核糖体在翻译过程中以每密码子三个核苷酸的规律解码生成肽链。核糖体沿mRNA移动的过程通过核糖体谱型分析（ribosome profiling）得以捕获，产生具有典型三联体周期性的足迹信号。本实验方案介绍如何利用RiboCode从核糖体谱型数据中解析这一显著特征，从而在全转录组水平上鉴定处于活跃翻译状态的开放阅读框。
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方法文章
从头合成 利用核糖体谱分析数据鉴定活跃翻译的开放阅读框
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
鉴定开放阅读框（ORF），特别是那些编码小肽且在特定生理条件下处于活跃翻译状态的ORF，对于全面注释依赖于特定条件的翻译组至关重要。 核糖体谱分析（ribosome profiling）是一种用于检测核糖体在RNA上的结合位置和密度的技术，可实现全基因组范围内翻译事件发生位置的快速发现。然而，在生物信息学分析中，如何高效且全面地从核糖体谱数据中识别正在翻译的ORF仍非易事。本文介绍了一个易于使用的分析工具包RiboCode，该工具包旨在从核糖体谱数据中扭曲且模糊的信号里搜索任意大小的活跃翻译ORF。以我们先前发表的数据集为例，本文逐步演示了RiboCode完整分析流程的操作步骤，涵盖从原始数据预处理到最终输出结果文件的解读。此外，为评估已注释ORF的翻译水平，本文还详细描述了对每个ORF上核糖体密度进行可视化和定量分析的具体方法。总之，本文为翻译、小ORF及小肽相关研究领域提供了实用且及时的技术指南。
引言
近年来，越来越多的研究揭示了由编码基因的开放阅读框（ORFs）以及先前被注释为非编码的基因（如长链非编码RNA（lncRNAs））广泛翻译产生多肽的现象1,2,3,4,5,6,7,8。这些被翻译的ORF受到细胞调控或诱导，以响应环境变化、应激以及细胞分化过程1,8,9,10,11,12,13。一些ORF的翻译产物已被证实可在发育和生理过程中参与....
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方案
1. 环境配置与 RiboCode 安装
- 打开一个 Linux 终端窗口，并创建一个 conda 环境：
conda create -n RiboCode python=3.8 - 切换到所创建的环境，并安装 RiboCode 及其依赖项：
conda activate RiboCode
conda install -c bioconda ribocode ribominer sra-tools fastx_toolkit cutadapt bowtie star samtools
2. 数据准备
- 获取基因组参考文件。
- 对于参考序列，请访问 Ensemble 网站 https://www.ensembl.org/index.html, 点击顶部菜单 下载 和左侧菜单 FTP 下载在所示表格中，单击 FASTA 在柱中 DNA（FASTA） 以及所在的行 物种 是 人类在打开的....
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结果
示例核糖体谱分析数据集已存入 GEO 数据库，登录号为 GSE131074。本方案中使用的所有文件和代码均可从 补充文件 1-4通过将 RiboCode 应用于一组已发表的核糖体谱型分析数据集23，我们在经对照处理的MCF-10A细胞中鉴定了新开放阅读框的活跃翻译 EIF3E siRNA。为了筛选出最可能由翻译核糖体结合的RPF测序读段，对测序读段的长度进行了分析，并利用比对到已知翻译基因上的RPF进行全基因平均分析（metagene分析）。读段长度的频率分布显示，大多数RPF的长度为25–35 nt图1A），对应于核糖体所覆盖的核苷酸序列，符合预期。通过分别检测不同长度RPFs的5'端到注释的起始密码子和终止密码子之间的距离，确定其P位点位置（图1B）。28-32nt范围内的RPF读段显示出明显的3-nt周期性，其P位点位于+12处th
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讨论
核糖体谱分析为在基因组尺度上研究细胞中核糖体的活动提供了前所未有的机会。精确解读核糖体谱数据所携带的信息，有助于揭示基因或转录本的哪些区域正处于活跃翻译状态。本逐步操作方案详细指导如何使用 RiboCode 分析核糖体谱数据，包括软件包安装、数据准备、命令执行、结果解释以及数据可视化。RiboCode 的分析结果表明，翻译现象广泛存在，不仅发生在已知编码基因的未注释开放阅读框（ORF）上，也发生在许多此前被认为是非编码的转录本上。下游分析进一步提供了证据，显示核糖体在预测的 ORF 上以每三个核苷酸为一步的方式移动，符合翻译过程的特征；然而，目前尚不清楚这一翻译过程本身或所产生的多肽是否具有生物学功能。尽管如此，对基因组上正在翻译的 ORF 进行准确注释，将为探索此前未被表征的转录本功能带来令人振奋的新机遇31。
利用核糖体谱分析数据预测每个开放阅读框（ORF）的编码潜力，高度依赖于从ORF起始密码子到终止密码子范围内每个密码子上P位点密度的3-核苷酸周期性。因此，该方法需要精确确定不同长度测序读段的P位点位置。此类信息并非核糖体谱分.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢西安交通大学高性能计算中心（HPCC）平台提供的计算资源支持。Z.X. 衷心感谢西安交通大学青年拔尖人才支持计划的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 运行 Linux 的计算机/服务器 | 任意 | - | - |
| Anaconda 或 Miniconda | Anaconda | - | Anaconda: https://www.anaconda.com; Miniconda:https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html |
| R | R 基金会 | - | https://www.r-project.org/ |
| Rstudio | Rstudio | - | https://www.rstudio.com/ |
参考文献
- Eisenberg, A. R., et al. Translation Initiation Site Profiling Reveals Widespread Synthesis of Non-AUG-Initiated Protein Isoforms in Yeast. Cell Systems. 11 (2), 145-160 (2020).
- Spealman, P., et al.
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重印与许可
