方法文章

定量微管分级分离技术：在小鼠组织中分离稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白

3.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63358

⸱

2023年11月17日

 , 
1Department of Neuropathology, Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2Center for Research in Neurodegenerative Diseases, Doshisha University, 3Laboratory of Physiology and Anatomy, School of Pharmacy, Nihon University

本文内容

摘要

微管是由微管蛋白聚合而成的结构，在真核细胞中作为细胞骨架的重要组分发挥关键作用，并以其动态不稳定性而著称。本研究建立了一种微管分级分离方法，可将微管分离为稳定微管、不稳定微管和游离微管蛋白，以评估微管在多种小鼠组织中的稳定性。

摘要

微管由α/β-微管蛋白二聚体组成，是真核细胞细胞骨架的关键组分。这些管状聚合物表现出动态不稳定性，即微管蛋白异源二聚体亚基反复发生聚合与解聚。通过微管蛋白的翻译后修饰以及微管相关蛋白，可精确调控微管的稳定性与动态行为，这对多种细胞功能至关重要。微管功能障碍与多种疾病的发病机制密切相关，包括神经退行性疾病。当前研究集中于靶向微管的治疗药物，这些药物可调节微管稳定性，为上述疾病及癌症提供潜在的治疗选择。因此，理解微管的动态状态对于评估疾病进展和治疗效果至关重要。

传统上，微管动力学是通过以下方式评估的 体外 或通过粗分级分离或免疫测定法，利用靶向微管蛋白翻译后修饰的抗体，在培养细胞中进行检测。然而，使用此类方法准确分析组织中微管蛋白状态仍存在挑战。本研究中，我们开发了一种简单且创新的微管蛋白分级分离方法，用于在小鼠组织中分离稳定的微管、不稳定的微管以及游离的微管蛋白。

该实验步骤包括将解剖所得的小鼠组织在微管稳定缓冲液中按19:1的体积比进行匀浆。匀浆液随后通过两步超速离心法进行分级分离，首先进行低速离心（2,400 × g）以去除碎片。第一步超速离心（100,000 × g）使稳定的微管沉淀，而所得上清液则进行第二步超速离心（500,000 × g），以分离不稳定的微管和可溶性微管蛋白二聚体。该方法可确定构成小鼠脑组织中稳定或不稳定微管的微管蛋白比例。此外，观察到不同组织中微管稳定性存在差异，且与组成细胞的增殖能力相关。这些发现凸显了该新型方法在生理和病理条件下分析微管稳定性的重大潜力。

引言

微管（MTs）是由α/β-微管蛋白异源二聚体亚基组成的原丝构成的细长管状结构。它们在细胞分裂、细胞运动、形态维持以及细胞内运输等多种细胞过程中发挥着关键作用，是真核细胞骨架的重要组成部分1。微管的负端暴露α-微管蛋白亚基，相对稳定；而正端暴露β-微管蛋白亚基，可发生动态的去聚合与聚合2。在正端持续发生的微管蛋白二聚体的添加与解离过程，称为动态不稳定性，导致微管反复经历恢复（rescue）与灾变（catastrophe）的循环3。微管表现出具有局部动态不稳定性差异的焦点区域，包括稳定区和不稳定区4。

微管（MTs）动态不稳定性 的精确调控对于多种细胞功能至关重要，尤其在具有复杂形态的神经元中尤为关键。微管的可塑性与稳定性在神经细胞的发育及正常功能维持中发挥着重要作用5,6,7。研究发现，微管的动态不稳定性与微管蛋白的多种翻译后修饰（PTMs）相关，例如乙酰化、磷酸化、棕榈酰化、去酪氨酸化、Δ2修饰、多聚谷氨酰胺氧化以及多聚甘氨酰化。此外，微管相关蛋白（MAPs）的结合也是一种重要的调控机制8。除乙酰化外，这些翻译后修饰主要发生在位于微管外表面的微管蛋白羧基末端区域。这些修饰在微管表面形成多样化的化学环境，影响其与微管相关蛋白的相互作用，从而最终调控微管的稳定性9。α-微管蛋白羧基末端存在酪氨酸残基是动态微管的标志，这类微管会迅速被游离的微管蛋白库所替换；相反，羧基末端的去酪氨酸化以及Lys40位点的乙酰化则标志着稳定性较高、动态不稳定性较低的微管9,10。

微管蛋白的翻译后修饰（PTMs）已在实验中被广泛用于评估微管（MTs）的动态性与稳定性5,7,11,12,13,14,15。例如，在细胞培养研究中，微管蛋白可被分为两个组分：游离微管蛋白组分和微管组分。该方法通过细胞透化释放游离微管蛋白，随后固定残留的微管结构15,16,17,18,19。生化方法则利用化学微管稳定剂保护微管免于解聚，从而通过离心实现微管与游离微管蛋白的分离20,21,22。然而，这些方法无法区分稳定微管与较不稳定的（动态的）微管，因此难以对脑等组织中的微管或可溶性微管蛋白进行定量分析。因此，在生理和病理条件下评估生物体内微管的稳定性一直具有挑战性。为克服这一实验局限，我们开发了一种可在小鼠组织中精确分离微管与游离微管蛋白的新技术23。

这种独特的微管（MT）分级分离方法包括在维持组织中微管蛋白状态的条件下进行组织匀浆，以及通过两步离心法分离稳定的微管、不稳定的微管和游离微管蛋白。这一简单的方法可广泛应用于多种研究，包括对活体生物中微管及微管相关蛋白（MAPs）的基础研究、与微管稳定性相关的健康和疾病状态的生理与病理分析，以及靶向微管的药物和其他治疗手段的开发。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 微管蛋白分级分离方法

注意：本研究中进行的所有实验均获得同志社大学动物伦理委员会的批准。实验使用任一性别的 C57BL/6J 小鼠，年龄为 3-4 个月。在本方案中，解剖获得的组织（例如脑、肝或胸腺）立即在冰冻的微管稳定缓冲液（MSB）中进行匀浆，该缓冲液含有紫杉醇（微管稳定剂），其浓度足以防止微管的去聚合以及再聚合。匀浆液通过两步超速离心法分离为三个组分（图 1）。本方案中的所有步骤均在低温环境中连续完成，组织和组分在溶解于十二烷基硫酸钠（SDS）样品缓冲液之前均未冷冻。

  1. MSB 和微量离心管的准备
    1. 制备MSB时，混合以下试剂：0.1 M 2-(N-Morpholino)乙烷磺酸（MES），pH 6.8（KOH 中和），10% 甘油，0.1 mM DTT，1 mM MgSO₄4，1 mM EGTA，0.5% Triton X-100，磷酸酶抑制剂（1 mM NaF，1 mM β-甘油磷酸钠，1 mM Na3VO40.5 µM 毒藻酸，1×蛋白酶抑制剂混合液，以及蛋白酶抑制剂（0.1 mM PMSF，0.1 mM DIFP，1 µg/mL 胃蛋白酶抑制剂，1 µg/mL 抗痛素，10 µg/mL 抑肽酶，10 µg/mL 亮抑酶肽，50 µg/mL TLCK）（参见 材料表）并记为MSB(-)。
    2. 在组织解剖前，加入10 µM 紫杉醇和2 mM GTP（参见 材料表) 加入MSB(-)中，此缓冲液记为MSB(+)。该缓冲液需在使用当天配制，并置于冰上保存。
    3. 准备用于取样的微量离心管。用于匀浆液储存的空2.0 mL微量离心管；用于上清液1（S1）裂解物、沉淀2（P2）样品和沉淀3（P3）样品储存的空1.5 mL微量离心管；装有1 mL预冷磷酸盐缓冲液（PBS）的1.5 mL微量离心管，用于储存分离的组织；装有200 µL 2× SDS上样缓冲液（0.16 M Tris，pH 6.8；20%甘油；2% 2-巯基乙醇；4% SDS）的1.5 mL微量离心管，用于S1样品和上清液3（S3）样品的储存；以及适用于TLA55和TLA120.2离心机转子的离心管（参见 材料表）。标记所有离心管，并将其置于冰上。
  2. 小鼠组织匀浆化
    1. 准备一个低温操作台用于组织解剖。首先，在容器中装入碎冰，并将两个培养皿置于冰上，其中一个培养皿内面朝上，另一个外面朝上。将其中一个培养皿加入预冷的PBS，用于组织样本的短暂清洗和暂存；将另一个倒置的培养皿内铺上经PBS润湿的滤纸。
    2. 为处死小鼠，先在深度麻醉下使用丁丙诺啡、咪达唑仑和美托咪啶混合麻醉剂进行颈椎脱位。随后立即解剖组织（如脑、肝或胸腺），并在培养皿中用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。
      注意：该方法可分析任何类型的软组织，但组织的大小受限于所用匀浆器推荐的体积范围。例如，若使用2 mL体积的匀浆器，建议使用50–100 mg的组织。
    3. 称量用于储存解剖组织的含 PBS 的 1.5 mL 微量离心管后，将组织剪下并放入管内，再次称量每个微量离心管。通过计算加入组织前后离心管的重量差，可得出每份组织的湿重。
    4. 立即在冰预冷的MSB(+)缓冲液中使用预冷的匀浆器对组织进行匀浆（参见 材料表）。MSB(+) 的体积为组织湿重的19倍（µL/mg）。用20次冲程进行匀浆，直至组织碎片消失。
      注意：例如，100 mg 组织需使用 1,900 µL MSB(+)。由于所添加的 MSB(+) 体积必须根据所分析组织样本的湿重进行调整，因此需要准确称量每一份组织样本。
  3. 小鼠组织匀浆的离心
    1. 用巴氏吸管将整个匀浆转移至2 mL微量离心管中，于2,400 × g 在 2 °C 下离心 3 分钟以去除碎片 通过 沉淀
    2. 将全部上清液（S1 组分）转移至新的 1.5 mL 微管中并涡旋振荡。随后，取 200 µL S1 组分加入离心微管中，在 100,000 × g 使用TLA-55转子在2 °C下离心20分钟，以获得相对高分子量的蛋白质沉淀（P2组分）。
      注意：进行超速离心步骤的样品体积会影响离心半径及分子的沉淀效率。此步骤后应将样品体积保持在 200 µL 或以下，以避免出现不准确的分级分离。
    3. 进一步将所有获得的上清液（S2 组分）在 500,000 × g 使用TLA-120.2转子在2 °C条件下离心60分钟，以分离沉淀中的不溶性蛋白质复合物（P3组分）和上清液中的可溶性蛋白质（S3组分）。
    4. 向 P2 和 P3 组分管中加入 400 µL 1x SDS 上样缓冲液（0.08 M Tris pH 6.8；10% 甘油；1% 2-巯基乙醇；2% SDS），短暂超声处理以溶解沉淀物。将这些组分样品转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
    5. 将总S3组分溶于200 µL的2x SDS样品缓冲液中。
    6. 将剩余的S1组分与等体积的2x SDS上样缓冲液混合，用于制备Western blot的标准曲线。
    7. 将所有样品在100 °C下煮沸3分钟。待样品冷却至室温后，于-20 °C保存。
  4. 各组分中蛋白质的定量
    1. 通过蛋白质印迹法对 P2、P3 和 S3 组分中的蛋白质进行定量。首先，采用 10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离经适当稀释的 P2、P3 和 S3 组分中的蛋白质，以及来自任意个体的 S1 样品系列稀释液作为标准曲线。随后，将样品电转印至聚偏二氟乙烯膜（见 材料表).
      ​注意：各组分的稀释比例取决于目标蛋白的浓度及抗体的反应性。（例如，脑组织中的α-微管蛋白、TUBB3、β-微管蛋白和酪氨酸化微管蛋白：S3 = 1/400，P3 = 1/2,000，P2 = 1/2,000，S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000；脑组织中的乙酰化微管蛋白：S3 = 1/200，P3 = 1/400，P2 = 1/8,000，S1 = 1/100,000、1/40,000、1/20,000、1/10,000、1/4,000；肝脏中的α-微管蛋白：S3 = 1/20，P3 = 1/100，P2 = 1/20，S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000；胸腺中的α-微管蛋白：S3 = 1/100，P3 = 1/400，P2 = 1/20，S1 = 1/50,000、1/20,000、1/10,000、1/5,000、1/2,000组织浓度稀释）
    2. 用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液（50 mM Tris-HCl pH 7.6；152 mM NaCl）封闭膜 用含 0.1% Tween 20 的 TBS-T 缓冲液孵育超过 30 分钟。
    3. 将膜浸入含有初级抗体的 TBS-T 中（参见 材料表）超过 2 小时。随后用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 3 分钟（重复 3 次）。
    4. 使用HRP标记的二抗对一抗进行标记（参见 材料表在 TBS-T 中孵育超过 1 小时。随后用 TBS-T 洗涤膜 3 分钟，重复 3 次。
    5. 使用增强型化学发光试剂显影膜，然后利用化学发光图像分析仪分析目标条带（参见 材料表).
    6. 使用图像分析软件对蛋白条带强度进行定量分析（参见 材料表并绘制标准曲线，将用于标准曲线的不同稀释倍数的S1样品的稀释单位标在X轴，对应的条带强度标在Y轴。
    7. 读取对应稀释组分样品的蛋白浓度（单位）。将测得的浓度乘以样品的稀释倍数，得到各组分中的蛋白单位。用各组分测得的蛋白单位除以总蛋白单位（P2 + P3 + S3），计算出百分比。

2. 各组分中微管蛋白特性的评估

注意：该生化方法根据沉降特性可分离出三组微管蛋白复合物。此处，基于复合物的大小及微管蛋白翻译后修饰（PTMs）来鉴定这些组分中获得的微管蛋白复合物状态。本方案所有步骤需在低温环境下连续完成，不得中断，且在组分样品溶解于SDS样品缓冲液之前不得将其冷冻。

  1. 滤器截留实验
    1. 使用 300 kDa 超滤离心滤器（参见材料表）对 S2 和 S3 上清液（各 500 µL）进行过滤。在 2 °C 条件下以 14,000 × g 离心，直至全部上清液滤过，滤出的蛋白质收集于接收管中，截留在滤器上的蛋白质则保留在储液管的滤膜上。
    2. 将接收管中的全部滤出液（约 500 µL）转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并加入 500 µL 的 2x SDS 上样缓冲液溶解。
    3. 用移液器将储液管滤膜上的残留物加入 1,000 µL 的 1x SDS 上样缓冲液中溶解，并转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
    4. 将样品在 100 °C 下煮沸 3 分钟。待样品冷却至室温后，于 -20 °C 保存。
    5. 使用 DM1A（抗α-微管蛋白抗体，参见材料表）通过 Western 印迹法检测微管蛋白的含量。
  2. 尺寸排阻色谱法
    1. 制备载体缓冲液（0.1 M MES，pH 6.8；10% 甘油；1 mM MgSO4；1 mM EGTA；0.1 mM DTT），并按步骤 1.1.1 所述加入 1/10 浓度的蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。随后过滤该溶液并置于低温环境中保存。
    2. 在 4 °C 条件下，于色谱室中准备配备制备型液相色谱系统的凝胶过滤色谱柱 （参见材料表）。
    3. 在上样前，以 1 mL/min 的流速用 180 mL 载体缓冲液冲洗色谱柱，冲洗时间为 3 小时。
    4. 将市售的纯化猪脑微管蛋白（参见材料表）作为对照，或分别将来自小鼠脑组织的 S3 组分（各 500 µL）上样至色谱柱中。
    5. 以 1.0 mL/min 的流速用载体缓冲液进行洗脱，连续收集 120 分钟内的洗脱液，每管 1.5 mL。通过 280 nm 吸光度监测洗脱出的蛋白质。保持最大压力低于 0.3 MPa。
    6. 将收集的各洗脱组分涡旋混匀后，取 50 µL 与 50 µL 的 2x SDS 上样缓冲液在 1.5 mL 微量离心管中混合。所有样品在 100 °C 下煮沸 3 分钟。待冷却至室温后，于 -20 °C 保存。
    7. 使用 DM1A（抗α-微管蛋白抗体）和 KMX-1（抗β-微管蛋白抗体）（参见材料表）通过 Western 印迹法 检测微管蛋白的含量。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

通过微管分离法对小鼠脑组织P2、P3和S3组分中的微管蛋白进行定量
采用微管（MT）分离法将小鼠组织中的微管蛋白分离至P2、P3和S3组分，并通过蛋白质印迹法进行定量分析（图1A）。在100,000 × g 条件下超速离心20分钟后，保留在P2组分中的微管沉淀物占小鼠脑组织总微管蛋白的34.86% ± 1.68%。上清液（S2）进一步在500,000 × g 条件下离心60分钟，获得沉淀物（P3组分）和上清液（S3组分），分别占小鼠脑组织总微管蛋白的56.13% ± 2.12% 和 9.01% ± 0.68%（图1B）。

本研究中使用的大脑皮层包含神经元和非神经元细胞（如胶质细胞）。为选择性评估小鼠脑内神经元中微管（MT）的稳定性，我们通过Tuj1（抗TUBB3抗体）进行Western blotting，定量检测TUBB3——一种仅在中枢和外周神经系统神经元中表达的微管蛋白亚型。TUBB...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

研究生物组织中微管蛋白状态时，最重要的任务是防止在样品制备过程中发生意外的微管（MT）聚合或解聚。从组织取出到匀浆及离心的整个过程中，样品中微管的稳定性受到多种因素影响，包括MSB缓冲液中紫杉醇（Taxol）的浓度、组织量与缓冲液体积的比例以及温度。因此，针对使用20倍体积匀浆液分析小鼠组织的实验方案，每一步的操作条件均经过优化。即使在低温条件下，过高的紫杉醇浓度也可能在体外诱导微管聚合in vitro，甚至在冷藏条件下亦如此25。当分析微管蛋白浓度差异显著的组织，或对实验方案进行重大修改时，操作人员应根据各自实验的具体目标优化各步骤。

在本项研究中，通过在500,000 × g20条件下进行超速离心，从传统的"可溶性组分"中获得了一类新的微管（MTs）群体，称为P3。基于转子K因子、离心力和离心时间等因素的理论计算表明，S3组分中存在的微管蛋白最可能代表6S微管蛋白二聚体。相反，P3组分中的微管蛋白可能对应于长度较P2组分中微管更短的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究部分得到了以下资助：科学技术振兴机构（JST）设立的大学奖学金项目，旨在促进科学技术创新（A.HT.；JPMJFS2145）；JST SPRING项目（A.HT.；JPMJSP2129）；日本学术振兴会（JSPS）研究员奖励金（A.HT.；23KJ2078）；日本学术振兴会科研费（B）类别资助（22H02946，TM）；日本文部科学省（MEXT）“创新研究领域”专项资助，课题为"脑蛋白老化与痴呆症控制"（TM；26117004）；以及和田纪念财团上田纪念研究奖学金（TM；202020027）。作者声明无任何竞争性财务利益。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
500 个装 1.5 mL 离心管Beckman Coulter357448
1A2Sigma-AldrichT90281:5,000 稀释
2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）Nacalai Tesque02442-44
300 kDa 超滤离心柱AprosciencePT-1013
6-11B1Sigma-AldrichT74511:5,000 稀释
ÄKTAprime plusCytiva11001313
抗小鼠 IgGJackson ImmunoResearch115-035-1461:5,000 稀释
抑蛋白酶肽Peptide Institute Inc.4062
抑肽酶Nacalai Tesque03346-84
Chemi-Lumi One LNacalai Tesque07880-54
Corning 瓶顶真空过滤系统Corning4307580.22µm 33.2cm² 硝酸纤维素膜
DIFPSigma-Aldrich55-91-4 
DIGITAL HOMOGENIZER HK-1AS ONE1-2050-11
DM1ASigma-AldrichT90261:5,000 稀释
DTTNacalai Tesque14128-46
EGTANacalai Tesque37346-05
FluoroTrans W 3.3 米卷Pall CorporationBSP0161
甘油Nacalai Tesque17018-25
GTPNacalai Tesque17450-61
高速冷冻微量离心机 KitmanTOMYKITMAN-24
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg 柱Cytiva28-9893-35
Image Gauge 软件 FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
ImmunoStar LD FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation292-69903
KMX-1MilliporeMAB34081:5,000 稀释
LAS-4000 化学发光图像分析仪FUJIFILUM Wako Pure Chemical Corporation
亮抑蛋白酶肽Peptide Institute Inc.43449-62
MgSO4Nacalai Tesque21003-75
Na3VO4Nacalai Tesque32013-92
NaFNacalai Tesque31420-82
冈田酸LC LaboratoriesO-2220 
OPTIMA MAX-XPBeckman Coulter393315
胃蛋白酶抑制剂Nacalai Tesque26436-52
PMSFNacalai Tesque27327-81
TLA120.2 用聚碳酸酯离心管Beckman Coulter343778
蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete™，无 EDTA）Roche11873580001
纯化微管蛋白 CytoskeletonT240
QSONICA Q55QSonicaQ55
紫杉醇LC LaboratoriesP-9600
TLA-120.2 转子Beckman Coulter357656
TLA-55 转子Beckman Coulter366725
TLCKNacalai Tesque34219-94
Triton X-100Nacalai Tesque12967-45
β-甘油磷酸Sigma-AldrichG9422

参考文献

  1. Janke, C., Magiera, M. M. The tubulin code and its role in controlling microtubule properties and functions. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (6), 307-326 (2020).
  2. Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319-332 (2009).
  3. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  4. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  5. Challacombe, J. F., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Dynamic microtubule ends are required for growth cone turning to avoid an inhibitory guidance cue. Journal of Neuroscience. 17 (9), 3085-3095 (1997).
  6. Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the neuronal microtubule cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
  7. Leo, L., et al. Vertebrate fidgetin restrains axonal growth by severing labile domains of microtubules. Cell Reports. 12 (11), 1723-1730 (2015).
  8. Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
  9. Wloga, D., Joachimiak, E., Fabczak, H. Tubulin post-translational modifications and microtubule dynamics. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2207(2017).
  10. Baas, P. W., Black, M. M. Individual microtubules in the axon consist of domains that differ in both composition and stability. Journal of Cell Biology. 111 (2), 495-509 (1990).
  11. Cartelli, D., et al. Microtubule alterations occur early in experimental parkinsonism and the microtubule stabilizer epothilone D is neuroprotective. Scientific Reports. 3, 1837(2013).
  12. Zhang, B., et al. Microtubule-binding drugs offset tau sequestration by stabilizing microtubules and reversing fast axonal transport deficits in a tauopathy model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (1), 227-231 (2005).
  13. Zhang, F., et al. Post-translational modifications of alpha-tubulin in Alzheimer disease. Translational Neurodegeneration. 4, 9(2015).
  14. Miyasaka, T., et al. Curcumin improves tau-induced neuronal dysfunction of nematodes. Neurobiology of Aging. 39, 69-81 (2016).
  15. Fujiwara, H., et al. Inhibition of microtubule assembly competent tubulin synthesis leads to accumulation of phosphorylated tau in neuronal cell bodies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 521 (3), 779-785 (2020).
  16. Vielkind, U., Swierenga, S. H. A simple fixation procedure for immunofluorescent detection of different cytoskeletal components within the same cell. Histochemistry. 91 (1), 81-88 (1989).
  17. Kanai, Y., et al. Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173-1184 (1989).
  18. Brown, A., Li, Y., Slaughter, T., Black, M. M. Composite microtubules of the axon: quantitative analysis of tyrosinated and acetylated tubulin along individual axonal microtubules. Journal of Cell Science. 104 (2), 339-352 (1993).
  19. Black, M. M., Slaughter, T., Moshiach, S., Obrocka, M., Fischer, I. Tau is enriched on dynamic microtubules in the distal region of growing axons. Journal of Neuroscience. 16 (11), 3601-3619 (1996).
  20. Caron, J. M., Jones, A. L., Kirschner, M. W. Autoregulation of tubulin synthesis in hepatocytes and fibroblasts. Journal of Cell Biology. 101 (5), 1763-1772 (1985).
  21. Merrick, S. E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Selective destruction of stable microtubules and axons by inhibitors of protein serine/threonine phosphatases in cultured human neurons. Journal of Neuroscience. 17 (15), 5726-5737 (1997).
  22. Miyasaka, T., Sato, S., Tatebayashi, Y., Takashima, A. Microtubule destruction induces tau liberation and its subsequent phosphorylation. FEBS Letters. 584 (14), 3227-3232 (2010).
  23. Hagita, A., et al. Quantitative fractionation of tissue microtubules with distinct biochemical properties reflecting their stability and lability. Biochemical and Biophysical Research Communications. 560, 186-191 (2021).
  24. Montecinos-Franjola, F., Chaturvedi, S. K., Schuck, P., Sackett, D. L. All tubulins are not alike: Heterodimer dissociation differs among different biological sources. Journal of Biological Chemistry. 294 (26), 10315-10324 (2019).
  25. Vallee, R. B. A taxol-dependent procedure for the isolation of microtubules and microtubule-associated proteins (MAPs). Journal of Cell Biology. 92 (2), 435-442 (1982).
  26. Bartolo, M. E., Carter, J. V. Effect of microtubule stabilization on the freezing tolerance of mesophyll cells of spinach. Plant Physiology. 97 (1), 182-187 (1991).
  27. Strang, K. H., Golde, T. E., Giasson, B. I. MAPT mutations, tauopathy, and mechanisms of neurodegeneration. Laboratory Investigation. 99 (7), 912-928 (2019).
  28. Fourel, G., Boscheron, C. Tubulin mutations in neurodevelopmental disorders as a tool to decipher microtubule function. FEBS Letters. 594 (21), 3409-3438 (2020).
  29. Terry, R. D., Gonatas, N. K., Weiss, M. Ultrastructural studies in Alzheimer's presenile dementia. The American Journal of Pathology. 44 (2), 269-297 (1964).
  30. Yoshida, H., Ihara, Y. Tau in paired helical filaments is functionally distinct from fetal tau: assembly incompetence of paired helical filament-tau. Journal of Neurochemistry. 61 (3), 1183-1186 (1993).
  31. Cash, A. D., et al. Microtubule reduction in Alzheimer's disease and aging is independent of tau filament formation. The American Journal of Pathology. 162 (5), 1623-1627 (2003).
  32. Hempen, B., Brion, J. P. Reduction of acetylated alpha-tubulin immunoreactivity in neurofibrillary tangle-bearing neurons in Alzheimer's disease. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 55 (9), 964-972 (1996).
  33. Miyasaka, T., et al. Imbalanced expression of tau and tubulin induces neuronal dysfunction in C. elegans models of tauopathy. Frontiers in Neuroscience. 12, 415(2018).
  34. Boiarska, Z., Passarella, D. Microtubule-targeting agents and neurodegeneration. Drug Discovery Today. 26 (2), 604-615 (2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

相关文章