本文介绍了在气液界面条件下原代人鼻上皮（HNE）细胞的分离、扩增与分化方法，以及一种可成功冻存并复苏扩增后HNE细胞的生物样本库保存方案。该方案可分析分化后的HNE细胞的电生理特性，以及在不同调节剂处理下CFTR相关的氯离子分泌功能的纠正情况。
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摘要
摘要
人鼻上皮（HNE）细胞可通过简单的无创性鼻腔刷取法轻松获取。来源于患者的原代HNE细胞可在气液界面条件下扩增并分化为假复层上皮，用于定量检测环磷酸腺苷介导的氯离子（Cl-）转运，以此作为囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）功能的指标。若关键步骤（如鼻腔刷取的质量以及冻存时的细胞密度）操作得当，HNE细胞可成功实现生物样本库保存。此外，短路电流研究表明，冻融过程不会显著改变HNE细胞的电生理特性及其对CFTR调节剂的反应。在本研究采用的培养条件下，若每支冻存管中冻存的细胞数少于2 × 106个，则失败率极高。我们建议每支冻存管至少冻存3 × 106个细胞。我们发现，将CFTR校正剂与CFTR增效剂联合使用的双重疗法，在F508del纯合突变HNE细胞中对CFTR活性的校正效果相当。而三联疗法VX-445 + VX-661 + VX-770相较于双重疗法VX-809 + VX-770，显著提高了对CFTR活性的校正效果。HNE细胞中CFTR活性的测定是一种有前景的临床前生物标志物，可用于指导CFTR调节剂治疗方案的制定。
引言
囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种常染色体隐性遗传病，由囊性纤维化跨膜传导调节因子（Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator, CFTR）基因突变引起，导致CFTR蛋白缺失或功能障碍。CFTR是一种位于上皮细胞顶膜的阴离子通道1,2。近年来CFTR靶向治疗取得显著进展，改善了该疾病的预后。最新获批的联合使用CFTR校正剂与CFTR增效剂的药物，显著改善了携带最常见突变p.Phe508del（F508del）的CF患者肺功能和生活质量3,4。尽管治疗前景乐观，仍有约10%的CF患者无法从中获益，因其携带的突变类型无法被现有CFTR调节剂挽救。对于这些患者，亟需测试其他药物或药物组合，以寻找针对特定突变最有效的治疗方案，凸显了个体化治疗的重要性。
人鼻上皮（HNE）细胞可通过简单的无创性鼻腔刷取法轻松获取，并可用于量化环磷酸腺苷（cAMP）介导的氯离子（Cl−）转运，作为评估CFTR功能的指标。HNE细胞能够准确模拟人类气道，但其在体外培养中的寿命有限。得益于培养技术的优化，源自患者的原代HNE细胞可在Rho相关激酶抑制剂（ROCKi）作用下....
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方案
所有实验均遵循《赫尔辛基宣言》和人类研究伦理的 Huriet-Serusclat 法律所描述的指南和规定进行。
1. 锥形瓶和不同培养基的准备
- 按照表1中所述方法配制扩增培养基、气液相培养基和冻存培养基。
- 通过将50 mg胶原蛋白IV溶解于100 mL 0.2%冰醋酸中，制备人胶原蛋白IV的储备液。使用磁力搅拌器搅拌至少1小时，并对溶液进行过滤除菌。置于4 °C避光保存于玻璃瓶中，可保存长达6个月。
- 将储备液用双蒸水按1:5比例稀释，制备胶原蛋白IV的工作液。4 °C保存，可保存长达6个月。
- 用胶原蛋白IV工作液对塑料细胞培养瓶或Transwell小室滤膜进行包被。在培养瓶整个生长表面均匀分布以下体积：0.33 cm2 Transwell滤膜使用100 µL，25 cm2培养瓶使用500 µL，75 cm2培养瓶使用1 mL。
注意：可通过轻轻倾斜培养瓶使其左右晃动以实现均匀分布。或者，为便于包被，可使用更大体积，待整个表面均匀覆盖后，吸出多余胶原溶液，仅保留上述指定体积。所吸出的胶原溶液可立即用于下一个培养瓶的包被（例如，对于三个75 cm2培养瓶，先在第一个瓶中均匀分布3 mL胶原溶液，吸出2 mL用于下一个瓶，依此类推）....
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结果
在气液界面培养的新鲜HNE细胞经免疫染色评估，表现出极化且分化的呼吸道上皮细胞的典型特征图1）。HNE细胞重新分化为一层异质性的上皮细胞（角蛋白8免疫染色阳性），模拟了 体内 假复层呼吸上皮由纤毛细胞（α-微管蛋白染色阳性）和非纤毛的杯状细胞（Muc5Ac 免疫染色阳性，可产生黏液）组成。整个上皮存在紧密连接（通过 ZO-1，即闭锁小带蛋白-1 染色确认）。在野生型（WT）HNE 细胞中可见明显的顶膜 CFTR 染色，而在 F508del/F508del HNE 细胞中，顶膜及胞质内的 CFTR 染色均减弱。
我们将阳性结果定义为样本不仅成功扩增，而且在气液界面培养3周后成功分化为假复层上皮，并且跨上皮电阻（TEER）高于200 Ω·cm2，从而能够进行短路电流测量。由于仅有少数专业实验室通过短路电流测量开展与CFTR相关的Cl-分泌实验，样本通常需要从医院转运至专门设施。
在78份新鲜的HNE细胞样本中，.......
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讨论
已有研究提出，在个体化医学背景下，可使用患者来源的鼻上皮细胞作为人支气管上皮（HBE）细胞的替代模型，用于检测CFTR活性，因为HNE细胞在培养中能够重现原代细胞的特性9,11。与HBE细胞培养相比，HNE细胞的主要优势在于其取材简便且无创。通过HNE细胞培养模型进行短路电流检测，可评估上皮细胞中依赖CFTR的Cl-转运功能，该指标已被证明与通过鼻电位差法在不同基因型患者体内测得的CFTR in vivo 活性存在显著相关性9。此外，HNE细胞经VX-809处理后CFTR活性的恢复程度，也与接受lumacaftor-ivacaftor治疗的F508del纯合子患者的临床结局FEV1改善程度显著相关12。
重要的是，本研究表明，新鲜采集的人鼻上皮（HNE）细胞能够很好地耐受运输和常规 shipping 条件（例如.......
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披露
作者声明本出版物或科学视频制作不存在相关的竞争性经济利益。
致谢
我们衷心感谢所有参与本研究的患者及其家属。本研究得到了法国囊性纤维化战胜协会（Vaincre la Mucoviscidose）、法国ABCF 2协会以及Vertex Pharmaceuticals创新奖的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| 高级 DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 山羊二抗 | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 山羊二抗 | Invitrogen | A11012 | |
| 两性霉素 B | Life Technologies | 15290026 | |
| 抗 α-微管蛋白抗体 | Abcam | ab80779 | |
| 抗 CFTR 单克隆抗体 (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| 抗细胞角蛋白 8 抗体 | Progen | 61038 | |
| 抗 Muc5AC 抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| 抗 ZO-1 抗体 | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| 环丙沙星 | 由 Necker 医院药房提供 | ||
| Colimycin | Sanofi | 由 Necker 医院药房提供 | |
| IV 型胶原 | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| 细胞刷 | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| 肾上腺素 | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12 营养混合物 | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| 25 cm² 培养瓶 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| 75 cm² 培养瓶 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| 冰醋酸 | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ 和 Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | 由 Necker 医院药房提供 | |
| Transwell 小室滤膜 | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| 0.25% 胰蛋白酶 | Life Technologies | 25200056 | |
| 含 DAPI 的 Vectashield 封片剂 | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| 5% 利多卡因-萘甲唑啉 | Aspen France | 由 Necker 医院药房提供 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
参考文献
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201(2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecul....
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重印与许可
