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方法文章

利用透射电子显微镜定量分析骨骼肌纤维中糖原的亚细胞分布

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DOI：

10.3791/63347

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2022年2月7日

 ,  ,  ,  , 
1Research center for applied health science, University College South Denmark, 2Department of Sports Science and Clinical Biomechanics, University of Southern Denmark, 3Department of Biomedical Sciences, Core Facility for Integrated Microscopy, University of Copenhagen

本文内容

摘要

一种改良的后固定方法可增强组织中糖原颗粒的对比度。本文提供了一步一步的操作方案，详细描述了如何处理组织样本、进行成像，并利用体视学方法获取骨骼肌中纤维类型特异性的亚细胞糖原分布的无偏定量数据。

摘要

利用透射电子显微镜，可以获得含有单个肌纤维的固定样品的高分辨率图像。这使得能够对不同亚细胞结构的超微结构特征进行定量分析，例如体积分数、表面积与体积比、形态测量学参数以及物理接触位点。20世纪70年代，一种增强细胞内糖原染色的实验方案被开发出来，为后续一系列利用透射电子显微镜研究糖原的亚细胞定位及糖原颗粒大小的研究奠定了基础。尽管大多数分析将糖原视为在肌纤维内均匀分布，并仅提供单一数值（例如平均浓度），但透射电子显微镜揭示，糖原以离散的糖原颗粒形式储存于特定的亚细胞区域中。本文详细描述了从组织取材到定量测定单个骨骼肌纤维中不同亚细胞区域内的糖原体积分数和颗粒直径的逐步操作流程。内容包括以下方面的注意事项：1）组织样本的采集与染色；2）图像分析与数据处理；3）估计精度的评估；4）肌纤维类型的区分；以及5）方法学上的陷阱与局限性。

引言

糖原颗粒由葡萄糖的支链聚合物及多种相关蛋白质组成1，在高代谢需求期间是重要的能量来源2。尽管尚未被广泛认识，糖原颗粒也是一种局部能源，在某些亚细胞过程优先利用糖原，即使存在其他更持久的能源如血浆葡萄糖和脂肪酸3,4。

关于糖原作为亚细胞特异性定位燃料储存的重要性已在多篇综述中被讨论5,6，主要依据的是通过透射电子显微镜（TEM）对糖原亚细胞分布进行的最早期记录之一7,8。早期研究采用了多种不同方案来增强糖原的对比度，从组织化学染色技术到负染和正染技术均有涉及9,10。一项重要的方法学进展是改进的后固定方案，即使用亚铁氰化钾还原的锇酸进行固定11,12,13,14，该方法显著提高了糖原颗粒的对比度。尽管这一改进后的方案未被应用于部分关于运动诱导糖原耗竭的开创性研究中15，但后来由Graham及其同事重新引入并应用16,17。

根据二维图像，糖原的亚细胞分布通常被描述为存在于三个区域的糖原颗粒：肌膜下（位于细胞膜下方）、肌原纤维间（位于肌原纤维之间）或肌原纤维内（位于肌原纤维内部）。然而，糖原颗粒也可能与肌浆网7或细胞核18等结构相关联。除了亚细胞分布外，透射电镜（TEM）测定糖原含量的另一个优势是可以在单根肌纤维水平上进行定量分析。这使得研究人员能够探究不同肌纤维之间的变异性，并可开展与肌纤维类型以及线粒体、脂滴等细胞组分的相关性分析。

本文描述了通过透射电子显微镜（TEM）估算骨骼肌纤维中三种常见亚细胞糖原储存池（肌膜下、肌原纤维间和肌原纤维内）的纤维类型特异性容积含量的实验方案。该方法已应用于人类19、大鼠20和小鼠21的骨骼肌，以及鸟类和鱼类22；同时还应用于大鼠23的心肌细胞。

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方案

本方案使用人类活检骨骼肌样本，已获丹麦南区健康研究伦理委员会（S-20170198）批准。vastus lateralis 肌肉在局部皮下麻醉（每次切口给予1-3 mL 2%利多卡因）后，通过皮肤切口并使用带有负压吸引的 Bergström 针获取肌肉活检样本。若使用分离的完整大鼠肌肉，则根据丹麦欧登塞大学医院动物伦理委员会的指南，在获取肌肉活检样本前通过颈椎脱位处死动物。

1. 初级固定、后固定、包埋、切片与染色

  1. 在2 mL微量离心管中配制1.6 mL初级固定液（含2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.3），于5 °C保存，最长不超过14天。
  2. 从肌肉活检组织或整块肌肉中分离出一小块样本，其任何方向上的最大直径不超过1 mm，并在纵向肌纤维方向上略长于横截面方向（以便定位）。
  3. 将样本放入含有冷初级固定液的离心管中，于5 °C固定24小时。
  4. 用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）在室温下清洗样本四次（每次间隔15分钟）。使用移液器吸出废液，注意不要扰动样本，随后加入新鲜缓冲液。
    注意：最后一次清洗后，样本可在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中于5 °C保存数月11。此步骤可作为暂停点。
  5. 在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）中，于4 °C用1%四氧化锇（OsO4）和1.5%亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6）后固定120分钟。
    注意：使用1.5%亚铁氰化钾（K4Fe(CN)6）对糖原颗粒获得最佳反差至关重要11,12,13。
  6. 在室温下用双蒸水漂洗两次。
  7. 在室温下依次浸入梯度浓度的醇类（乙醇）进行脱水处理，具体步骤如下：70%（10分钟）、70%（10分钟）、95%（10分钟）、100%（10分钟）、100%（10分钟）。
    注意：每一步均将样本浸入乙醇中，之后仅部分移除液体以避免样本干燥，最后弃去残留乙醇。
  8. 在室温下使用环氧丙烷与环氧树脂的梯度混合液进行渗透处理，体积比依次为：1/0（10分钟）、1/0（10分钟）、3/1（45分钟）、1/1（45分钟）、1/3（45分钟）、0/1（过夜）。次日将样本转移至模具中，用100%新鲜环氧树脂包埋，并于60 °C聚合48小时。
    注意：该梯度渗透法遵循先前报道的方案11,12。此步骤可作为暂停点。
  9. 对纵向取向的纤维切取超薄切片（60–70 nm），并按以下步骤收集至单孔铜网上。
    1. 将样本块固定在超薄切片机的样品夹上。
    2. 用剃刀片修整样本块表面，直至暴露组织层面。
    3. 在样本前方安装金刚石切刀（ultracut 45），并调整样本表面与刀刃平行。
    4. 使用金刚石切刀切取半薄切片（1 µm）以检查样本取向，并用甲苯胺蓝染色后在光学显微镜下观察。
    5. 进一步修块，缩小目标区域，以便获得理想的超薄切片。
    6. 使用另一把金刚石切刀（ultracut 45）切取超薄切片（60–70 nm）。
    7. 使用Perfect Loop将1–2片切片收集至单孔铜网上。
      注意：单孔铜网中央有一个孔，配有Formvar支持膜。
  10. 将上述载网依次浸入醋酸铀溶液（0.5%双蒸水溶液）中染色20分钟，再浸入柠檬酸铅溶液（1%双蒸水溶液）中染色15分钟，以增强切片反差。两次染色之间及染色结束后均需用双蒸水清洗载网。
    注意：此步骤可作为暂停点。

2. 成像

  1. 开启透射电子显微镜（工作加速电压为 80 kV）、计算机及图像采集软件。使用数字慢扫描 2 k × 2 k CCD 相机及其配套成像软件记录数字图像。
  2. 将带有多个切片的载网插入显微镜样品台。
  3. 首先在低倍镜下（例如 ×100）扫描载网，评估切片质量（如支撑膜上的孔洞、杂质等），并选择质量最佳的切片区。在低倍镜下确定肌纤维的走向。
  4. 随后，将电子束对准切片中一个边缘区域的肌纤维，并逐步提高放大倍数。在放大倍数超过 30 k 时进行图像聚焦，以确保图像中包含足够的精细结构细节，并可借助实时快速傅里叶变换（如具备该功能）进行辅助判断。最后，在目标放大倍数下以 1 秒曝光时间采集图像。
  5. 对随机选择的一个肌纤维，共采集 24 张图像，其中肌原纤维区域 12 张，肌膜下区域 12 张，放大倍数范围为 10 k 至 40 k。确保图像在肌纤维的长度和宽度方向上以随机但系统化的方式分布，以获得无偏结果（图 1A）。
    注意：最佳放大倍数取决于相机分辨率和照片尺寸。目标是实现最终分辨率，使糖原颗粒直径可在 1 nm 步长内进行测量，并确保所采集图像覆盖至少 70 µm2 的肌原纤维区域总面积，以及至少 25 µm 的肌纤维总长度，分别均匀分布在每根纤维的 12 张肌原纤维区图像和 12 张肌膜下区图像中。每根纤维采集 24 张图像，通常可使人体、大鼠和小鼠骨骼肌单个肌纤维中不同糖原池体积含量的精确度（误差系数）达到 0.1 至 0.2 之间20,21,24（图 2E）。
  6. 重复步骤 2.4 和 2.5，直至共成像 6–10 根肌纤维。如有需要，可制备额外切片（切片间至少间隔 150 µm，以避免已成像纤维的重复），并重复步骤 1.9–2.5。

3. 图像分析

  1. 通过点击 文件 > 打开，将图像导入 ImageJ。
  2. 通过点击 分析 > 设置比例尺，设置全局比例尺以匹配图像的原始尺寸。
  3. 通过点击 图像 > 缩放 > 放大，将图像放大至 100%。
  4. 使用工具菜单中的直线工具，测量每张肌原纤维区域图像中一个 Z 盘的厚度（每根纤维测量 12 个）（图 1D）。计算每根纤维 6–10 根纤维的平均 Z 盘厚度。
  5. 将平均 Z 盘厚度最大的 2–3 根纤维定义为 I 型纤维，将平均 Z 盘厚度最小的 2–3 根纤维定义为 II 型纤维。在后续分析中忽略中间的 2–4 根纤维（图 1E）。
    注意：以下步骤对样本中的 4–6 根纤维分别重复进行。糖原体积分数通过点计数法估算，方法如文献所述25,26。网格大小的选择应确保估算结果具有足够高的精度，通常通过获得约 250 次击中来实现，这决定了所需的总点数，进而决定每个点所代表的面积。
  6. 使用分段线工具测量紧邻肌膜下区域下方可见的最外层肌原纤维的长度（图 2A）。
    注意：该长度用于表示单位表面积的肌膜下糖原含量（即最外层肌原纤维长度乘以切片厚度（60 nm）；见步骤 4.5）。因此，分析中仅包含由该长度所代表的肌膜下区域。
  7. 通过点击 分析 > 工具 > 网格 插入网格，并将 每点面积 设置为 32,400 nm2。在 12 张肌膜下区域图像中，统计十字交叉点落在肌膜下糖原上的击中次数（图 2A）。击中定义为糖原颗粒出现在十字交叉点的右上角。
  8. 通过点击 分析 > 工具 > 网格 插入网格，并将 每点面积 设置为 160,000 nm2。在 12 张肌原纤维区域图像中，统计十字交叉点落在肌原纤维内空间的击中次数（图 2B）。
  9. 通过点击 分析 > 工具 > 网格 插入网格，并将 每点面积 设置为 3,600 nm2。在 12 张肌原纤维区域图像中，统计十字交叉点落在肌原纤维内糖原上的击中次数（图 2C）。
  10. 通过点击 分析 > 工具 > 网格 插入网格，并将 每点面积 设置为 32,400 nm2。在 12 张肌原纤维区域图像中，统计十字交叉点落在肌原纤维间糖原上的击中次数（图 2D）。
  11. 使用直线工具，对每张图像中每个糖原池随机选取 5 个糖原颗粒测量其直径，以获得每根纤维每个糖原池平均 60 个颗粒的数据。
    注意：平均 60 个颗粒已能充分覆盖纤维内的变异情况（图 2F）。

4. 计算

  1. 根据12张图像（来自步骤3.8）中所有命中点的总和除以所有点的总和，计算每单位肌原纤维空间内肌原纤维内空间的表观面积分数（AA）。
  2. 根据12张图像（来自步骤3.7、3.9和3.10）中所有命中点的总和除以所有点的总和，分别计算每单位肌原纤维面积的肌原纤维内糖原、肌原纤维间糖原以及每单位图像面积的肌膜下糖原的表观面积分数。
  3. 分别计算肌原纤维内、肌原纤维间和肌膜下糖原的体积分数（VV），其值等于表观面积分数（AA）减去表面密度（SV）与切片厚度（t）乘积的结果，其中表面密度为颗粒数密度与平均颗粒表面积的乘积：
    Vv = AA - (1 / 4) · Sv · t
    其中
    Sv (µm-1) = AA / ( (π · (((1 / 2) · H)2)) · (t + H)) · (π · H2)
    t = 0.06 µm
    H = 颗粒的平均直径（µm）
    注：由于位于切片外中心的颗粒顶端部分的影响，体积分数小于表观面积分数25。
  4. 为将肌原纤维内糖原表达为每单位肌原纤维内空间的含量，将肌原纤维内糖原的面积分数（步骤4.2）除以肌原纤维内空间的面积分数（步骤4.1）。肌原纤维间糖原则按前一步骤（步骤4.3）计算结果表达为每单位肌原纤维空间的含量。
  5. 为将肌膜下糖原表达为每单位肌纤维表面积（VS）（最外层肌原纤维）的含量，将糖原的体积分数转换为绝对量，方法为乘以图像体积（面积与切片厚度的乘积），再除以平均可用长度（来自步骤3.6）与切片厚度（t）的乘积。
  6. 利用步骤4.1、4.4和4.5所得数值估算总体积糖原含量，方法如下：
    肌原纤维糖原 = 肌原纤维间糖原 + （肌原纤维内糖原 · 肌原纤维内空间的面积分数）
    假设平均肌纤维半径为40 µm27，则体积与表面积之比为20:1，因此总糖原含量为：
    总糖原（VV）= 肌原纤维糖原 + （肌膜下糖原（VS）/ 20）
    注：20:1的体积与表面积之比会因实际肌纤维大小及肌膜下区域大小的不同而有所变化。本方案未考虑此变异。
  7. 据此，计算各糖原池对总糖原的相对贡献，作为总糖原的分数：
    肌原纤维间糖原 / 总糖原 = 肌原纤维间糖原 / 总糖原
    肌原纤维内糖原 / 总糖原 = （肌原纤维内糖原 · 肌原纤维内空间的面积分数）/ 总糖原
    肌膜下糖原 / 总糖原 = 肌膜下糖原 / 20 / 总糖原
  8. 对每个糖原池，计算误差系数（CE），该系数基于图像数量（n）、每张图像中交叉点总数（x）以及每张图像中命中相关糖原池的交叉点数（y），用于表达单根肌纤维水平上糖原估计值的不确定性，计算公式如下28：
    CE = n-1 · ∑x2 · (∑x)-2 + ∑y2 · (∑y)-2 - 2∑(xy) · ∑x-1 · ∑y-1

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结果

采用本方案，糖原颗粒呈现为黑色且清晰可见（图1 和 图2）。正常糖原含量如 图3 所示。这些数据基于以往不同研究中收集的41名健康年轻男性的共计362根肌纤维19,24,29,30,31。由此可见，肌原纤维间糖原的分布接近正态，而肌原纤维内糖原和肌膜下糖原则呈现偏态分布，部分肌纤维中糖原含量异常增高。需要注意的是，在正常大小的肌纤维（直径为60–80 µm）中，肌原纤维间糖原是最大的储存池，约占总糖原含量的80%。肌原纤维内糖原和肌膜下糖原各自约占总含量的10%。

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讨论

该方法的关键步骤是在后固定过程中使用亚铁氰化钾还原的锇酸。这种改良固定剂对糖原检测的选择性无法完全用化学原理来解释，但还包括实验结果的支持：在已知不含糖原的组织或细胞外空间中均未检测到此类颗粒11。

关键参数包括估计值的精确度以及纤维间的变异程度。通过遵循本方案中的成像步骤，可获得各肌纤维内不同糖原池估计值的误差系数在0.1至0.2之间。该误差水平显著低于单个肌纤维之间的变异（图3）。在估算糖原体积含量时，建议报告此类精确度估计值。所展示的肌纤维分型方法已通过肌球蛋白ATP酶同工型验证29。Z盘厚度和线粒体体积分数可联合用于指示肌纤维类型，但单独使用线粒体体积分数则不可行32。

该方法的主要局限性在于无法检测非常小的糖原颗粒，以及在投影图像中糖原颗粒的轮廓可能发生重叠28。第一个...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本工作由瑞典奥林匹克委员会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,2-丙烯氧化物Merck75-56-9
Embedding 812 树脂包埋介质试剂盒TaabT031
25% 戊二醛溶液Merck1.04239.0250
ITEMOlympus成像软件
Leica EM AC20Leica自动染色系统
OSIS Veleta 数字相机Olympus
4% 四氧化锇溶液Polysciences0972A
Philips CM 100 透射电子显微镜Philips
六氰合铁(II)酸钾三水合物Sigma-Aldrich455989-245G
0.2 M pH 7.4 二甲胂酸钠缓冲液Ampliqon.comAMPQ40989.0500
Leica UC7 超薄切片机Leica
稳定化的 3% 柠檬酸铅超染液（Ultrostain）Leica16707235
乙酸铀酰二水合物Polysciences6159-44-0

参考文献

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