乳酸菌的培养、生长与活性：基于质量控制的视角

摘要

乳酸菌（LAB）培养物的质量控制评估已被证实是提高乳酸菌菌株在发酵过程中存活率和功能性的有效方法。为支持这一观点，我们制定了一项方案，阐明了乳酸菌培养物如何被激活并培养用于发酵和生物加工过程。

摘要

乳酸菌（LAB）是乳制品发酵过程中必不可少的起始菌种，广泛用于酸奶和奶酪等发酵乳制品的生产。乳酸菌主要将乳酸作为发酵的主要终产物，并合成多种重要代谢物，赋予发酵食品特有的感官特性。乳酸菌为营养要求苛刻的细菌，当营养条件充足时，可在多种环境中良好生长。食品和乳品工业对高品质乳酸菌起始菌种的需求日益增长，因而需要为所有生物加工过程提供具有活性且存活良好的菌种。因此，建立一套标准操作规程，以确保乳酸菌菌种在实验室及乳品加工环境中的存活率和功能增强，具有极其重要的意义。针对弱化、应激或受损乳酸菌细胞复苏的相关问题，制定一套清晰详尽的操作流程，以恢复菌体活力、促进细胞再生并提升其代谢功能，显得尤为关键。同时，维持乳酸菌起始菌种的纯度、功能性和存活率也同样重要。因此，遵循统一的操作规程，将有助于提升多种乳酸菌菌株在发酵及生物技术工艺中的发酵性能。为此，北卡罗来纳农业和技术州立大学食品微生物学与生物技术实验室已开发出一套针对特定乳酸菌菌株的活化与质量控制标准操作规程，成功获得了高活性、高存活率的乳酸菌菌株，并将其应用于发酵相关研究。在乳品和食品工业中推广并采用此类标准规程 ，将有助于确保乳酸菌在多种应用中的存活能力与功能表现。

引言

乳酸菌（LAB）是一类具有独特多样性的细菌，具有工业应用潜力。属于德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）的菌株通常被用作发酵乳制品（如酸奶）的乳品发酵剂¹。某些选定的乳酸菌菌株还被归类为益生菌，因为在适当剂量下可对人体健康产生有益作用²。乳酸菌也是革兰氏阳性、不形成孢子、不进行呼吸但耐氧的微生物，通常以产生乳酸作为主要发酵产物为其特征。乳酸菌还能合成多种必需代谢物，例如有机酸、细菌素及其他抗菌化合物³，这些物质可抑制多种食源性病原菌⁴。乳酸是碳水化合物分解代谢的主要终产物，也是乳酸菌发酵的副产物，是一种具有抗菌特性的有机代谢物，在食品生物防腐领域具有潜在应用价值^3,5,6。此外，乳酸菌产生的有机酸还能赋予食品风味、质地和香气，从而改善其整体感官特性^5,6

方案

1. 通用材料与方法

1. 德氏乳杆菌的来源 亚种 bulgaricus
   1. 获取 L. bulgaricus 来自可靠来源的菌株。
      注意：在本研究中，共五名（5） L. bulgaricus 菌株用于质量控制研究（表1）。两种冻干菌株 L. bulgaricus 用于发酵乳制品工业化生产的菌种由保加利亚普罗夫迪夫食品技术大学生物技术系的Albert Krastanov博士提供。从美国市场上销售的商业酸奶产品中分离得到的两个菌株来自-80 °C 北卡罗来纳州立大学食品微生物学与生物技术实验室的菌种保藏&州立大学，另一株冻干菌株由供应商C提供。所有乳酸菌（LAB）菌株均保存于-80 °C。80 °C 直至进一步使用。另一种细菌菌株（Limosilactobacillus reuteri) 从 - 获得80 °C 北卡罗来纳州立大学食品微生物学与生物技术实验室的菌种保藏&中国台湾州立大学也接受了评估。
2. 标准L. MRS发酵肉汤培养基
   1. 将55 g MRS培养基和0.5 g L-半胱氨酸完全溶解于1 L去离子水（DW）中，配制deMan、Rogosa和Sharpe（MRS）培养基。
   2. 将制备好的MRS溶液分别取7 mL和2 m....

结果

采用质量控制方案培养的乳酸菌（LAB）菌株的细胞生长情况与未采用该标准方案培养的菌株相比存在显著差异（P < 0.05）。针对 L. bulgaricus 和 L. reuteri 的质量控制方案均采用多次传代方法（在划线接种至琼脂平板前连续传代三次），而对照组仅传代一次，其余培养条件保持一致。使用该标准质量控制方案培养的菌株在生长培养基平板上的菌落生长更为旺盛且形态清晰。这证实了该方案可通过促进发酵肉汤中的细胞分裂，有效增强乳酸菌的生长，从而促进乳酸菌菌株的细胞代谢。采用和未采用所建立的质量控制方案培养的两种菌株的生长情况如图2所示。在观察并测定到旺盛生长（OD_{610 nm}为0.7–0.9）后，将菌株划线接种至琼脂平板，并在42 °C下厌氧培养72小时，随后沿划线区域观察到清晰分离的菌落。另一项研究（图3）进一步验证了该质量控制方案在TPY培养基中培养Lactobacillus reuteri时的有效性，培养温度为37 °C。采用质量控.......

讨论

所有菌株在使用质量控制方案与未使用该方案条件下的实验结果一致，因此仅展示了与特定菌株（S9和LB6）相关的结果。经活化的乳酸菌（LAB）菌株表现出更优的细胞生长，其特征为细胞生物量浓度高，从而使试管中的MRS发酵肉汤呈现浑浊外观¹¹。在42 °C的厌氧发酵温度下，培养活化后的细胞生长在12至16小时之间表现明显。此外，根据本方案活化的LAB菌株在多次连续传代培养过程中，其菌落形态持续发生变化¹²，沿划线区域可见清晰分离的单菌落。对照实验未采用该标准方案，仅进行一次传代培养；尽管其生长水平仍在光密度OD_{610 nm}值0.7–0.9的可接受范围内，但发酵肉汤中未出现明显的浑浊现象。值得注意的是，将对照菌株在琼脂平板上划线并按照标准程序相同的条件进行厌氧培养后，所形成的菌落较标准方案相比更小且数量更少¹³。

这可能是由于乳酸菌（LAB）细胞具有较弱的活力和非理想的存活特性所致。因此，对乳酸菌菌株进行多次传代培养并在琼脂平板上.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
苯胺蓝	Thermo Scientific	R21526	25 g
牛肉浸膏	Research Products International	50-197-7509	500 g
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
氯化钙二水合物	Fisher Scientific	C79-500	500 g
无水葡萄糖	Fisher Scientific	BP350500	500 g
D-果糖	ACROS Organics	AC161355000	500 g
Difco 琼脂粉	Difco	DF0812-07-1	2 kg
TPY 琼脂	Difco	211921	500 g
Eppendorf 微量离心管（Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock）	Fisher Scientific	05-402-12	2 mL
甘油	Thermo Scientific	PI17904	500 mL
红外 CO₂ 培养箱	Forma Scientific
德氏乳杆菌保加利亚亚种	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 11842
德氏乳杆菌保加利亚亚种	保加利亚	S9
德氏乳杆菌保加利亚亚种	保加利亚	LB6
德氏乳杆菌保加利亚亚种	食品微生物学与生物技术实验室（NCATSU）	DAW
德氏乳杆菌保加利亚亚种	食品微生物学与生物技术实验室（NCATSU）	E22
罗伊氏粘液乳杆菌	Biogai, Raleigh / 食品微生物学与生物技术实验室（NCATSU）	RD2
盐酸半胱氨酸一水合物	Sigma-Aldrich	C6852-25G	25 g
麦芽糖一水合物	Fisher Scientific	M75-100	100 g
MRS 肉汤	Neogen	50-201-5691	5 kg
蛋白胨 No. 3	Hach	50-199-6719	500 g
磷酸氢二钾（K₂HPO₄）	Research Products International	50-712-761	500 g
三水合乙酸钠	Fisher Scientific	S220-1	1 kg
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-1	1 kg
丙酮酸钠	Fisher Scientific	BP356-100	100 g
带橡胶衬里螺旋盖的试管	Fisher Scientific	FB70125150	25 × 150 mm
吐温 80	Fisher Scientific	T164-500	500 mL
超低温冰箱	So-Low
尿嘧啶	ACROS Organics	AC157301000	100 g
紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher Scientific	Evolution 201
Vortex Genie 2	Fisher Scientific
酵母提取物	Fisher Scientific	BP1422-500	500 g
乙醇	Fisher Scientific	T08204K7	4 L
盐酸（6N（认证级），Fisher Chemical）	Fisher Scientific	SA56-500	500 mL