原代人鼻上皮细胞：精准医学背景下的生物样本库建设

摘要

本文介绍了在气液界面条件下原代人鼻上皮（HNE）细胞的分离、扩增与分化方法，以及一种可成功冻存并复苏扩增后HNE细胞的生物样本库保存方案。该方案可分析分化后的HNE细胞的电生理特性，以及在不同调节剂处理下CFTR相关的氯离子分泌功能的纠正情况。

摘要

人鼻上皮（HNE）细胞可通过简单的无创性鼻腔刷取法轻松获取。来源于患者的原代HNE细胞可在气液界面条件下扩增并分化为假复层上皮，用于定量检测环磷酸腺苷介导的氯离子（Cl^-）转运，以此作为囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）功能的指标。若关键步骤（如鼻腔刷取的质量以及冻存时的细胞密度）操作得当，HNE细胞可成功实现生物样本库保存。此外，短路电流研究表明，冻融过程不会显著改变HNE细胞的电生理特性及其对CFTR调节剂的反应。在本研究采用的培养条件下，若每支冻存管中冻存的细胞数少于2 × 10⁶个，则失败率极高。我们建议每支冻存管至少冻存3 × 10⁶个细胞。我们发现，将CFTR校正剂与CFTR增效剂联合使用的双重疗法，在F508del纯合突变HNE细胞中对CFTR活性的校正效果相当。而三联疗法VX-445 + VX-661 + VX-770相较于双重疗法VX-809 + VX-770，显著提高了对CFTR活性的校正效果。HNE细胞中CFTR活性的测定是一种有前景的临床前生物标志物，可用于指导CFTR调节剂治疗方案的制定。

引言

囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种常染色体隐性遗传病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR）基因突变引起，导致CFTR蛋白缺失或功能障碍。CFTR是一种位于上皮细胞顶膜的阴离子通道^1,2。近年来CFTR靶向治疗取得显著进展，改善了该疾病的预后。最新获批的联合使用CFTR校正剂与CFTR增效剂的药物，显著改善了携带最常见突变p.Phe508del（F508del）的CF患者肺功能和生活质量^3,4。尽管治疗前景乐观，仍有约10%的CF患者无法从中获益，因其携带的突变类型无法被现有CFTR调节剂挽救。对于这些患者，亟需测试其他药物或药物组合，以寻找针对特定突变最有效的治疗方案，凸显了个体化治疗的重要性。

人鼻上皮（HNE）细胞可通过简单的无创性鼻腔刷取法轻松获取，并可用于量化环磷酸腺苷（cAMP）介导的氯离子（Cl⁻）转运，作为评估CFTR功能的指标。HNE细胞能够准确模拟人类气道，但其在体外培养中的寿命有限。得益于培养技术的优化，源自患者的原代HNE细胞可在Rho相关激酶抑制剂（ROCKi）作用下进行条件性重编程，扩增后在微孔滤膜上的气液界面（ALI）条件下分化为假复层上皮^5,6。目前存在多种HNE细胞的培养方案（包括商业化培养基、无血清培养基、"自制"培养基、与饲养细胞共培养等），已有研究报道培养基和培养条件的选择会影响细胞的生长、细胞群体的分化以及上皮功能^7,8。本文所述方案提供了一种简化的、无需饲养细胞的ROCKi扩增方法，可成功获得大量HNE细胞，并进一步在ALI条件下分化，用于CFTR功能检测。

我们已证明，在分化的HNE细胞中，使用CFTR调节剂处理48小时足以诱导CFTR依赖性Cl⁻电生理功能的纠正^- 当前以及所观察到的校正 体外 可能与患者的临床改善相关⁹因此，HNE细胞不仅适用于基础囊性纤维化（CF）研究，也适用于针对患者特异性CFTR调节剂的临床前研究。在此个体化治疗背景下，本方案旨在验证：在我们培养条件下复苏的囊性纤维化患者来源的冻存HNE细胞，可作为CFTR功能校正研究的合适模型，并且在比较CFTR依赖性氯离子（Cl⁻）电流时能够获得与新鲜细胞相似的实验结果。^- 评估了使用双重和三重疗法时不同CFTR调节剂的疗效。

方案

所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》和人类研究伦理的 Huriet-Serusclat 法律所描述的指南和规定进行。

1. 锥形瓶和不同培养基的准备

1. 按照表1中所述方法配制扩增培养基、气液相培养基和冻存培养基。
2. 通过将50 mg胶原蛋白IV溶解于100 mL 0.2%冰醋酸中，制备人胶原蛋白IV的储备液。使用磁力搅拌器搅拌至少1小时，并对溶液进行过滤除菌。置于4 °C避光保存于玻璃瓶中，可保存长达6个月。
3. 将储备液用双蒸水按1:5比例稀释，制备胶原蛋白IV的工作液。4 °C保存，可保存长达6个月。
4. 用胶原蛋白IV工作液对塑料细胞培养瓶或Transwell小室滤膜进行包被。在培养瓶整个生长表面均匀分布以下体积：0.33 cm² Transwell滤膜使用100 µL，25 cm²培养瓶使用500 µL，75 cm²培养瓶使用1 mL。
   注意：可通过轻轻倾斜培养瓶使其左右晃动以实现均匀分布。或者，为便于包被，可使用更大体积，待整个表面均匀覆盖后，吸出多余胶原溶液，仅保留上述指定体积。所吸出的胶原溶液可立即用于下一个培养瓶的包被（例如，对于三个75 cm²培养瓶，先在第一个瓶中均匀分布3 mL胶原溶液，吸出2 mL用于下一个瓶，依此类推）。
5. 将细胞培养瓶置于培养箱中孵育至少2小时或过夜。彻底吸除胶原溶液后，将培养瓶在培养箱或超净台中干燥至少20分钟或过夜。
6. 用10 mL无Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS洗涤，于培养箱中干燥，然后用铝箔包裹避光保存。室温（RT）下可保存长达6个月。

2. 鼻腔刷取

注意：确保在受试者无急性感染时进行鼻腔刷取。若囊性纤维化（CF）患者存在肺部感染，应参考患者的抗生素敏感性图谱，并在扩增培养基中添加额外的抗生素。人鼻腔上皮细胞通过鼻腔刷取法从F508del/F508del患者中采集，方法如前所述⁹。

1. 让患者擤鼻，然后使用浸有5%利多卡因与萘甲唑啉溶液的棉网对双侧鼻孔的黏膜进行局部麻醉。
2. 用细胞刷轻轻刷取双侧鼻孔的鼻中隔内侧壁和下鼻甲，将刷子浸入含2 mL市售灌洗液的15 mL离心管中，轻轻振荡以使细胞脱落。在另一侧鼻孔重复刷取操作。
3. 在灌洗液中加入以下抗生素：青霉素（100 U/mL）、链霉素（100 µg/mL）、他唑西林（10 µg/mL）、两性霉素B（2.5 µg/mL）和多黏菌素（Colimycin，16 µg/mL）。
   ​注意：鼻刷样本可在室温下运送至专用实验室进行扩增和培养，且最迟可在刷取后72小时内接种。

3. HNE 的分离

注意：HNE 通过细胞学刷取法分离，用无 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的 DPBS 洗涤后，以 0.25% 胰蛋白酶消化解离，并按先前所述方法接种至 25 cm² 塑料培养瓶中¹⁰。

1. 通过将细胞刷反复穿过1000 µL移液器吸头，并用2 mL无Mg²⁺和Ca²⁺的DPBS冲洗，从细胞刷上解离细胞。在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。
2. 将沉淀重悬于0.25%胰蛋白酶中消化8–12分钟以解离细胞。加入5 mL扩增培养基终止酶反应。
3. 在4 °C下以500 × g离心5分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于8 mL扩增培养基中，接种至一个25 cm²的胶原蛋白包被培养瓶中。于37 °C、5% CO₂条件下培养。此为第0代。
4. 次日，更换为5 mL新鲜扩增培养基，每日观察细胞贴壁情况、形态（细胞应呈紧密的鹅卵石样外观）及数量。
   ​注意：初始接种密度取决于鼻腔刷取样本的质量及上皮细胞所占比例。新鲜分离的人鼻上皮细胞通常在3–10天内达到80%–90%融合度。若细胞生长缓慢，提示样本中上皮细胞不足，应弃用该样本。

4. 人鼻腔上皮细胞的扩增与传代

1. 将人鼻上皮细胞接种于经胶原蛋白包被的培养瓶中，在 37 °C、5% CO₂ 条件下使用扩增培养基培养至 80%–90% 汇合度，每 48–72 小时更换一次培养基。对于 25 cm² 培养瓶，使用 5 mL 扩增培养基；对于 75 cm² 培养瓶，使用 10 mL。
2. 当细胞达到 80%–90% 汇合度时，用 10 mL 无 Mg²⁺ 和 Ca²⁺ 的 DPBS 洗涤细胞，吸除并弃去洗涤液。
3. 向 25 cm² 培养瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶（或向 75 cm² 培养瓶中加入 2 mL 胰蛋白酶），放回培养箱（37 °C，5% CO₂）孵育 8–12 分钟。
4. 用手掌用力轻拍培养瓶，以促进细胞脱落。
5. 加入 10 mL 扩增培养基以终止酶反应。使用 10 mL 移液管反复吹打，将扩增培养基在培养瓶表面反复冲洗，以充分冲洗并悬浮细胞。
6. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
7. 将沉淀物重悬于 5–10 mL 扩增培养基中。
8. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
   ​注意：此时可将细胞冻存（参见步骤 5.1–5.3）。如需进一步扩增，可将细胞重新接种至胶原蛋白包被的培养瓶中（一个 25 cm² 培养瓶的细胞可扩增至三个 75 cm² 培养瓶，不建议更高倍数的稀释）。

5. 原代鼻上皮细胞的冷冻保存

注意：在进行生物样本保藏前，需将 HNE 细胞培养至第 1 代，以确保冻存后复苏时有足够的细胞量支持细胞生长。然而，也可在初始第 0 代或第 2 代进行生物样本保藏。以下冷冻保存步骤适用于所有代次。

1. 细胞计数后，在 4 °C 条件下以 500 x g 离心 5 分钟，弃去上清液
2. 用加富冷冻培养基（表 1）重悬细胞沉淀，使每毫升每冻存管含有 3 x 10⁶-5 x 10⁶ 个细胞。
3. 将细胞缓慢冷冻，使用合适的冻存容器在 -80 °C 下以约每分钟 1 °C 的速率降温。次日，将保存的样本转移至液氮储存容器中进行长期保存（本研究最长保存时间为 17 个月）。

6. 解冻冻存的扩增后HNE细胞

1. 将水浴锅预热至 37 °C。按照表 1 所述配制扩增培养基，并将培养基预热至 37 °C。
2. 从液氮储存罐中取出冻存管，迅速放入水浴锅中，注意不要将整个冻存管浸入水中。当冻存管内仅剩少量冰晶时，将其从水浴中取出。用 70% 酒精擦拭管身，擦干后置于生物安全柜中。
3. 使用 1 mL 移液器将解冻后的细胞转移至一个空的 15 mL 离心管中。
4. 以逐滴方式加入 1 mL 预热的扩增培养基。1 分钟后，再加入 1 mL 扩增培养基，继续静置 1 分钟。
5. 加入 10 mL 扩增培养基，以 500 x g 离心 2 分钟。
6. 吸除并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于适量扩增培养基中，调整细胞密度至至少 1 x 10⁶ 个细胞/mL。
7. 将细胞接种至含扩增培养基的胶原蛋白包被培养瓶中。
   1. 若冻存管中细胞数量超过 4 x 10⁶ 个，则接种至 75 cm² 培养瓶中，加入 10 mL 扩增培养基
   2. 若冻存管中细胞数量少于 4 x 10⁶ 个，则接种至 25 cm² 培养瓶中，加入 5 mL 扩增培养基
8. 于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养，在接下来的 2–3 天内观察细胞增殖情况。
9. 随后，按照第 4 节所述进行细胞扩增。
   ​注意：若在步骤 4.7 中收获的细胞数量较少（例如在扩增前的第 0 代即进行冻存），则可省略步骤 6.5 和 6.6，直接将细胞接种至 25 cm² 胶原蛋白包被培养瓶中，无需离心。次日必须更换培养基以去除二甲基亚砜（DMSO）。

7. 人鼻腔上皮细胞在气液界面的分化

注意：HNE 在气液界面的分化方法如前所述¹⁰。

1. 将细胞以每0.33 cm²胶原蛋白包被的多孔滤膜330,000个细胞的密度接种，在顶端加入300 µL扩增培养基，在基底侧加入900 µL气液界面培养基。
2. 3天后，吸除顶端培养基，将细胞在气液界面培养基中于气液界面条件下培养3-4周，以建立分化的上皮层。每48-72小时更换一次基础培养基。

8. CFTR 调节剂

1. 配制含有CFTR调节剂的气液相培养基。使用VX-445、VX-661和VX-809，终浓度为3 µM，VX-770的终浓度为100 nM。使用校正剂ABBV-2222，终浓度为1 µM，增效剂ABBV-974，终浓度为10 µM。所有CFTR调节剂均用100% DMSO溶解。
2. 配制含有与校正剂培养基中等量100% DMSO的气液相培养基。
3. 将含有药物或DMSO的培养基加入在气液界面培养的极化人鼻上皮（HNE）细胞的基底外侧，于37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
4. 24小时后，吸除并弃去培养基，更换为按步骤8.1–8.2配制的新鲜培养基，继续在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。

9. 尤斯灌流室研究

1. 按照先前所述方法⁹，在电压钳制条件下测量短路电流（Isc）。
   注意：使用手持式伏特计测量培养物的跨上皮电阻（TEER），仅选用电阻值达到至少 200 Ω·cm² 的培养物进行后续实验。将极化的人鼻上皮（HNE）细胞滤膜安装于尤辛室（Ussing chamber）中，并在电压钳制条件下测定短路电流（Isc）。

10. 免疫细胞化学

1. 按照先前所述方法进行免疫检测⁹。
   ​注意：CFTR 免疫检测使用抗 CFTR C 末端（24-1）单克隆抗体，以 1/100 稀释度在 4°C 下孵育过夜。在其他滤膜上分别进行 Zona-occludens-1（ZO-1）（1/500 稀释）、α-微管蛋白（alpha-tubulin）（1/300 稀释）、Muc 5AC（1/250 稀释）和角蛋白 8（cytokeratin 8）（1/250 稀释）染色。用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 洗涤后，加入与 Alexa 488 或 594 偶联的山羊二抗，在 10% 山羊血清中室温孵育 30 分钟（1/1000 稀释）。最终洗涤后，将滤膜从支撑物上切下，用含 DAPI 的 Vectashield 封片剂封片。使用共聚焦显微镜（63x/1.4 油镜微分干涉相差 λ 蓝色 PL APO 物镜）采集图像，并用 ImageJ 软件进行分析。

11. 统计分析

1. 使用适当的软件进行统计分析。
   注：统计分析使用 S.A.S 软件完成。由于每位患者在每种条件下获得了多个 HNE 滤器，定量参数以每位患者的中位数（± SEM）表示。组间比较（均值 ± 标准差）采用 Wilcoxon 配对符号秩检验或非配对 t 检验进行。

结果

在气液界面培养的原代HNE细胞经免疫染色评估，表现出极化且分化的呼吸道上皮细胞的典型特征图1）。HNE细胞重新分化为一层异质性的上皮细胞（角蛋白8免疫染色阳性），模拟了 体内 假复层呼吸上皮由纤毛细胞（α-微管蛋白染色阳性）和非纤毛的黏液分泌性杯状细胞（Muc5Ac 免疫染色阳性）组成。整个上皮存在紧密连接（通过 ZO-1，即闭合蛋白-1 染色评估）。在野生型（WT）HNE 细胞中可见明显的顶膜 CFTR 染色，而在 F508del/F508del HNE 细胞中，顶膜及胞质内的 CFTR 染色均减弱。

我们将阳性结果定义为样本不仅成功扩增，而且在气液界面培养3周后成功分化为假复层上皮，并且经上皮电阻（TEER）高于200 Ω·cm²，可进行短路电流测量。由于仅有少数专业实验室通过短路电流测量开展与CFTR相关的Cl^-分泌检测，样本通常需要从医院转运至专门设施。

在78份新鲜的HNE细胞样本中，比较了立即接...

讨论

已有研究提出，在个体化医学背景下，可使用患者来源的鼻上皮细胞作为人支气管上皮（HBE）细胞的替代模型，用于检测CFTR活性，因为HNE细胞在培养中能够重现原代细胞的特性^9,11。与HBE细胞培养相比，HNE细胞的主要优势在于其取材简便且无创。通过HNE细胞培养模型进行短路电流检测，可评估上皮细胞中依赖CFTR的Cl^-转运功能，该指标已被证明与通过鼻电位差法在不同基因型患者体内测得的CFTR in vivo 活性存在显著相关性⁹。此外，HNE细胞经VX-809处理后CFTR活性的恢复程度，也与接受lumacaftor-ivacaftor治疗的F508del纯合子患者的临床结局FEV₁改善程度显著相关¹²。

重要的是，本研究表明，新鲜采集的人鼻上皮（HNE）细胞能够很好地耐受运输和常规 shipping 条件（例如...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABBV-2222	Selleckchem	S8535
ABBV-974	Selleckchem	S8698
高级 DMEM/F-12	Life Technologies	12634010
Alexa 488 山羊二抗	Invitrogen	A11001
Alexa 594 山羊二抗	Invitrogen	A11012
两性霉素 B	Life Technologies	15290026
抗 α-微管蛋白抗体	Abcam	ab80779
抗 CFTR 单克隆抗体 (24-1)	R&D Systems	MAB25031
抗细胞角蛋白 8 抗体	Progen	61038
抗 Muc5AC 抗体	Santa Cruz Biotech	sc-20118
抗 ZO-1 抗体	Santa Cruz Biotech	sc-10804
环丙沙星		由 Necker 医院药房提供
Colimycin	Sanofi	由 Necker 医院药房提供
IV 型胶原	Sigma-Aldrich Merck	C-7521
细胞刷	Laboratory GYNEAS	02.104
DMSO	Sigma-Aldrich Merck	D2650
EGF	Life Technologies	PHG0311
肾上腺素	Sigma-Aldrich Merck	E4375
F12 营养混合物	Life Technologies	11765054
FBS	Life Technologies	10270106
Ferticult	Fertipro NV	FLUSH020
25 cm² 培养瓶	Thermo Scientific	156.367
75 cm² 培养瓶	Thermo Scientific	156.499
冰醋酸	VWR	20104.298
HEPES	Sigma-Aldrich Merck	H3375
氢化可的松	Sigma-Aldrich Merck	SLCJ0893
胰岛素	Sigma-Aldrich Merck	I0516
Mg2+ 和 Ca2+-free DPBS	Life Technologies	14190094
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140130
Tazocillin	Mylan	由 Necker 医院药房提供
Transwell 小室滤膜	Sigma-Aldrich Merck	CLS3470-48EA
Triton-X100	Sigma-Aldrich Merck	T8787
0.25% 胰蛋白酶	Life Technologies	25200056
含 DAPI 的 Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H-1200
VX-445	Selleckchem	S8851
VX-661	Selleckchem	S7059
VX-770	Selleckchem	S1144
VX-809	Selleckchem	S1565
5% 利多卡因-萘甲唑啉	Aspen France	由 Necker 医院药房提供
Y-27632	Selleckchem	S1049