | 500 mL |
| 超低温冰箱 | So-Low | ||
| 尿嘧啶 | ACROS Organics | AC157301000 | 100 g |
| 紫外-可见分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | Evolution 201 | |
| Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | ||
| 酵母提取物 | Fisher Scientific | BP1422-500 | 500 g |
| 乙醇 | Fisher Scientific | T08204K7 | 4 L |
| 盐酸（6N（认证级），Fisher Chemical） | Fisher Scientific | SA56-500 | 500 mL |
参考文献
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