用于高内涵筛选和分析应用的大规模生产球体的稳健方法

摘要

该协议详细介绍了生产三种不同类型的球体的方法，使其适用于大规模高内涵筛选和分析。此外，还提供了示例，展示了如何在球体和单个细胞水平上分析它们。

摘要

高内涵筛选（HCS）和高内涵分析（HCA）是使研究人员能够从细胞中提取大规模定量表型测量的技术。这种方法已被证明对于加深我们对细胞生物学中广泛的基本和应用事件的理解是强大的。迄今为止，该技术的大多数应用都依赖于使用单层生长的细胞，尽管人们越来越意识到这些模型并不能概括组织中发生的许多相互作用和过程。因此，在开发和使用3维（3D）细胞组件（例如球体和类器官）方面出现了。尽管这些3D模型在癌症生物学和药物递送研究的背景下特别强大，但它们以适用于HCS和HCA的可重复方式进行生产和分析，带来了许多挑战。这里详述的方案描述了一种产生多细胞肿瘤球体（MCTS）的方法，并证明它可以以与HCS和HCA兼容的方式应用于三种不同的细胞系。该方法有助于每孔产生数百个球体，提供了特定的优点，即当用于筛选制度时，可以从每孔数百个结构中获得数据，所有这些都以相同的方式处理。还提供了示例，其中详细介绍了如何处理球体以进行高分辨率荧光成像，以及HCA如何在球体水平以及从每个球体内的单个细胞中提取定量特征。该协议可以很容易地应用于回答细胞生物学中的各种重要问题。

引言

传统上，基于细胞的测定是在固体底物上生长的单层中进行的，这实际上可以被认为是二维（2D）环境。然而，人们越来越认识到，2D细胞培养模型在某些情况下缺乏生理相关性，无法复制细胞之间发生的许多复杂相互作用¹。三维（3D）细胞培养方法在研究人员中迅速流行，3D细胞模型显示出更好地模拟细胞在组织环境中遇到的生理条件的巨大潜力²。已经使用了几种不同类型的3D细胞组件，但最常见的两种类型是球体和类器官。球状体可以从许多不同的细胞系中生长，它们可以根据所使用的细胞类型及其组装方法采用各种形状和大小³。此外，当球状体从癌细胞系生长时，它们也可以被称为多细胞肿瘤球体（MCTS），这些模型已经发现特别适用于临床前 体外 药物递送和毒性研究^4，5。另一方面，类器官旨在更好地模仿我们体内的组织和器官，并且可以采用更复杂的形态安排。类器官的产生涉及使用成体干细胞或多能干细胞，它们可以重新编程到适当的细胞中以类似于感兴趣的组织或器官。它们主要用于研究器官的发育，并对疾病和宿主-病原体相互作用进行建模⁶。

有一系列不同的方法可用于生成 3D 单元组件。基于支架的方法提供了一种底物或支撑物，细胞可以附着或生长在其内。这些脚手架可以有各种形状，可以由各种不同的材料制成。最常见的是细胞外基质（ECM）成分和水凝胶，它们被设计成类似于细胞的天然细胞外环境，从而促进生理相互作用^4，7。ECM基底材料已从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤肿瘤中提取，并显示含有丰富的ECM成分混合物，包括层粘连蛋白，IV型胶原蛋白和^perlecan8。然而，尽管其成分有利，但其使用存在两个主要挑战，即其批次间变异性，以及它在10°^C8，9以下和上方具有两种不同的聚集状态。相比之下，水凝胶在组件和刚度方面具有柔韧性的优势，并且可以定制以适应所需的特定3D细胞组件^7，10。基于支架的方法对于类器官生长至关重要，但也广泛用于球体。无支架方法通过防止细胞附着在它们生长的表面上起作用，通常只与球体组装兼容。例子包括超低附着（ULA）板，具有平底或U形底，允许细胞聚集成球状体，或使用旋转瓶中细胞的连续搅拌¹⁰。

使用3D细胞组件来研究各种生物事件正在迅速普及;然而，为他们的养殖选择的方法必须适当，并且与下游分析计划兼容。例如，使用ULA板可产生高稠度的球体;然而，这种方法仅限于生产每孔的单个球体，从而限制了通量。在计划对3D结构进行荧光成像时，需要特别考虑。生长组件的基板或板需要具有光学相容性，并且必须注意将可能使用的任何支架引起的光散射的影响降至最低¹¹。随着显微镜物镜的数值孔径增加，这一特殊问题变得更加尖锐。

可以说，选择使用3D细胞模型的主要原因之一是提取不仅关于整个组件的体积成像数据，还提取其中单个细胞的体积成像数据。特别是MCTS模型，对于加深我们对治疗药物如何从外部传递到中心细胞（就像它们在肿瘤中需要的那样）的理解方面开始变得非常强大¹²，因此从不同层的单个细胞中获得知识至关重要。从单个细胞中提取定量信息的成像技术被称为高内涵分析（HCA），是筛选环境中的一种强大方法¹³。迄今为止，HCA几乎只应用于单层培养物，但人们越来越意识到这种方法具有应用于3D培养物的能力，从而能够研究广泛的细胞功能和过程¹⁴。它具有明显的优势，可以分析大量的3D组件，从而可能从每个结构中提供单元级数据。然而，需要克服与潜在厚细胞组件的成像以及生成的大型数据集相关的挑战。

本文介绍了一种基于支架的稳健方法，用于大规模生产96孔格式的MCTS。该方法有助于在每个孔中生产数百个3D单元组件。显示了三种不同细胞类型的示例，代表肝脏，肺和结肠的实体瘤模型。形成的球体可以是各种大小，因此HCA用于选择特定大小和/或形态的结构。这一特征提供了额外的优势，即观察到的任何表型都可以在不同大小的球体之间进行比较，但在同一孔中以相同的方式处理。这种方法与高分辨率成像兼容，重要的是提供来自相同细胞组件的细胞水平和亚细胞水平的定量数据。与每孔产生单个球体的方法相比，这种球体生产方法具有额外的优势，即每个孔中产生的大量球体可能为其他下游分析（如转录组和蛋白质组分析）提供足够的生物量。

方案

1. 细胞培养

1. 准备介质
   1. 根据细胞系的类型制备特定的细胞培养基。确保所有用于细胞维护的培养基都含有10%的胎儿牛血清（FBS）。
      注意:不同的细胞系使用不同的培养基。HT-29结肠癌细胞（ATCC HTB-38）在McCoys 5A + 10%FBS中生长。HepG2肝细胞癌细胞（ATCC HB-8065）在最低必需培养基+ 1%L-谷氨酰胺+ 10%FBS中生长。H358支气管肺泡癌细胞（ATCC CRL-5807）在RPMI 1640培养基+ 1%L-谷氨酰胺+ 10%FBS中生长。所有含有 L-谷氨酰胺和 FBS 的介质均称为完整培养基。当电镀细胞作为球体生长时，需要具有10%FBS的无酚红培养基以避免ECM基底材料的着色，这反过来又会在成像过程中引起伪影。
2. 传代培养细胞
   1. 当细胞汇合约80%时，用2mL胰蛋白酶-EDTA（0.25%（w / v）胰蛋白酶/ 0.53mM EDTA）短暂洗涤。吸出胰蛋白酶-EDTA，加入3mL新鲜胰蛋白酶-EDTA，并在37°C下孵育3-5分钟。
   2. 当细胞从细胞培养皿中分离时，加入7mL新鲜完全培养基。
   3. 将1mL细胞悬浮液移入新的10cm细胞培养皿中，并加入9mL新鲜完整培养基，得到1:10稀释的细胞。
   4. 在37°C下用5%CO ₂的加湿培养箱培养细胞。
   5. 每3-5天传代培养细胞，具体取决于细胞系。

2. 旋转椭球体的生成

1. 用 ECM 基底材料涂覆 96 孔板
   1. 在冰上解冻ECM基底材料过夜。
   2. 使用保持-20°C的预冷尖端在冷酚无血清培养基中稀释ECM基底材料。
      注意:ECM基底材料的最终浓度取决于所使用的细胞系。对于HT-29和H358细胞，使用4mg·^mL-1 的ECM基底材料。对于HepG2细胞，使用4mg·^mL-1 的还原生长因子ECM基底材料。
   3. 将15μL ECM基底材料/培养基溶液移液到96孔成像板中。
      注意:对于大规模球体生产，只要冷却含有ECM基底材料的吸头和储液槽，就可以使用8通道移液器和96通道移液头执行此步骤。
   4. 在4°C下以91× g 离心板20分钟。
   5. 将板在37°C下孵育不超过30分钟。
2. 细胞传代和计数
   1. 在平板孵育期间，用胰蛋白酶-EDTA孵育细胞，并将它们重悬于含有10%FBS的完整培养基中。
   2. 将10μL细胞悬浮液移入血细胞计数器计数室。计算腔室4个象限中的细胞数量。
   3. 通过确定4个象限内的平均细胞数来计算细胞悬浮液中的细胞数。
      注意:细胞也可以使用自动细胞计数设备进行计数。
   4. 在室温（RT）下以135× g 离心细胞4分钟。
   5. 一旦细胞沉淀，吸出上清液并将细胞重悬于无酚红的完整培养基中，以获得每mL1×10 ⁶ 个细胞的浓度。
3. 将细胞种子到ECM基底材料包被板中
   1. 在无酚红的完全培养基中稀释细胞。
      注意:接种细胞的密度取决于所使用的细胞系。对于HT-29和HepG2细胞，每孔接种3 x 10 ⁴ 个细胞;对于H358细胞，每孔接种4 x 10 ⁴ 个细胞。
   2. 将细胞接种到每孔35μL的总体积中。确保以圆周运动的方式逐滴添加它们。
      注意:对于大规模球体生产，只要可以实现移液圆周运动，就可以使用8通道移液器执行此步骤。
   3. 将细胞在37°C下在具有5%CO 2的加湿培养箱中孵育1_小时。
   4. 在无酚红完全培养基中制备ECM基底材料的溶液，从而在井中产生最终浓度为2%的ECM基底材料。为此，将1.2μL ECM基底材料加入每孔23.8μL无酚红完整培养基中，最终体积为每孔60μL。
   5. 将细胞在37°C下孵育在具有5%CO ₂的加湿培养箱中。
   6. 第二天，用100μL新鲜苯酚无红完整培养基代替培养基。
   7. 每隔一天用100μL新鲜无酚红完全培养基替换培养基。

3. 球体的免疫荧光染色

注:本议定书改编自纽伦堡等人，²⁰²⁰¹⁵年。这些适应性主要基于这样一个事实，即该协议中描述的球体比纽伦堡等人工作中使用的球体小¹⁵ ，因此有助于缩短孵育时间。例如，阻断时间从 2 小时减少到 1 小时。此外，由于该协议是为高通量生产球体而设计的，因此所有加工步骤都在培养球体的孔中进行，这意味着不需要将单个球体转移到管中。

1. 准备固定和染色所需的所有溶液和缓冲液
   1. 通过每200毫升水加入1 PBS片剂来制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）。高压灭菌PBS。
   2. 制备多聚甲醛（PFA）的步骤3.1.3-3.1.4。
   3. 使用加热的搅拌器在通风橱中将400 mL PBS加热至60-70°C。搅拌时加入15克PFA。一旦PFA溶解，加入50μL1M _CaCl2 和50μL1M _MgCl2。
   4. 加入 100 mL PBS，制成最终体积为 500 mL。使用NaOH将PFA平衡至pH值7.4。通过无菌真空过滤器（孔径0.22μm）过滤PFA，等分试样，并储存在-20°C。
   5. 通过将3.75g甘氨酸加入50mL PBS来制备1M甘氨酸储备溶液。储存在4°C。
   6. 通过加入100μLTriton X-100，1mL二甲基亚砜（DMSO）和1.5mL1M甘氨酸至2.4mLPBS来制备5 mL渗透缓冲液。在4°C下储存不超过2周。
   7. 通过向4.9 mL PBS中加入100μLTriton X-100，0.5mLDMSO和0.05g牛血清白蛋白（BSA）来制备5 mL封闭缓冲液。将封闭缓冲液等分到1.5mL管中并储存在-20°C。
   8. 通过加入10μL聚山梨醇酯20，0.05g BSA和250μLDMSO至4.74mLPBS来制备5mL抗体孵育缓冲液。将抗体孵育缓冲液等分到1.5mL管中，并将其储存在-20°C。
      注意:在这里描述的协议中，球体仅组装在96孔板的内部60孔中，尽管它们可以在板的所有96孔中制备。仅在内部60孔中制备旋转椭球体的原因是，由于某些板型上的"裙边"，一些高数值孔径物镜无法对外孔的整个孔进行物理成像。上述体积足以制备60个含有球体的孔。
2. 固定和透化球体
   1. 小心地从球体中取出介质，确保ECM基底材料层不受干扰。
   2. 用70μLPBS洗涤球体两次，每次3分钟。
   3. 在37°C下用70μL3%PFA固定球体1小时。
   4. 用70μLPBS洗涤球体两次，每次3分钟。
   5. 在37°C下用70μL0.5M甘氨酸溶液淬灭30分钟。
   6. 在室温下使用70μL通透性缓冲液使球体通透30分钟。
   7. 用70μLPBS洗涤球体两次，每次3分钟。
   8. 将球体在70μL封闭缓冲液中孵育37°C下1小时。
      注:一旦球体固定，所有后续处理步骤都可以使用8通道移液器或96孔移液头（如果可用）进行。这提高了成像前球体制备的速度。
3. 使用一抗和二抗对球体进行免疫染色
   1. 将一抗稀释至抗体培养液中的适当稀释液，并向每个孔中加入70μL。将球体与一抗孵育过夜。
      注意:稀释度取决于所使用的特异性抗体。在这里显示的示例中，使用1:500的稀释液用小鼠抗LAMP1抗体对溶酶体进行免疫染色。
   2. 第二天，用70μLPBS洗涤球体5次，每次3分钟。
   3. 在抗体孵育缓冲液中以1:500稀释二抗，在1:500下稀释荧光偶联的鬼臼素，以1:5000稀释Hoechst 33342（来自1mg ^mL-1 储备液），并向每个孔中加入70μL。孵育过夜。
      注意:抗体稀释度取决于所使用的特异性抗体。建议使用具有高光稳定性和高亮度的高度交叉吸附二抗。
   4. 第二天，用70μLPBS洗涤球体5次，每次3分钟。
      注意:在成像之前，只要球体保持PBS覆盖，板可以在RT下储存长达两周。

4. 椭球体的图像采集和分析

1. 图像采集
   1. 将含有球体的96孔板插入共聚焦高内涵筛选显微镜中。
   2. 选择合适的激光器来激发所使用的荧光团。
   3. 按顺序获取通道以避免串扰。
   4. 使用适当的物镜对旋转椭球体进行成像。
      注:如果有的话，建议使用水浸式物镜。例如，20x/1.0 NA物镜可以在约77个视场中对整个井进行成像。63x/1.15 NA物镜可以在大约826个视场中对整个井进行成像。
   5. 图像~30-40个切片，取决于球体的深度，每个切片以1.5μm的间隔拍摄。
2. 图像分析
   1. 对于旋转椭球体的形态学分析，请遵循步骤 4.2.2-4.2.6。
   2. 根据荧光共轭的染色对球体进行分割。
   3. 根据Hoechst 33342染色对细胞核进行分段。
   4. 通过细胞质中存在的残留Hoechst 33342染色剂分割每个细胞的细胞质。
   5. 计算球体的不同形态特性，包括体积、表面积、球形度和每个球体的原子核数。
      注意:此信息是使用所选图像分析软件中内置的各种算法提取的。
   6. 进一步处理图像以去除小于 75，000 ^μm3 且大于 900，000 ^μm3 的球体。
      注意:这些值是允许移除非常小的细胞组件和可能由于多个球体融合而产生的大型组件的建议。在此步骤中，旋转椭球体也可以分为不同的大小类别。
   7. 要分析球体中的单个细胞，请按照步骤4.2.8-4.2.12进行操作。
   8. 根据荧光共轭的染色对球体进行分割。
   9. 根据Hoechst 33342染色对细胞核进行分段。
   10. 通过细胞质中存在的残留Hoechst 33342染色剂分割每个细胞的细胞质。
   11. 根据二抗染色对溶酶体进行分段。
   12. 计算每个球体内细胞的不同形态学性质，包括每个细胞的溶酶体数量，细胞体积和细胞表面积。
       注意:此信息是使用所选图像分析软件中内置的各种算法提取的。

结果

在该协议中，详细介绍了一种以球体形式产生3D细胞培养组件的可靠方法，使用不同的细胞类型来表示各种肿瘤组织。该方法允许每孔产生数百个球体，这使得基于细胞的测定能够以高内涵的方式进行（图1）。这种方法以前已被用于研究HT-29球体¹⁶ 中的纳米颗粒摄取和HepG2球体中纳米颗粒诱导的毒性¹⁷。该方法依赖于在光学质量板的孔底部产生薄而均匀的支架材料分布。将细胞接种到每个孔中，并以低浓度添加进一步的支架材料作为细胞上的覆盖层。这导致一个支持球体均匀生长的碱基，这意味着可以在96孔板的每个孔中培养数百个球体。低倍率物镜用于生成整个总体的概览图像（图2）。然后可以使用高分辨率物镜选择和成像孔的子区域，并在每个位置获得完整的共聚焦堆栈。这为随后对每个球体进行体积分析提供了必要的信息。

然后可以通过HCA分析单个球体，从而提供有关球体形态特性的信息。通常，第一步是将每个旋转椭球体标识为...

讨论

这里描述的方法详细介绍了一个平台，该平台以适合HCS和HCA的方式每孔产生数百个球体。与其他流行的方法相比，例如使用平底和圆底ULA板，这些板允许每个孔仅形成一个旋转椭球体^18，19，这种方法为以筛选格式从大量球体中提取高分辨率信息提供了机会。值得注意的是，这种方法已经在3种不同的细胞系中得到证明，代表了各种肿瘤类型，突出了它对研究不同模型中的一系列细胞过程的广泛适用性。尽管使用此方法生成的球体在大小和形状上显示出一些可变性，但HCA可以很容易地按大小（或任何其他感兴趣的参数）对它们进行分类。我们的实验室已经成功地使用这种方法来研究纳米颗粒诱导的毒性作为球体大小的函数。重要的是，所有不同大小的球体类别都可以在同一口井中进行研究，这意味着所有球体都暴露于相同的处理中，从而从大型球体群体中提供高度稳健的输出¹⁷。这里描述的方法可以很容易地适应用于代表不同组织的其他细胞类型。此外，这种球体可用于评估不同的生物过程¹⁴。如果球状体是由...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA （1x），酚红	Gibco	25300054
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma Aldrich	A6003
氯化钙	Fisher Scientific	10050070
CellCarrier-96 Ultra 微孔板，组织培养处理，黑色，带盖 96 孔	Perkin Elmer	6055302	这些板已重命名为 Phenoplates
二甲基亚砜 （DMSO）	Sigma Aldrich	D2650
胎牛血清 （FBS），合格，欧盟批准，南美洲原产地，热灭活	Gibco	10500064
甘氨酸	Fisher Scientific	BP381-1
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-谷氨酰胺溶液，200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
氯化镁	Fisher Scientific	10647032
胶基底膜基质，不含酚红，不含 LDEV，10 mL	康宁	356237	这种基质胶制剂也可以在 BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced 中找到具有相同目录号的Matrigel	BD Biosciences	356231	这种 Matrigel 配方也可以在康宁
McCoy 的 5A 培养基	Gibco	26600023
McCoy's 5A 培养基中找到相同的目录号，其中含有 L 谷氨酰胺和碳酸氢钠，不含酚红	Hyclone	10358633
最低必需培养基 （MEM）	Gibco	21090022
最低必需培养基 （MEM），不含谷氨酰胺，不含酚红	Gibco	51200046
小鼠单克隆抗 LAMP1 抗体（浓缩物）	发育研究 杂交瘤细胞库	H4A3-a
Neubauer 计数室	Hirschmann	8100203
带盖 Nunclon 组织培养皿，聚苯乙烯，92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phenix HCS 系统和 Harmony HCA 软件	Perkin Elmer	HCSHH14000000
多聚甲醛 （PFA）	Sigma Aldrich	P6148
鬼笔环肽 Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 片	Sigma Aldrich	P4417
聚山梨醇酯 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 培养基，GlutaMAX 添加剂	Gibco	61870010
RPMI 1640 培养基，不含谷氨酰胺，不含酚红	Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup 无菌真空过滤装置	Millipore	SCGVU05RE