定量微管分级分离技术：在小鼠组织中分离稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白

摘要

微管是由微管蛋白聚合而成的结构，在真核细胞中作为细胞骨架的重要组分发挥关键作用，并以其动态不稳定性而著称。本研究建立了一种微管分级分离方法，可将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白，以评估微管在多种小鼠组织中的稳定性。

摘要

微管由α/β-微管蛋白二聚体组成，是真核细胞细胞骨架的关键组分。这些管状聚合物表现出动态不稳定性，即微管蛋白异源二聚体亚基反复发生聚合与解聚。通过微管蛋白的翻译后修饰以及微管相关蛋白，可精确调控微管的稳定性与动态行为，这对多种细胞功能至关重要。微管功能障碍与多种疾病的发病机制密切相关，包括神经退行性疾病。当前研究集中于靶向微管的治疗药物，这些药物可调节微管稳定性，为上述疾病及癌症提供潜在的治疗选择。因此，理解微管的动态状态对于评估疾病进展和治疗效果至关重要。

传统上，微管动力学是通过以下方式评估的 体外 或通过粗分级分离或免疫测定法，利用靶向微管蛋白翻译后修饰的抗体，在培养细胞中进行检测。然而，使用此类方法准确分析组织中微管蛋白状态仍存在挑战。本研究中，我们开发了一种简单且创新的微管蛋白分级分离方法，用于在小鼠组织中分离稳定的微管、不稳定的微管以及游离的微管蛋白。

该实验步骤包括将解剖所得的小鼠组织在微管稳定缓冲液中按19:1的体积比进行匀浆。匀浆液随后通过两步超速离心法进行分级分离，首先进行低速离心（2,400 × g）以去除碎片。第一步超速离心（100,000 × g）使稳定的微管沉淀，而所得上清液则进行第二步超速离心（500,000 × g），以分离不稳定的微管和可溶性微管蛋白二聚体。该方法可确定构成小鼠脑组织中稳定或不稳定微管的微管蛋白比例。此外，观察到不同组织中微管稳定性存在差异，且与组成细胞的增殖能力相关。这些发现凸显了该新型方法在生理和病理条件下分析微管稳定性的重大潜力。

引言

微管（MTs）是由α/β-微管蛋白异源二聚体亚基组成的原丝构成的细长管状结构。它们在细胞分裂、细胞运动、形态维持以及细胞内运输等多种细胞过程中发挥着关键作用，是真核细胞骨架的重要组成部分¹。微管的负端暴露α-微管蛋白亚基，相对稳定；而正端暴露β-微管蛋白亚基，可发生动态的去聚合与聚合²。在正端持续发生的微管蛋白二聚体的添加与解离过程，称为动态不稳定性，导致微管反复经历恢复（rescue）与灾变（catastrophe）的循环³。微管表现出具有局部动态不稳定性差异的焦点区域，包括稳定区和不稳定区⁴。

微管（MTs）动态不稳定性 的精确调控对于多种细胞功能至关重要，尤其在具有复杂形态的神经元中尤为关键。微管的可塑性与稳定性在神经细胞的发育及正常功能维持中发挥着重要作用^5,6,7。研究发现，微管的动态不稳定性与微管蛋白的多种翻译后修饰（PTMs）相关，例如乙酰化、磷酸化、棕榈酰化、去酪氨酸化、Δ2修饰、多聚谷氨酰胺氧化以及多聚甘氨酰化。此外，微管相关蛋白（MAPs）的结合也是一种重要的调控机制

方案

1. 微管蛋白分级分离方法

注意：本研究中进行的所有实验均获得同志社大学动物伦理委员会的批准。实验使用任一性别的 C57BL/6J 小鼠，年龄为 3-4 个月。在本方案中，解剖获得的组织（例如脑、肝或胸腺）立即在冰冻的微管稳定缓冲液（MSB）中进行匀浆，该缓冲液含有紫杉醇（微管稳定剂），其浓度足以防止微管的去聚合以及再聚合。匀浆液通过两步超速离心法分离为三个组分（图 1）。本方案中的所有步骤均在低温环境中连续完成，组织和组分在溶解于十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液之前均未冷冻。

1. MSB 和微量离心管的准备
   1. 制备MSB时，混合以下试剂：0.1 M 2-(N-Morpholino)乙烷磺酸（MES），pH 6.8（KOH 中和），10% 甘油，0.1 mM DTT，1 mM MgSO₄₄，1 mM EGTA，0.5% Triton X-100，磷酸酶抑制剂（1 mM NaF，1 mM β-甘油磷酸钠，1 mM Na₃VO₄0.5 µM 毒藻酸，1×蛋白酶抑制剂混合液，以及蛋白酶抑制剂（0.1 mM PMSF，0.1 mM DIFP，1 µg/mL 胃蛋白酶抑制剂，1 µg/mL 抗痛素，10 µg/mL 抑....

结果

通过微管分离法对小鼠脑组织P2、P3和S3组分中的微管蛋白进行定量
采用微管（MT）分离法将小鼠组织中的微管蛋白分离至P2、P3和S3组分，并通过蛋白质印迹法进行定量分析（图1A）。在100,000 × g 条件下超速离心20分钟后，保留在P2组分中的微管沉淀物占小鼠脑组织总微管蛋白的34.86% ± 1.68%。上清液（S2）进一步在500,000 × g 条件下离心60分钟，获得沉淀物（P3组分）和上清液（S3组分），分别占小鼠脑组织总微管蛋白的56.13% ± 2.12% 和 9.01% ± 0.68%（图1B）。

本研究中使用的大脑皮层包含神经元和非神经元细胞（如胶质细胞）。为选择性评估小鼠脑内神经元中微管（MT）的稳定性，我们通过Tuj1（抗TUBB3抗体）进行Western blotting，定量检测TUBB3——一种仅在中枢和外周神经系统神经元中表达的微管蛋白亚型。TUBB.......

讨论

研究生物组织中微管蛋白状态时，最重要的任务是防止在样品制备过程中发生意外的微管（MT）聚合或解聚。从组织取出到匀浆及离心的整个过程中，样品中微管的稳定性受到多种因素影响，包括MSB缓冲液中紫杉醇（Taxol）的浓度、组织量与缓冲液体积的比例以及温度。因此，针对使用20倍体积匀浆液分析小鼠组织的实验方案，每一步的操作条件均经过优化。即使在低温条件下，过高的紫杉醇浓度也可能在体外诱导微管聚合in vitro，甚至在冷藏条件下亦如此²⁵。当分析微管蛋白浓度差异显著的组织，或对实验方案进行重大修改时，操作人员应根据各自实验的具体目标优化各步骤。

在本项研究中，通过在500,000 × g²⁰条件下进行超速离心，从传统的"可溶性组分"中获得了一类新的微管（MTs）群体，称为P3。基于转子K因子、离心力和离心时间等因素的理论计算表明，S3组分中存在的微管蛋白最可能代表6S微管蛋白二聚体。相反，P3组分中的微管蛋白可能对应于长度较P2组分中微管更短的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
500 个装 1.5 mL 离心管	Beckman Coulter	357448
1A2	Sigma-Aldrich	T9028	1:5,000 稀释
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）	Nacalai Tesque	02442-44
300 kDa 超滤离心柱	Aproscience	PT-1013
6-11B1	Sigma-Aldrich	T7451	1:5,000 稀释
ÄKTAprime plus	Cytiva	11001313
抗小鼠 IgG	Jackson ImmunoResearch	115-035-146	1:5,000 稀释
抑蛋白酶肽	Peptide Institute Inc.	4062
抑肽酶	Nacalai Tesque	03346-84
Chemi-Lumi One L	Nacalai Tesque	07880-54
Corning 瓶顶真空过滤系统	Corning	430758	0.22µm 33.2cm² 硝酸纤维素膜
DIFP	Sigma-Aldrich	55-91-4
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1	AS ONE	1-2050-11
DM1A	Sigma-Aldrich	T9026	1:5,000 稀释
DTT	Nacalai Tesque	14128-46
EGTA	Nacalai Tesque	37346-05
FluoroTrans W 3.3 米卷	Pall Corporation	BSP0161
甘油	Nacalai Tesque	17018-25
GTP	Nacalai Tesque	17450-61
高速冷冻微量离心机 Kitman	TOMY	KITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 柱	Cytiva	28-9893-35
Image Gauge 软件	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation	292-69903
KMX-1	Millipore	MAB3408	1:5,000 稀释
LAS-4000 化学发光图像分析仪	FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
亮抑蛋白酶肽	Peptide Institute Inc.	43449-62
MgSO4	Nacalai Tesque	21003-75
Na3VO4	Nacalai Tesque	32013-92
NaF	Nacalai Tesque	31420-82
冈田酸	LC Laboratories	O-2220
OPTIMA MAX-XP	Beckman Coulter	393315
胃蛋白酶抑制剂	Nacalai Tesque	26436-52
PMSF	Nacalai Tesque	27327-81
TLA120.2 用聚碳酸酯离心管	Beckman Coulter	343778
蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete™，无 EDTA）	Roche	11873580001
纯化微管蛋白	Cytoskeleton	T240
QSONICA Q55	QSonica	Q55
紫杉醇	LC Laboratories	P-9600
TLA-120.2 转子	Beckman Coulter	357656
TLA-55 转子	Beckman Coulter	366725
TLCK	Nacalai Tesque	34219-94
Triton X-100	Nacalai Tesque	12967-45
β-甘油磷酸	Sigma-Aldrich	G9422