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方法文章

成年小鼠急性纹状体脑片中耗氧率的测定

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DOI：

10.3791/63379

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2022年6月8日

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1Department of Neuroscience, Thomas Jefferson University, 2School of Biomedical Engineering, Drexel University, 3Department of Pathology, MitoCare Center, Thomas Jefferson University, 4School of Life Sciences, Peking University

本文内容

摘要

氧消耗率（OCR）是线粒体功能的常用指标，可用于研究不同的疾病模型。我们开发了一种新方法，利用Seahorse XF分析仪直接测量成年小鼠急性纹状体脑片中的OCR，该方法比其他方法更具生理相关性。

摘要

线粒体在细胞ATP生成、活性氧物种调控以及Ca2+浓度控制中发挥重要作用。线粒体功能障碍已被认为与多种神经退行性疾病的发病机制相关，包括帕金森病（PD）、亨廷顿病和阿尔茨海默病。为了研究线粒体在这些疾病模型中的作用，可通过测量氧消耗率（OCR）来间接评估线粒体功能。OCR已在细胞培养和分离的线粒体中成功测定。然而，这些技术相比在急性脑片中测量OCR，其生理相关性较低。为克服这一局限，作者开发了一种新方法，利用Seahorse XF分析仪直接测量成年小鼠急性纹状体脑片中的OCR。该技术针对纹状体进行了优化，纹状体是参与帕金森病和亨廷顿病的脑区。该分析仪使用24孔板进行活细胞检测，可同时对24个样本进行动力学测量。该方法以纹状体脑片经圆形打孔获得的组织片段作为样本。我们通过发现帕金森病小鼠模型纹状体脑片的基础OCR降低，验证了该技术的有效性。该方法将对从事帕金森病和亨廷顿病研究的科研人员具有广泛兴趣。

引言

线粒体功能障碍已被证实与多种神经系统疾病相关，包括帕金森病（PD）、亨廷顿病和阿尔茨海默病1,2,3。在PINK1基因敲除（KO）小鼠和大鼠等帕金森病模型中，均观察到线粒体功能受损4,5,6,7,8,9,10,11。从老年PINK1基因敲除小鼠的纹状体（STR）或全脑中分离出的线粒体，表现出复合物I的功能缺陷7,10,12,13。直接测量氧气消耗率（OCR）是评估线粒体功能最常用的方法之一，因为OCR与三磷酸腺苷（ATP）的生成相偶联，而ATP生成是线粒体的主要功能14。因此，在疾病模型或患者来源的样本/组织中测量OCR，有助于研究线粒体功能障碍如何导致疾病的发生发展。

目前，有多种方法可用于测量线粒体耗氧率（OCR），包括克拉克电极和其他O2电极、O2荧光染料以及细胞外通量分析仪15,16,17,18,19。基于O2电极的方法具有可方便添加多种底物的优势。然而，这类方法难以同时测量多个样本。与传统的基于O2电极的方法相比，细胞外通量分析仪作为细胞培养或纯化线粒体中OCR检测的常用工具，具有更高的通量15,18,20。然而，这些方法通常仅用于测量分离的线粒体或细胞培养物中的OCR6,16,17,19,20,21。线粒体的分离过程可能导致意外损伤，且提取出的线粒体或细胞培养物在生理相关性上低于完整的脑切片22。即使在脑切片中使用微电极，其灵敏度也较低，操作难度也高于培养细胞23。

为应对这些挑战，我们开发了一种利用XF24细胞外通量分析仪的方法，可对小鼠急性纹状体脑片中的多个代谢参数进行分析24。该技术通过氧消耗率（OCR）实现对线粒体呼吸的连续直接定量。简言之，将纹状体脑片的小片段置于胰岛素小孔板的孔中，分析仪利用基于荧光的氧和质子生物传感器，分别测量氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率17,21,25。

该分析仪的一个独特之处在于其四个注射孔，可在连续注入最多四种化合物或试剂的同时持续测量耗氧率（OCR），从而实现对多种细胞呼吸参数的测定，例如基础线粒体OCR、ATP偶联OCR以及最大线粒体OCR。根据Fried等人的研究25，本方案在测量过程中所注入的化合物分别为：第一加样孔（A孔）中含10 mM丙酮酸的工作浓度溶液，第二加样孔（B孔）中含20 µM寡霉素，第三加样孔（C孔）中含10 µM羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（FCCP），第四加样孔（D孔）中含20 µM抗霉素A。需要指出的是，上述浓度均为工作浓度，实际注入各加样孔A至D的储备液浓度分别为10倍、11倍、12倍和13倍。各溶液的作用如下：1）丙酮酸是必需的，因为若无丙酮酸，由于可利用底物受限，加入FCCP后将导致OCR响应减弱；2）寡霉素可抑制ATP合酶，从而用于测定与ATP生成相关的呼吸；3）FCCP可使氧化与磷酸化过程解偶联，从而用于测定线粒体的最大呼吸能力；4）抗霉素A可抑制电子传递链中的复合体III，因此可用于测定非线粒体来源的OCR。

所用寡霉素浓度的确定基于以下原因：1）对于大多数细胞类型（分离的线粒体或细胞培养物），推荐的寡霉素剂量为1.5 µM。根据经验，由于可能存在浓度梯度，且溶液渗透到脑片中需要一定时间，因此脑片实验通常使用比分离细胞高3至10倍的剂量。因此，浓度应在5 µM至25 µM范围内。2）选择20 µM的浓度是依据Fried等人的研究25。由于寡霉素具有非特异性毒性，未尝试更高浓度。3）Underwood等人26的报告中，作者对寡霉素进行了滴定实验，发现6.25、12.5、25和50 µg/mL的剂量均产生相似的抑制效果。较高浓度的寡霉素（50 µg/mL）并未增强抑制作用，但变异性更大。4）根据我们的观察，关键因素似乎是寡霉素的穿透能力。寡霉素难以穿透组织，因此需要至少7到8个循环才能达到平台期，即最大反应。只要达到平台期，即可认为抑制作用已达到最大。

将细胞外通量分析仪用于测量纹状体脑片的耗氧率（OCR）时，一个关键的技术挑战是防止组织缺氧。由于在整个测量过程中（约4小时）缓冲液未进行氧合，因此缺氧成为一个核心问题，尤其对于较厚的组织样本而言，氧气无法充分扩散至整个样本内部。为解决这一问题，脑片被切至150 µm的厚度，以确保环境中的氧气能够渗透到脑片的中心区域。此外，在预氧合的人工脑脊液（ACSF）缓冲液中添加了4 mg/mL的牛血清白蛋白（BSA），这有助于准确测定最大耗氧率，方法如先前研究所建议23。我们评估了细胞的存活状态：首先使用Hoechst 33258（10 µM）和碘化丙啶（10 µM）检测在该条件下细胞是否保持健康；随后通过膜片钳记录技术评估中等大小棘状神经元是否功能正常；进一步通过快速扫描伏安法检测纹状体脑片中多巴胺（DA）末梢是否功能完整，以测量DA的释放情况。结果显示，未进行氧合处理的纹状体脑片（ACSF/BSA组）与氧合对照组相比，细胞健康状况相当24。

随后，我们测试了不同切片厚度和打孔尺寸的组合，以确定用于通量呼吸测定的最佳纹状体切片条件。使用不同厚度（150 µm 和 200 µm）及不同打孔尺寸（直径分别为 1.0 mm、1.5 mm 和 2.0 mm）的背侧纹状体切片，通过分析仪进行OCR分析。结果表明，厚度为150 µm、打孔尺寸为1.5 mm直径的纹状体切片具有最高的偶联效率，且其OCR处于分析仪的最佳检测范围内24。

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方案

所有实验操作（包括动物实验）均按照国家和国际指南进行，并已获得托马斯杰斐逊大学动物护理与使用委员会的批准。实验使用3至14月龄的雄性FVB/NTac小鼠。以下步骤可在非无菌环境下进行，但应尽可能保持所有操作清洁。

注意：此处介绍的方法由 Zhi 等人在其报道的研究中建立并使用24。本实验描述中使用了 Seahorse XF24 细胞外通量分析仪（参见材料表）。这些方法也可适用于 XFe24 分析仪，部分结果已通过该仪器验证。

1. 水化检测盒传感器（在实验前一天进行）

  1. 打开细胞外通量检测试剂盒（参见材料表），取出传感器板（绿色）和校准板（透明；图1A）。将传感器板放置一旁（传感器朝上），切勿触碰传感器。
  2. 向校准板的每个孔中加入 600 µL 校准液（pH 7.4）。将传感器板置于校准板上方，使传感器浸入校准液中。确保校准板与传感器板的三角形缺口正确对齐（图1B）。
  3. 用密封膜密封细胞外通量检测试剂盒，防止校准液蒸发，然后将其置于 37 °C、无 CO2 和氧气补充的培养箱中过夜孵育。

2. 准备组织培养板（在检测当天）

  1. 打开胰岛捕获微孔板，取出用于组织放置的胰岛板。
  2. 在50 mL离心管中将适量体积（每孔625 µL）的预氧合改良人工脑脊液（ACSF，成分为140 mM NaCl、2.5 mM KCl、2.4 mM CaCl2、1.3 mM MgSO4、0.3 mM KH2PO4、25 mM葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.2）缓冲液加热至37 °C。然后加入BSA，使其终浓度为4 mg/mL，以制备呼吸缓冲液。通常情况下，50 mL缓冲液足够用于一块板。
  3. 小心地将625 µL呼吸缓冲液（含25 mM葡萄糖和4 mg/mL BSA的预氧合ACSF缓冲液）加入胰岛板的每个孔中，避免震荡板子。确保传感器盒顶部无残留液滴，且各孔缓冲液中无气泡存在。

3. 急性纹状体脑片制备与离体脑片放置

  1. 颈椎脱位后处死小鼠，立即在10 mL冰预氧合切割液（125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、3.7 mM MgSO4、0.3 mM KH2PO4、10 mM葡萄糖，pH 7.4）中解剖取出脑组织。
  2. 使用振动切片机（参见材料表）在冰预氧合切割液中按制造商说明制备冠状纹状体切片，厚度为150 µm。
  3. 将切片转移至50 mL含氧人工脑脊液（ACSF）（125 mM NaCl、2.5 mM KCl、26 mM NaHCO3、2.4 mM CaCl2、1.3 mM MgSO4、0.3 mM KH2PO4、10 mM葡萄糖、2 mM HEPES，pH 7.4）中，在室温（RT）下恢复最多30分钟。
  4. 恢复后，将切片转移至含有5 mL呼吸缓冲液的35 mm × 10 mm培养皿中。
  5. 使用不锈钢活检打孔器（例如，直径1.5 mm），在脑切片的目标区域打出圆形组织块。操作时保持切片浸没于缓冲液中，轻柔下压打孔器，确保施加足够压力以完全切割组织。去除周围多余组织，提起打孔器，并将圆形组织块转移至缓冲液中。
  6. 剪去1 mL移液枪头最末端，形成直径1.5–2.0 mm的开口，用于夹持并转移打孔后的脑组织至捕获筛网顶部。吸取一块打孔脑组织，小心将其放置于捕获筛网的网状面一侧（图2A）。捕获筛网为一侧附有筛网的圆形塑料片。
    注意：捕获筛网包含在微孔板套装中（参见材料表），其设计类似于Schuh等23中所用筛网。
  7. 用滤纸轻轻短暂吸干捕获筛网表面水分。去除水分后组织会变得黏稠，有助于切片牢固附着于筛网中央。注意不可过度干燥，以免损伤组织。
  8. 用镊子夹住捕获筛网，使切片侧朝下，将其放入胰岛培养板的任一孔中（图2B）。操作时注意避免切片脱落；若发生脱落，应取出筛网并更换新的切片。
    注意：切勿将脑切片放入胰岛板中的两个背景校正孔（A1和D6）。
  9. 将胰岛板置于37 °C培养箱中孵育至少30分钟，以确保温度和pH达到平衡，随后即可开始检测实验。

4. 用所需化合物装填色谱柱

  1. 将目标化合物用改良的 ACSF （37 °C）稀释至工作浓度的 10x、11x、12x 和 13x，分别对应 A 至 D 孔，并调节 pH 至 7.4。实验将按 A 到 D 的顺序依次施加化合物。本实验使用以下溶液，其各自的工作浓度列于其前：10 mM 丙酮酸（A 孔）、20 µM 寡霉素（B 孔）、10 µM 或其他浓度的 FCCP（C 孔）以及 20 µM 抗霉素 A（D 孔）。
  2. 轻轻将 75 µL 稀释后的化合物预装入传感器微孔板相应的加样孔中。以 45° 角将移液器吸头插入加样孔一半深度，并使吸头尖端紧贴加样孔内壁。切勿将吸头完全插入加样孔底部，以免导致化合物从孔中泄漏。
  3. 小心地从加样孔中抽出吸头，避免产生气泡。切勿敲击微孔板的任何部位，以防产生气泡。
  4. 目视检查加样孔，确保加样均匀。确认所有液体均位于孔内，且微孔板顶部无残留液滴。
  5. 将传感器微孔板放置于配套板上，并放入培养箱（非 CO2 培养箱）中孵育 30 分钟，使其温度再次升至 37 °C。操作时仅握住配套板，小心拿取，尽量减少移动。

5. 校准与执行检测

  1. 在软件中加载检测模板，然后点击绿色的开始按钮。
  2. 确保加载了正确的实验方案。该方案包含3分钟混合、3分钟等待和2分钟检测的序列组合（这三个步骤构成一次测量）。在仪器设置的硬件设置中，将探头高度从26,600调整至27,80025。XFe24 分析仪无需更换探头。点击开始。
  3. 将装有传感器的工具板放入仪器托盘中，缺口应位于前左角。确保板放置正确且平整。将装有药物的传感器 cartridge 放入分析仪中进行校准。
  4. 按照屏幕上的指示完成传感器的校准与平衡过程，此过程约需30分钟。
  5. 校准步骤完成后，取出校准板，替换为胰岛板（包含网格和组织切片）。
  6. 使用检测方案测量板中每个孔的耗氧量。该方案包含3分钟混合、3分钟等待和2分钟检测的序列组合（这三个步骤构成一次测量），此时将计算OCR值。
  7. 在整个实验过程中，首先进行4次OCR测量以建立基线，随后通过A孔注入丙酮酸盐并进行4次测量，接着通过B孔注入寡霉素并进行8次测量，再通过C孔注入FCCP并进行5次测量，最后通过D孔注入抗霉素A并进行6次测量。
    注意：每次化合物注射后的测量次数取决于测量值达到平台期的时间点。
  8. 分析OCR测量数据及偶联效率数据。

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结果

本研究的第一步是优化用于从脑片中切除纹状体区域的切片厚度和打孔尺寸（图3A）。经测定，150 µm 的切片厚度和 1.5 mm 的打孔尺寸可获得最佳结果，依据为偶联效率（图3B-C）。如图3B所示，OCR在5小时内相对稳定，下降幅度小于10%。此外，通过皮层神经元和纹状体中型棘状神经元的膜片钳记录，以及多巴胺（DA）释放的快速扫描循环伏安法（FSCV）检测等功能性测量，证实该制备方法下的神经元和神经末梢功能完整，如Zhi等24所述。在此基础上，我们进一步测试了不同浓度的FCCP，以确定最佳反应浓度；结果表明，10 µM FCCP在备用呼吸能力指标下可获得最佳读数（图3D1、D2）：

备用呼吸...

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讨论

我们开发的方法使得XF分析仪可用于测量成年小鼠纹状体脑片在4小时时间范围内的耗氧率（OCR）。该方法为测量从解剖学定义明确的脑区中切取的组织样本的细胞生物能量学提供了新途径。由于所分析的组织样本较小，因此可研究特定脑区在疾病中的代谢参数。此外，使用急性脑片能更接近地模拟生理状态下的细胞环境，而这是分离的线粒体、培养细胞或器官型脑片所无法实现的。进一步地，在单只动物或多个动物的不同脑区中，于一个24孔板内同时测量多个脑区的耗氧率，可极大提高采用该新技术的研究的统计学效力。

这是首次在成年小鼠急性纹状体脑片中测量氧消耗率（OCR）的实验方案。本研究聚焦于纹状体（STR），因为它是帕金森病（PD）和亨廷顿病主要累及的脑区之一。本研究中测得的基线OCR和耦合效率与其他使用XF分析仪在急性脑片中测量OCR的研究结果相当25,26,27。然而，与测量其他脑区的报道相比，本研究中纹状体脑片的备用呼吸能力似乎较小...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢王晨·次仁（Wangchen Tsering）和帕梅拉·沃尔特（Pamela Walter）对本文稿的审阅与编辑。本研究由美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）（NS054773 资助 C.J.L.，NS098393 资助 H.Z.）以及托马斯·杰斐逊大学神经科学系（H.Z. 的启动资金）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Accumet AB150 pH 台式计Thermo Fisher Scientific13-636-AB150用于测量 pH
链霉菌来源的抗霉素 A（Antimycin A）SIGMAA8674用于抑制线粒体复合物 III
牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）SIGMAA6003用于配制改良人工脑脊液（BSA-ACSF）
羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙（Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone, FCCP）SIGMAC2920用于解偶联线粒体呼吸
D-葡萄糖（D-Glucose）SIGMAG8270用于配制人工脑脊液（ACSF）
二甲基亚砜（DMSO）SIGMAD8418用于溶解化合物
HEPESSIGMAH3375用于配制人工脑脊液（ACSF）
加湿型无 CO₂ 培养箱Fisher Scientific11-683-230D用于在 37 °C 下水合培养板
浅黄紫链霉菌来源的寡霉素（Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes）SIGMAO4876用于抑制线粒体 ATP 合酶
Parafilm 封口膜SIGMA-ALDRICH封口用薄膜
鱼藤酮（Rotenone）Tocris3616用于抑制线粒体复合物 I
Seahorse XF 校准液 500 mLSeahorse Bioscience103681-100Seahorse 仪器校准用溶液
Seahorse XF 细胞外通量分析仪Seahorse Bioscience用于分析耗氧速率的设备，旧一代型号
Seahorse XFe24 细胞外通量分析仪Seahorse Bioscience用于分析耗氧速率的设备，新一代型号
Seahorse XF24 通量分析试剂盒Seahorse Bioscience101174-100包含通量分析传感器微孔板、组织培养板、捕获网、 校准液及校准板的套装；即检测试剂盒
丙酮酸钠（Sodium pyruvate）SIGMAP2256用于防止底物供应受限
不锈钢活检打孔器Miltex用于打取组织切片的装置
无菌细胞培养皿，35 × 10 mmEppendorf0030700102用于切片打孔
振动切片机（Vibratome）LeicaVT1200用于切割脑组织
水浴锅Thermo Scientific Precision282-115用于加热缓冲液和溶液

参考文献

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