需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

一种改良的小鼠肾移植外科技术

6.9K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63434

⸱

2022年7月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric and Adolescent Medicine, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 2Department of Pediatric Surgery, Chengdu Women’s and Children's Central Hospital, 3The Key Laboratory of Hainan Trauma and Disaster Rescue, The first affiliated Hospital of Hainan Medical University, 4Department of Department of Pediatric Kidney, Liver, and Metabolic Diseases, Hannover Medical School, 5Department of Nephrology, Hannover Medical School, 6Department of Nephrology, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg, 7Department of Dermatology, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nürnberg

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种小鼠肾移植的新型外科技术，重点在于改良的动脉吻合策略。同时介绍了一种血管缝合技术，包括一种更简单且更安全的输尿管-膀胱吻合方法。这些改进可缩短手术时间，并提高小鼠肾移植手术的成功率。

摘要

小鼠肾移植手术是一项复杂且具有挑战性的外科操作。目前极少有文献详细展示该手术的关键步骤。因此，本文介绍了这一技术，并指出了与该操作相关的手术注意事项。此外，还展示了相对于传统方法的重要改进之处。首先，切除并制备一段腹主动脉，使得包括输尿管动脉在内的肾动脉近端分叉与供体肾脏一并整体（en bloc）切除。这种方法可降低输尿管坏死的风险，并避免尿路梗阻的发生。其次，本文展示了一种新的血管吻合方法，该方法允许操作者在肾移植再灌注已经开始后，灵活地扩大或缩小吻合口的大小。这有助于避免血管狭窄和腹腔内出血的发生。第三，介绍了一种能够实现精细的供体输尿管与受体膀胱吻合且不造成创伤的技术。采用本方案可缩短手术时间，减少对受体膀胱的损伤，从而显著提高受体小鼠手术的成功率。

引言

自Sakowitz等人于1973年首次建立小鼠肾移植模型以来1，该模型已成为研究移植缺血性损伤和同种免疫排斥机制的重要实验工具，同时也被用于开发旨在延长同种移植物存活时间甚至实现免疫耐受的新疗法。然而，该手术技术复杂且要求极高，有时会出现血管吻合口狭窄等并发症，导致肾前性非免疫性移植肾衰竭2；或因缺血及移植输尿管继发性坏死引起肾后性衰竭；以及移植输尿管与受体膀胱吻合口狭窄，导致尿液流出通路受阻。这些因素导致小鼠肾移植技术未能进一步发展，因而未被广泛应用。建立一种无血管及泌尿系统并发症的有效且长期稳定的小鼠肾移植模型，对于移植领域内许多聚焦于肾脏免疫介导性疾病以及感染性疾病的研究所具有的不可替代的重要意义3。此外，与其他小鼠器官移植模型（如肺、心脏和肠道移植）相比4,5，小鼠肾移植模型在主要组织相容性抗原差异存在的情况下，仍可为研究长期存活提供可能3,6。已有研究表明，在相同供受体品系组合条件下，不同器官移植（如心脏或肾脏）的移植物排斥反应具有不同的动态过程和发作时间3。此外，从肾脏病学角度来看，相较于简单的皮肤移植实验，该模型更适用于研究急性与慢性排斥事件背景下由肾实质介导的免疫调节机制。

基于先前关于小鼠肾移植手术技术的报道3,7,8,9，本文展示了我们在过去10年中在本课题组内成功应用的以下可靠改进：10,11,12 首先，在切除肾动脉时，将肾动脉与相应节段的腹主动脉一并完整切除（en bloc），从而安全保留输尿管动脉。其次，采用一种新的、简便且快速的无结血管吻合技术，该技术不同于传统方法将吻合的末端缝线与上方结扎线末端打结，而是使最后一针保持自由状态。该技术可在肾脏再灌注后调节吻合口大小，以避免血管狭窄和腹腔内出血。第三，使用21 G和30 G注射针头作为辅助穿刺引导工具，将供体输尿管植入受体膀胱壁，从而减少对受体膀胱的损伤，并有助于形成无狭窄的吻合口。

在本报告中，我们还比较了传统且广泛使用的技术与本实验室建立的改良技术，发现两者在肾小管萎缩程度和肾移植间质组织纤维化方面无显著差异。在之前的研究中，我们进一步从局部出血、血栓形成、血管吻合操作时间及存活率等方面，将该新技术的结果与传统方法进行了比较。我们发现，新技术在多个方面有所改进，例如局部血栓事件显著减少（1.1% 对比 6.6%）、吻合操作时间缩短，以及同基因型肾移植的长期存活率高度可重复（95% 对比经典方法的 84%）10。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验均按照欧洲议会关于用于科学目的动物保护的第2010/63/EU号指令指南进行（动物伦理许可卡：德国下萨克森州食品与药品安全局，编号#33.9-42502-04-11/0492）。操作过程中须使用无菌外科器械和耗材（经高压灭菌），并尽可能保持手术区域的无菌状态。

注意：C57BL/6J 雄性小鼠作为供体和受体（同基因移植模型），而 Balb/c 小鼠作为肾脏异基因移植受体（用于研究急性异基因移植排斥反应模型9）。小鼠在移植时年龄为 8–12 周，体重约为 25–30 g，在标准条件下饲养。本论文中报告的数据由四位精通小鼠手术的外科医生生成。

1. 准备步骤

  1. 手术时使用一套显微器械，包括显微剪、显微镊、持针器、微型止血钳和电外科笔。缝合时采用 7/0、10/0 或 4/0 尼龙单丝线。
  2. 麻醉时，将小鼠放入麻醉盒中吸入异氟烷（2%），持续约 40–60 秒，以诱导意识丧失。
  3. 小鼠麻醉后，称量其体重。
  4. 根据小鼠体重，通过腹腔注射给予氯胺酮（100 mg/kg）+ 赛拉嗪（10 mg/kg）+ 乙酰丙嗪（2 mg/kg）以维持麻醉状态13。通过轻捏脚趾无反应来确认小鼠已充分麻醉。
  5. 麻醉生效后，剪除腹部毛发。然后用无菌胶带松散固定四肢，将小鼠固定于手术台上。
  6. 将小鼠固定于手术台后，对其腹部进行消毒。使用聚维酮碘（碘伏）和酒精交替擦拭消毒三次（采用同心圆方式，从腹部中央开始向外周扩展），随后使用带孔洞的手术巾正确铺巾。
  7. 涂抹眼膏，并在整个手术过程中保持无菌操作。
    ​注意：不建议在手术过程中使用抗生素，因为这些物质可能影响免疫反应。

2. 供体手术操作步骤

  1. 使用剪刀剪开皮肤，进行约 3-4 cm 的腹部十字切口。切开腹壁肌肉，用浸有生理盐水的纱布覆盖并小心移开内脏。
  2. 用棉签轻轻将肠管、胃和脾脏推向右侧（从小鼠视角），用浸有生理盐水的纱布覆盖并小心移开内脏。
  3. 使用显微镊子暴露左肾、主动脉和下腔静脉（IVC）。
  4. 使用电外科笔小心地烧灼左侧腰静脉，包括其下方分支以及左侧肾上腺血管附近的所有小血管。
  5. 使用显微剪刀和显微镊子分离左输尿管，并小心地从周围组织中游离。在靠近膀胱处将其整齐切断。游离左右肾动脉之间的主动脉区域，长度约 2 mm。
  6. 使用显微镊子分离肾下段下腔静脉（IVC）与主动脉，然后使用弯头镊子从主动脉下方穿过，将一根7-0丝线松松地环绕该血管打结。
  7. 使用两个 5 mm 的微血管夹，夹闭右肾动脉下方的主动脉区域以及下腔静脉（IVC）。
  8. 将左肾静脉从下腔静脉处横断切断。
  9. 使用注射器以 1 mL 肝素生理盐水溶液（60 U/mL）冲洗主动脉。
  10. 使用显微镊子收紧第 2.5 步中放置的结扎线，然后在结扎线下方以及近端夹子下方切断主动脉。由此，将肾动脉的近端分叉部分（请注意，动脉切口必须整齐，否则会影响吻合）以及输尿管动脉一并完整横断切除（en bloc）。操作需仔细，确保纤细的输尿管动脉被完整保留。
  11. 使用电外科笔和镊子，通过小心烧灼所有周围血管组织，完全游离左肾及其相关血管。取出肾脏并置于 4 °C 的生理盐水中保存。
  12. 通过断头法处死已麻醉的供体小鼠。

3. 受体手术操作步骤

  1. 按照供体小鼠的操作步骤（包括麻醉和消毒，见步骤1.1至1.7）进行初始外科操作。
  2. 使用剪刀切开腹部 通过 沿中线做一切口（长约2.5 cm），然后用生理盐水浸湿的纱布覆盖腹腔器官。
  3. 仔细保留肾下主动脉和下腔静脉（IVC），确保每一条大的分支血管均被电灼止血。使用电灼设备在靠近肾盂的近端位置仔细分离左侧输尿管。随后，切除左侧肾脏。
  4. 使用显微镊子和棉签暴露腹主动脉和下腔静脉，并将其从周围脂肪组织中分离（分离长度约4 mm）。
  5. 使用两个微血管夹，同时在下腔静脉和腹主动脉的近端和远端分别进行夹闭。
  6. 使用显微持针器引导一根10/0单丝缝合针（由表面光滑的合成纤维制成），从近端向远端穿过主动脉壁。
  7. 用精细的弯剪在缝针下方平直处轻轻剪开，同时轻柔上提缝线，形成一个长约1 mm的椭圆形动脉切口。
  8. 使用显微剪刀沿下腔静脉（IVC）纵向剪开，切口长度约1.5 mm。切口位置应略低于其对应的主动脉处。
  9. 以端侧吻合方式完成供体与受体主动脉的吻合。将供体肾脏置于受体下腔静脉右侧，使供体腹主动脉套管与受体腹主动脉吻合口对齐。
  10. 使用显微持针器和两条独立的10-0缝线缝合吻合口的近端和远端。
  11. 打结后，保留两根长缝线（包括针头）原位不动。从远端向近端方向，用两个间距均匀的连续缝合针缝合吻合口主动脉壁的左侧。
  12. 缝合最后一针后，将缝线穿过上方固定缝线结上方血管壁的部分厚度。
  13. 使用显微镊子同时对下部结扎线的短端施加轻柔牵引力。
    注意：在此新型无结技术中，最后一针不与上方结扎线的短端打结。
  14. 使用显微镊子将移植肾翻转至正常位置。随后，从近端至远端连续缝合主动脉吻合口的右侧壁，共缝三针。
    注意：与传统手术技术相比7,8 最后一针与邻近的远端结合并。不要将其与下方缝线的末端打结，而是剪断，留下2-3 mm的自由长度。
  15. 采用与前述相同的缝合方法进行静脉吻合，不同之处在于吻合口每侧需要缝合四到五针。最后一针留作与上方所述主动脉吻合相似长度的游离端。
  16. 完成两个吻合口后，使用干燥的棉签对缝合区域施加轻柔压力，持续约10-20秒。
  17. 使用止血钳施夹器移除两个止血钳，先移除下方的，再移除上方的。用温度为38.0 °C的0.9%氯化钠溶液冲洗腹腔。
  18. 观察移植肾的再灌注情况。

4. 输尿管植入

  1. 使用显微持针器，将10/0缝线（直针）穿过受体的膀胱壁，并插入21 G针头的内腔以提供引导（参见 补充图1a).
  2. 现在将21 G针头引导至前次穿刺位置，缝合一孔补充图1b).
  3. 拔出21 G针头补充图1c).
  4. 使用显微持针器和10/0缝线将修剪后的输尿管末端缝合（不打结），并用该10/0缝线在输尿管进入膀胱处再次穿刺膀胱壁补充图1d).
  5. 使用显微持针器通过已构建的孔道将10/0尼龙线和输尿管拖入膀胱内补充图1e).
  6. 使用显微持针器和另一根10/0缝线将供体输尿管与受体膀胱进行吻合。此处应将输尿管外膜与膀胱壁外膜相连，采用间断缝合，共缝3至4针。最后，抽出牵引缝线补充图1f).
  7. 使用镊子将肠管放回腹腔内。采用4/0缝线进行两层缝合（先缝合腹肌层，再缝合皮肤）以关闭腹部切口。
  8. 将移植后的小鼠放入具有氧气和温度控制的恢复舱中，以进行术后恢复。
  9. 术后镇痛：手术后直接给予口服安乃近 200 mg/kg。
    术后4小时和16小时，口服给予安乃近200 mg/kg，并皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）。术后连续三天，每天皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）用于移植小鼠的后续护理13若出现镇痛不足的迹象，可额外给予0.05 mg/kg的丁丙诺啡，每8小时皮下注射一次。

5. 受体小鼠的对侧肾切除及处死

注意：在移植后第5天对受体小鼠进行对侧肾切除术。

  1. 移植后第5天，在麻醉下对移植小鼠进行对侧肾切除术。结扎并切断受体自身右侧肾动静脉，摘除右侧肾脏，并关闭腹腔。术后护理和镇痛措施与之前所述相同（见步骤4.7）。
  2. 观察并记录小鼠状态。为移植小鼠提供术后镇痛、食物和饮水。
  3. 移植后4周，处死一半的移植小鼠，并对其移植肾脏进行苏木精-伊红（H&E）染色。
  4. 移植后12周，处死剩余小鼠，并对这些移植肾脏进行Masson三色染色。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

移植后4周，与受体自身的对侧原生肾脏相比，改良技术组和传统技术组均显示出中等程度的肾小管萎缩迹象14,15（图1）。两种不同技术之间的肾小管萎缩程度无显著差异。移植后12周，Masson Goldner三色染色14,15结果显示，与正常未移植肾脏相比，两组肾脏均一致表现出明显的间质组织纤维化征象（图2）。

我们先前研究了这种无结技术（n = 175）的结果，并在手术技术细节以及术中和术后并发症方面将其与传统方法（n = 122）进行了比较（另见表1）10。此处展示的改良技术与移植物内动脉或静脉血栓事件发生率较...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

尽管小鼠皮肤移植模型在研究同种免疫排斥反应时操作简单且易于实施，但针对心脏移植后更特异性地探究同种免疫相关炎症改变的手术技术16 和肾移植10 已被证实十分复杂且要求极高。从移植肾病学的角度来看，建立一种有效且长期稳定的鼠类肾移植模型，对于众多功能性和免疫学研究仍具有不可替代的意义。此外，与其他器官移植相比，即使存在主要组织相容性抗原的某些差异，小鼠肾移植模型仍可实现长期存活，这意味着有机会研究排斥反应长期发展过程中的免疫调节机制，或识别建立同种免疫耐受所需的先决条件。3.

如先前所述，小鼠肾移植是一项具有挑战性的手术，即使是经验丰富的外科医生，其手术成功率也存在较大差异，范围在40%至95%之间10,17,18,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

致谢

感谢白甜田博士团队在配音方面的帮助，感谢泡面女士在医学插图方面的协助。本工作部分得到了德国研究基金会（DFG）促进国际协作项目（HO2581/4-1，资助给AH）和中国国家自然科学基金（NSFC；#81760291，资助给FJ）的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30G针头Braun456300-
乙酰丙嗪CP PharmaTranquisol P-
贝潘登眼膏Haus-ApothekePZN 01578675-
波恩显微镊FST11083-07-
保温及供氧装置箱RUSKINNINVIV-
C57BL/6J 小鼠Charles River. Germany无目录编号-
卡洛芬ZoetisRimadyl 50 mg/ml-
CATHETER-FEP 26GTERUMOSurflo-W-
施夹钳镊FST18057-14-
弯头镊子WPI14114-G-
皮肤消毒剂 CutaseptVWRBODL980365-
脱水机DIAPATHDonatello-
电外科笔BovieCHANGE-A-TIP-
包埋机武汉俊杰电子有限公司JB-P5-
乙醇国药集团化学试剂有限公司100092683-
冷冻台武汉俊杰电子有限公司JB-L5-
纱布垫、棉签Lohmann-Rauscher13353-
载玻片ServicebioG6004-
苏木精-伊红（HE）染色液套装ServicebioG1003-
加热垫THERMO MAT PRO 30WHTP-30-
止血海绵CuraSponJ1276A-
肝素溶液Haus-ApothekePZN 03029820-
冰盒PETZ无目录编号-
成像系统NikonNikon DS-U3-
吸入式麻醉装置GROPPLERBKGM 0616-
异氟烷CP PharmaIsofluran CP 1 ml/ml-
氯胺酮Zoetis无目录编号-
马松染色液套装ServicebioG1006-
安乃近WDT无目录编号-
显微剪刀FST15000-00,15000-10-
微型止血夹（钳）斜角/16 mmFST18055-06-
显微镜LeicaLEICAMZ6-
显微镜光源SCHOTTKL2500LED-
中性树胶SCRC10004160-
烘箱天津莱博瑞仪器设备有限公司GFL-230-
病理切片机上海徕卡仪器有限公司RM2016-
生理盐水（0.9% NaCl）Haus-ApothekePZN 06178437-
剪刀Peha Instruments991083/4-
载玻片Servicebio-
小型培养皿Sarstedt8,33,900-
直头镊子WPI14113-G-
手术胶带BSN4120-
打结镊 - 10 cmFST18025-10-
缝合线（10-0）MedtronicN2540-
缝合线（4-0）ETHILONV4940H-
缝合线（7-0）ETHILON1647H-
注射器（0.3 mL）BD324826-
注射器（1 mL）BD320801-
组织牵开器浙江科华仪器有限公司KD-P-
正置光学显微镜NikonNikon Eclipse E100-
赛拉嗪BayerRompun-
二甲苯国药集团化学试剂有限公司10023418-

参考文献

  1. Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
  2. Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
  3. Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163(2014).
  4. Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
  5. Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
  6. Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
  7. Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150(2009).
  8. Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H. Murine kidney transplant technique. Journal of Visualized Experiments. (104), e52848(2015).
  9. Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
  10. Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215(2012).
  11. Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204(2020).
  12. Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318(2021).
  13. Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
  14. Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
  15. Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
  16. Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007(2021).
  17. Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
  18. Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
  19. Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
  20. Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

一种改良的小鼠肾移植外科技术
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。