一种用于高内涵筛选与分析应用的类球体大规模生产的稳健方法

摘要

本方案详细介绍了生成三种不同类型球状体的方法，这些球状体适用于大规模高内涵筛选与分析。此外，还提供了示例，展示如何在球状体水平和单个细胞水平对其进行分析。

摘要

高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）是能够使研究人员从细胞中获取大规模定量表型测量数据的技术。该方法已被证明在加深理解细胞生物学中众多基础性和应用性事件方面具有强大能力。迄今为止，该技术的大多数应用依赖于单层培养的细胞，尽管人们日益认识到此类模型无法重现组织中发生的许多相互作用和过程。因此，三维（3D）细胞聚集体（如类球体和类器官）的开发与使用正在兴起。尽管这些3D模型在癌症生物学和药物递送研究中特别有效，但以适用于HCS和HCA的可重复方式对其进行制备和分析仍面临诸多挑战。本文详细描述了一种多细胞肿瘤类球体（MCTS）的生成方法，并证明该方法可兼容地应用于三种不同的细胞系。该方法可在每个孔中生成数百个类球体，其独特优势在于：在筛选实验中，每个孔可获得来自数百个结构的数据，且所有结构均接受完全相同的处理。本文还提供了示例，详细说明如何对类球体进行高分辨率荧光成像处理，以及HCA如何在类球体整体水平和每个类球体内的单个细胞水平上提取定量特征。该方案可轻松应用于解答细胞生物学中广泛的重要科学问题。

引言

传统上，基于细胞的实验是在固体基质上生长的单层细胞中进行的，这种环境可有效地被视为二维（2D）环境。然而，人们日益认识到，在某些情况下，2D细胞培养模型缺乏生理相关性，无法复制细胞间发生的许多复杂相互作用¹。三维（3D）细胞培养技术正迅速受到研究人员的青睐，3D细胞模型在更好地模拟细胞在组织环境中所经历的生理条件方面展现出巨大潜力²。目前已采用多种不同类型的3D细胞结构，其中最常见的两种是球状体（spheroids）和类器官（organoids）。球状体可由多种不同的细胞系培养而成，其形状和大小因所用细胞类型及组装方法的不同而有所差异³。此外，当球状体由癌细胞系培养而成时，也可称为多细胞肿瘤球体（MCTS），这类模型在临床前体外（in vitro）药物递送和毒性研究中具有特殊应用价值^4,5。类器官则旨在更真实地模拟人体内的组织和器官，能够形成更为复杂的形态结构。类器官的制备依赖于成体干细胞或诱导多能干细胞，这些干细胞可被重编程为特定类型的细胞，以模拟目标组织或器官。类器官主要用于研究器官发育过程，以及疾病建模和宿主-病原体相互作用的研究⁶。

目前有多种不....

方案

1. 细胞培养

1. 准备培养基
   1. 根据细胞系的类型准备特定的细胞培养基。确保所有用于细胞维持的培养基均含有10%胎牛血清（FBS）。
      注意：不同细胞系使用不同的培养基。HT-29结肠癌细胞（ATCC HTB-38）在McCoys 5A培养基中培养，含10% FBS。HepG2肝细胞癌细胞（ATCC HB-8065）在最低必需培养基（Minimum Essential Medium）中培养，含1% L-谷氨酰胺和10% FBS。H358支气管肺泡癌细胞（ATCC CRL-5807）在RPMI 1640培养基中培养，含1% L-谷氨酰胺和10% FBS。所有含有L-谷氨酰胺和FBS的培养基均称为完全培养基。当接种细胞以形成球状体时，需使用不含酚红的培养基并添加10% FBS，以避免对细胞外基质（ECM）基底材料产生染色，从而防止成像过程中出现伪影。
2. 传代培养细胞
   1. 当细胞融合度约为80%时，用2 mL胰蛋白酶-EDTA（0.25% (w/v) 胰蛋白酶/0.53 mM EDTA）短暂洗涤。吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，加入3 mL新鲜胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37 °C下孵育3–5分钟。
   2. 当细胞从培养皿表面脱落时，加入7 mL新鲜完全培养基。
   3. 将1 mL细胞悬液转移至新的10 cm细胞培养皿中，并加入9 mL新鲜完全培养基，使细胞稀....

结果

本方案详细描述了一种利用不同细胞类型构建三维细胞培养球体（spheroid）以模拟多种肿瘤组织的稳健方法。该方法可在每个孔中生成数百个球体，从而实现以高内涵方式开展基于细胞的检测（图1）。此前，该方法已被用于研究纳米颗粒在HT-29球体中的摄取¹⁶以及纳米颗粒对HepG2球体的毒性作用¹⁷。该方法的关键在于将支架材料均匀且薄层地分布在光学质量培养板的孔底。将细胞接种至各孔后，再在细胞上覆盖一层低浓度的支架材料。由此形成的基底可支持球体均匀生长，使得在96孔板的每个孔中均可培养出数百个球体。使用低倍物镜可获取整个细胞群体的概览图像（图2）。随后可选择孔内特定区域，利用高分辨率物镜进行成像，并在每个位置采集完整的共聚焦图像层叠（confocal stack）。这些数据为后续对每个球体进行体积分析提供了必要信息。

随后可利用高内涵分析（HCA）对各个类球体进行分析，从而获得有.......

讨论

本文所述方法提供了一个平台，可在单个孔中生成数百个类球体，适用于高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）。与其他常用方法（如使用平底或圆底超低吸附（ULA）培养板，这些方法通常每孔仅能形成一个类球体^18,19）相比，该方法能够在筛选模式下从大量类球体中获取高分辨率信息。值得注意的是，该方法已在3种不同的细胞系中得到验证，代表了多种肿瘤类型，表明其在不同模型中研究多种细胞过程的广泛适用性。尽管使用该方法生成的类球体在大小和形状上存在一定异质性，但高内涵分析可轻松按尺寸（或其他感兴趣参数）对其进行分类。本实验室已成功应用该方法研究纳米颗粒诱导的毒性与类球体尺寸之间的关系。重要的是，所有不同尺寸类别的类球体均可在同一孔中进行研究，意味着它们经历了完全相同的处理条件，从而从大量类球体群体中获得高度稳健的实验结果¹⁷。本文描述的方法可轻松适配于代表不同组织类型的其他细胞类型。此外，此类类球体还可用于评估多种生物学过程¹⁴。若类球体由稳.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红	Gibco	25300054
牛血清白蛋白 (BSA)	Sigma Aldrich	A6003
氯化钙	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra 微孔板，组织培养处理，黑色，96 孔带盖	Perkin Elmer	6055302	这些孔板已更名为 Phenoplates
二甲基亚砜 (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
胎牛血清 (FBS)，经鉴定合格，欧盟批准，南美来源，热灭活	Gibco	10500064
甘氨酸	Fisher Scientific	BP381-1
山羊抗小鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488 标记	Invitrogen	A-11029
L-谷氨酰胺溶液，200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
氯化镁	Fisher Scientific	10647032
Matrigel 基底膜基质，无酚红，无LDEV，10 mL	Corning	356237	该 Matrigel 配方在 BD Biosciences 也可使用相同目录号获得
生长因子减少型 Matrigel	BD Biosciences	356231	该 Matrigel 配方在 Corning 也可使用相同目录号获得
McCoy's 5A 培养基	Gibco	26600023
McCoy's 5A 培养基，含 L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，无酚红	Hyclone	10358633
最低必需培养基 (MEM)	Gibco	21090022
最低必需培养基 (MEM)，不含谷氨酰胺，不含酚红	Gibco	51200046
小鼠单克隆抗 LAMP1 抗体（浓缩液）	Developmental Studies Hybridoma Bank	H4A3-a
Neubauer 血细胞计数板	Hirschmann	8100203
Nunclon 组织培养皿带盖，聚苯乙烯材质，92 mm × 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phenix 高内涵筛选系统及 Harmony 高内涵分析软件	Perkin Elmer	HCSHH14000000
多聚甲醛 (PFA)	Sigma Aldrich	P6148
鬼笔环肽 Alexa Fluor 568 标记	Invitrogen	A12380
磷酸盐缓冲液 (PBS) 片剂	Sigma Aldrich	P4417
聚山梨酯 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物	Gibco	61870010
RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺，不含酚红	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup 无菌真空滤器装置	Millipore	SCGVU05RE