需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

可重复使用的单细胞用于迭代表观基因组分析

1.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63456

⸱

2022年2月11日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用可重复使用的单个细胞进行多轮表观基因组分析的单细胞方法。这种可重复使用的单个细胞允许在同一个单细胞中分析多种表观遗传标记，并对结果进行统计学验证。

摘要

目前的单细胞表观基因组分析设计为一次性使用。细胞在单次使用后即被丢弃，无法在同一个细胞中分析多个表观遗传标记，且需要依赖其他细胞的数据来区分单个细胞中的信号与实验背景噪声。本文描述了一种可对同一个个细胞进行多次表观基因组分析的重复使用方法。

在该实验方法中，首先将细胞蛋白锚定在聚丙烯酰胺聚合物上，而非将其交联至蛋白和DNA上，从而减轻了结构偏差。这一关键步骤使得对同一个单细胞可进行多次重复实验。接着，将带有邻近连接接头序列的随机引物退火至基因组DNA，并利用DNA聚合酶通过延伸反应将基因组序列添加至引物上。随后，在同一个单细胞中，分别用携带不同DNA探针标记的针对表观遗传标记物的抗体和对照IgG抗体结合各自的靶标。

通过添加一段连接DNA，使其与随机引物的支架序列以及抗体-DNA探针互补，从而诱导随机引物与抗体之间的邻近连接。该方法将抗体信息与邻近的基因组序列整合到单一的邻近连接DNA产物中。通过允许对同一个单细胞进行重复实验，此方法可提高稀有细胞的数据密度，并仅利用同一细胞内的IgG和抗体数据进行统计分析。采用该方法制备的可重复使用单细胞可保存至少数月，并可在后续重新使用，以拓展表观遗传学特征分析并提高数据密度。该方法为研究人员及其研究项目提供了灵活性。

引言

单细胞技术正在进入单细胞多组学时代，该时代整合了多种独立的单细胞组学技术1。近年来，单细胞转录组学已与检测染色质可及性（scNMT-seq2 和 SHARE-seq3）或组蛋白修饰（Paired-seq4 和 Paired-Tag5）的方法相结合。最近，单细胞转录组学和蛋白质组学进一步与染色质可及性检测实现了整合（DOGMA-seq6）。这些方法均采用基于转座酶的标记技术来检测染色质可及性或组蛋白修饰。

基于转座酶的方法可切割基因组DNA，并在基因组DNA片段末端添加DNA条形码。每个被切割的基因组片段最多只能连接两个DNA条形码（即每个切割位点对应一个表观遗传标记），且切割位点处的基因组DNA会丢失。因此，基于切割的方法在检测的表观遗传标记数量与信号密度之间存在权衡。这限制了在同一单细胞中对多个表观遗传标记的分析。为克服这一问题，已开发出一种不切割基因组DNA的单细胞表观基因组学方法7,8。

除了上述由切割引起的问 题之外，基于转座酶的方法还存在其他局限性。在单细胞表观基因组分析中，明确组蛋白及DNA相关蛋白在基因组上的位置至关重要。目前的方法依赖于未固定的单细胞，并保留蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用来实现这一目标。然而，这种方法即使在分析组蛋白修饰时，也会对染色质的可及区域产生强烈偏好性9。利用聚丙烯酰胺支架，可以在无需交联蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用的情况下，保留组蛋白及基因组相关蛋白在基因组上的位置7,8。该方法可减少当前依赖蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用的方法中存在的结构偏好性。

基于转座酶的方法只能从单个细胞中获取一次信号，因此由于信号的丢失，很难描绘出单个细胞完整的表观基因组。为克服当前的局限性，已开发出可重复使用的单细胞，能够在同一个单细胞中进行迭代的表观基因组分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

注意：该方法的示意图见图1。

显示丙烯酰胺修饰、聚合酶和连接步骤的聚合与DNA处理示意图。
图1：实验方案流程的示意图。 步骤7.2–13通过示意图进行说明。每一行代表方案中的一个步骤。以绿色显示的细胞蛋白是基于晶体结构（PDB: 6M4G）生成的人类核小体。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 脱盐柱的平衡

注意：脱盐离心柱按以下步骤进行平衡。平衡后的脱盐离心柱用于步骤 2.1、3.4 和 4.6 中。

  1. 取下脱盐柱（截留分子量 7 kDa，树脂珠体积 0.5 mL，参见材料表）底部的封闭端，并松开脱盐柱顶部的盖子。
  2. 将脱盐柱置于一个 1.5 mL 蛋白低吸附离心管（收集管，参见材料表）中，在室温下以 1,500 × g 离心 1 分钟，以去除柱内保存液。
    注意：使用水平转子离心机以使树脂床表面平整。
  3. 弃去 1.5 mL 收集管中的流出液，并在树脂床上方加入 300 µL 的 150 mM NaCl/100 mM 磷酸盐缓冲液（pH 8.0，参见表 1）。
  4. 在室温下以 1,500 × g 离心 1 分钟，然后弃去收集管中的流出液。
  5. 重复步骤 1.3–1.4 额外三次。
  6. 弃去收集管中的缓冲液，并将脱盐柱转移至一个新的收集管中。
  7. 在步骤 2.1、3.4 和 4.4 中使用已平衡的脱盐柱。

2. 抗体的缓冲液置换

注意：从抗 H3K27ac10、抗 H3K27me310、抗 Med111 和抗 Pol II10 中去除甘油、精氨酸和叠氮化钠（参见表1中所示的缓冲液组成）。所有后续操作均在洁净罩内进行，以避免 DNase 污染。时间：1 h

  1. 将抗体溶液（100 µL，参见表2）加入已平衡的脱盐柱中，脱盐柱按步骤1制备。
  2. 在4 °C条件下以1,500 × g离心2分钟，将收集管中的流穿液转移至1.5 mL低吸附蛋白管中。
  3. 使用280 nm处的吸光度测量IgG浓度12（使用微量分光光度计）。
  4. 将抗体溶液转移至超滤离心管（分子量截留值100 kDa，0.5 mL，参见材料表），在4 °C条件下以12,000 × g离心5分钟。
  5. 使用280 nm处的吸光度测定IgG浓度。
  6. 重复步骤2.4–2.5，直至IgG浓度达到1 mg/mL。

3. 抗体活化

注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免DNase污染。时间：2.5 h

  1. 将1 mg琥珀酰亚胺-6-肼基烟酸丙酮腙（S-HyNic，参见材料表）溶于100 µL无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF，参见材料表）中。
    注意：DMF为易燃有机溶剂，且为可通过皮肤吸收的强效肝毒素。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服。请遵循所在机构的安全操作规范，并根据机构规定妥善处理使用过的实验器材。
  2. 向100 µL抗体溶液（1 mg/mL，溶于150 mM NaCl/100 mM磷酸钠，pH 8.0）中加入0.6 µL S-HyNic/DMF溶液。所用抗体及对照IgG详见表2。
  3. 室温避光孵育2小时。
  4. 将100 µL经S-HyNic反应的抗体加至已平衡的脱盐柱顶部（参见步骤1），于4 °C以1,500 × g离心2分钟，收集样品。
  5. 使用后丢弃脱盐柱。
    注意：HyNic基团在蛋白质及其他生物分子上的稳定性存在差异，建议立即进行HyNic修饰生物分子的偶联反应。

4. DNA探针的活化

注意：以下操作需在洁净工作台内进行，以避免 DNase 污染。时间：2.5 小时

  1. 将抗体或对照IgG的胺基修饰DNA探针（抗体探针，表3）用20 µL含150 mM NaCl/100 mM磷酸钠的缓冲液（pH 8.0）溶解。
    注意：观察管底是否存在薄而透明的颗粒/薄膜。直接将缓冲液加至颗粒上。若未见颗粒，可能已脱落并附着于管壁或管盖。此时应离心管体，并检查管底是否有颗粒。
  2. 将1 mg琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酸酯（S-4FB，参见材料表）溶于50 µL无水DMF中，并向已溶解的抗体探针中加入10 µL DMF。
  3. 加入4 µL步骤4.2中制备的S-4FB/DMF溶液，混匀后室温避光孵育2小时。
  4. 将34 µL经S-4FB反应后的抗体探针加至已平衡的脱盐柱顶部（参见步骤1）。
  5. 待样品完全吸收后，向凝胶床顶部加入15 µL含150 mM NaCl/100 mM磷酸钠的缓冲液（pH 8.0），在4 °C下以1,500 × g离心2分钟，收集经S-4FB修饰的抗体探针。
  6. 将流出液用于后续偶联反应；测定260 nm处的吸光度；并计算抗体探针的回收率。

5. S-HyNic 修饰抗体与 S-4FB 修饰抗体探针的偶联

注意：以下操作需在洁净工作台内进行，以避免DNase污染。时间：2 h

  1. 将S-HyNic修饰的抗体与S-4FB修饰的抗体探针混合，并用移液器反复吹打以充分混匀。
  2. 室温孵育2小时（避光）。
  3. 为终止反应，加入478.8 µL的淬灭与储存溶液（见表1）。
  4. 将抗体探针偶联的抗体溶液转移至超滤离心管（分子量截留值为100 kDa）。
  5. 在12,000 × g、4 °C条件下离心5分钟。
  6. 用移液器吸取管内溶液，检测其体积。
  7. 重复步骤5.5–5.6，直至溶液体积浓缩至100 µL，随后于-20 °C保存。
    注意：IgG浓度采用夹心ELISA13,14,15测定，标准品为IgG。

6. 核磁珠的制备

注意：在此方法中，单个细胞被包埋于双层丙烯酰胺微球中（见图2）。核心为磁性聚丙烯酰胺微球，外层仅为聚丙烯酰胺。本节制备核心磁性微球。本节并非实验所必需。时间：3 h

磁珠包封：沉淀物试管及细胞在聚丙烯酰胺层中的示意图。
图2：REpi-seq 实验中用于提高可视性与操作便利性的双层聚丙烯酰胺磁珠结构。（A）第6.6步离心后的磁性纳米颗粒。这些磁性纳米颗粒经单体丙烯酰胺修饰后，被整合入如B所示的聚丙烯酰胺磁珠中。（B）带有聚丙烯酰胺磁珠的可重复使用单细胞示意图。请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 将 50 µL 的 1 M 碳酸氢钠缓冲液（pH 8.5）与 450 µL 的 40% 丙烯酰胺溶液混合。
    注意：丙烯酰胺为神经毒素。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服。请遵循机构安全指南。使用后的实验器具应按照机构规定进行废弃处理。
  2. 将 1 g 的 NHS 酯功能化的 30 nm 氧化铁粉末（见材料表）悬浮于丙烯酰胺/碳酸氢钠缓冲液中，于 4 °C 下孵育过夜。
    注意：由于丙烯酰胺微珠透明，可能难以观察和操控其位置。加入氧化铁核心微珠可提高可见性，并可通过磁铁控制微珠位置，从而便于操作。然而，若使用者已熟悉 REpi-seq 实验流程，可省略使用磁性聚丙烯酰胺核心微珠。
  3. 将纳米微珠悬浮液转移至两个 1.5 mL 离心管中，在 4 °C 下以 21,300 × g 离心 1 小时（使用角转子），弃去上清液。
  4. 用 1 mL 的 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1，见材料表）重悬底部沉淀物。
    注意：双丙烯酰胺为神经毒素。操作时需佩戴手套和实验服。请遵循机构安全指南。使用后的实验器具应按照机构规定进行废弃处理。
  5. 在 4 °C 下以 21,300 × g 离心 1 小时（使用角转子）。
  6. 在 4 °C 下以 5,000 × g 离心 30 分钟（使用水平转子，不启用刹车）。
  7. 使用 P1000 移液器以低速吸取方式移除上清液。
  8. 用 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1，见材料表）调节体积至 400 µL。
  9. 加入 25 µL 的 10% 过硫酸铵溶液（见表 1）。
    注意：过硫酸铵为强氧化剂。含过硫酸铵的空气粉尘接触后可能刺激眼睛、鼻子、喉咙、肺部和皮肤。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服。请遵循机构安全指南。使用后的实验器具应按照机构规定进行废弃处理。
  10. 为制备磁性聚丙烯酰胺核心微珠，取 0.5 µL 丙烯酰胺修饰的氧化铁悬浮液转移至 PCR 管中。
  11. 加入 50 µL 的 4% N,N,N',N'-四甲基乙二胺/矿物油（TEMED，见表 1），室温孵育过夜。
    注意：TEMED 为易燃溶剂。应在通风橱中操作，避免吸入。远离明火、高温表面和点火源。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服。请遵循机构安全指南。使用后的实验器具应按照机构规定进行废弃处理。

7. 使用单体丙烯酰胺修饰细胞蛋白的氨基

注意：REpi-seq 旨在对小鼠和人类细胞的表观基因组进行单细胞水平分析。当将该方法用于小鼠或人类以外物种的细胞时，每一步都必须进行优化。

  1. 收集细胞
    注意：时间：30 分钟
    1. 使用细胞计数仪（参见材料表）测定细胞浓度和细胞活力。
      注意：此步骤中的细胞活力将影响数据分析中活细胞的数量。
    2. 用含10%胎牛血清的培养基 (*) 将细胞浓度调整至 1 × 105 个细胞/mL。
      注意：*培养基是指适用于目标细胞的最适培养基。
    3. 将1 mL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中。
    4. 在4 °C条件下，以240 × g 离心5分钟，弃上清液。
    5. 加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻吹打混匀细胞，然后在4 °C条件下，以240 × g 离心5分钟。
    6. 弃去上清液。
      注意：上述所有步骤均应在层流洁净工作台中进行，以防止污染。
  2. 用单体丙烯酰胺修饰细胞蛋白的氨基
    注意：以下操作应在洁净工作台中进行，以避免DNase污染。时间：1.5 小时
    1. 向细胞沉淀中加入1 mL氨基修饰溶液（参见表1），并通过轻柔吹打重悬细胞沉淀。
    2. 将离心管置于冰上孵育1小时，然后在4 °C条件下，以240 × g 离心5分钟。
    3. 弃去上清液，用含DNA嵌入染料的4%丙烯酰胺/1 mM EDTA/PBS溶液（见表1，1个细胞/µL）100 mL重悬细胞。

8. 可重复使用单细胞的制备

  1. 可重复使用单细胞的制备（手动版本）
    注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免DNase污染。时间：9小时/96个细胞
    1. 将1 mL细胞悬液（1个细胞/µL）与199 mL含DNA嵌入染料的1 mM EDTA/PBS混合（参见表1）。
    2. 将200 µL细胞悬液转移至平底96孔板的每个孔中（共10块板，参见材料表）。
    3. 盖上96孔板盖，使用扫描显微镜（参见材料表）对10块板进行扫描，以识别含有单个细胞的孔。
    4. 将含有单个细胞的孔中的内容物转移至PCR管中。
      1. 将板倾斜（朝向操作者），静置数分钟，直至单个细胞沉降至孔的下边缘。
      2. 将移液枪头置于孔底角落，将单个细胞及缓冲液（吸取210 µL/孔 = 200 µL缓冲液 + 10 µL空气）转移至PCR管中。
        注意：务必使用P200低吸附枪头。
      3. 使用荧光显微镜检查孔，确认细胞已转移。
      4. 若单个细胞仍留在孔中，向孔中加入200 µL/孔含DNA嵌入染料的1 mM EDTA/PBS。
      5. 然后重复转移步骤。
    5. 使用无刹车的摆动转子，在4 °C条件下以240 × g离心PCR管5分钟。
      注意：刹车会导致管内液体产生涡流，干扰单个细胞的沉淀。使用无刹车的摆动转子离心时，单个细胞始终会沉降至管底。然而，若使用角转子，单个细胞会附着在PCR管侧壁上，可能导致丢失。
    6. 以极慢的移液速度吸除195 µL上清液。
    7. 每管加入195 µL丙烯酰胺/双丙烯酰胺/APS溶液（参见表1）。
    8. 使用无刹车的摆动转子，在4 °C条件下以240 × g离心PCR管5分钟。
    9. 以极慢的移液速度吸除195 µL上清液。
    10. 将底部3 µL液体转移至含有4% TEMED/矿物油及磁性聚丙烯酰胺微球（步骤6中制备）的PCR管中。
      注意：务必使用P10低吸附枪头。将细胞液滴加至磁性聚丙烯酰胺微球附近。在矿物油中，含单个细胞的液体因表面张力而附着于磁性聚丙烯酰胺微球表面。
    11. 室温孵育过夜。
      注意：此过程形成双层丙烯酰胺凝胶微球。核心为磁性凝胶微球，外层为含单个细胞的聚丙烯酰胺凝胶，单个细胞嵌入凝胶外层。安全暂停点：在用50%甘油/1 mM EDTA/0.05% Tween 20/0.5% BSA/TBS缓冲液洗涤可重复使用单细胞后，可将其在-20 °C保存长达6个月。
  2. 可重复使用单细胞的制备（半自动版本）
    注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免DNase污染。时间：3小时/96个细胞
    1. 将1 mL细胞悬液（1个细胞/µL）与199 mL含DNA嵌入染料的1 mM EDTA/PBS混合（参见表1）。
    2. 将200 µL细胞悬液转移至4 nL纳米孔板的每个孔中（参见图3和材料表），并将4 nL纳米孔板放置于自动单细胞挑选机器人上（参见材料表）。
    3. 将96孔PCR板作为目标板放置于自动单细胞挑选机器人上。确保每孔含有200 µL/孔的丙烯酰胺/双丙烯酰胺/APS溶液（参见表1）。
    4. 将单个细胞从4 nL纳米孔转移至96孔PCR板的一个孔中（参见补充视频S1）。
    5. 盖上96孔PCR板盖，在4 °C条件下使用无刹车的摆动转子以240 × g离心96孔板5分钟。
    6. 将96孔PCR板放置于自动液体处理机器人工作台上（参见材料表、图4和补充代码1）。
    7. 将补充代码1拖放至液体处理机器人的软件窗口中（参见材料表）。
    8. 在自动液体处理机器人上运行程序（参见补充视频S2和补充视频S3）。
      1. 以极慢的移液速度吸除195 µL上清液。
      2. 加入50 µL 4% TEMED/矿物油。
        注意：步骤8.2.8.1–8.2.8.2可通过手动移液完成。
    9. 室温孵育过夜（图5）。安全暂停点：在用50%甘油/1 mM EDTA/0.05% Tween 20/0.5% BSA/TBS缓冲液洗涤可重复使用单细胞后，可将其在-20 °C保存长达6个月。

纳米孔单细胞分析装置、挑选模块；细胞学研究实验中的显微成像。
图3：第8.2步中自动挑取单细胞并转移至96孔PCR板。（A）单细胞挑取系统的整体示意图。单细胞挑取机器人置于层流洁净工作台内，以避免污染。（B）24孔板，其孔内含有4 nL纳米孔。（C）24孔板中某一孔内的细胞分布情况。绿色圆点表示被识别为单个细胞的4 nL纳米孔；洋红色圆点表示被识别为双细胞或多细胞聚集体的纳米孔。（D）24孔板中某一孔的明场图像。绿色方框表示含有单个细胞的4 nL纳米孔；洋红色方框表示含有多个细胞的4 nL纳米孔。（E）部分4 nL纳米孔的放大视野。亮白色斑点为位于4 nL纳米孔中的单个细胞。单细胞挑取系统通过获取经DAPI染色细胞的明场与荧光图像，识别含有单个细胞的纳米孔，并将已识别的单细胞从4 nL纳米孔转移至96孔PCR板的某一孔中。比例尺 = 2 mm（C, D），100 µm（E）。缩写：DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的高清版本。

用于细胞分析的PCR板设置和移液示意图，显示移液吸头和聚合物凝胶形成。
图4：使用液体处理机器人生成可重复使用的单细胞。（A）液体处理机器人的工作台布局。该工作台包含11个插槽，用于放置移液吸头架（P300吸头：插槽1-3，P20吸头：插槽5-6）、2 mL深孔96孔板（插槽4）、两个96孔PCR板（每孔含一个单细胞，分别位于插槽7和10），以及两个用于液体废液的平底96孔板（插槽8和11）。（B）放置实验耗材后的工作台状态。（C）第8.8.1步中机器人移液操作的示意图。程序在不吸取96孔PCR板底部单细胞的前提下移除上清液。（D）使用补充代码1生成的可重复使用的单细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

9. 随机引物退火与延伸

注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免DNase污染。后续步骤中标有星号（*）的，表示可使用磁力架来控制管内含有可重复使用单细胞的聚丙烯酰胺微珠的位置。然而，使用磁力架并非必需。通过将移液器吸头沿管壁缓慢下移，可推动微珠上移，从而进行洗涤或缓冲液置换。时间：9 h

  1. 用移液器(*)吸除矿物油，并用 200 µL 1x TP Mg(-) 缓冲液（将 10x TP Mg(-) 缓冲液用超纯水稀释至 1x，参见 表 1）洗涤(*) 5 次。
  2. 吸除上清液(*)，加入 15 µL 退火缓冲液（参见 表 1）。
  3. 冰上孵育 1 小时。
    注意：此孵育步骤的目的是透化细胞膜和核膜，并将随机引物递送至细胞核内。
  4. 将 PCR 管置于热循环仪中，在 94 °C 加热 3 分钟。
    注意：PCR 管规格为 0.2 mL。溶液总体积约为 20 µL，包含聚丙烯酰胺微球的体积。热循环仪盖子温度为 105 °C。
  5. 将 PCR 管转移至冰上冷却的金属块中，孵育 2 分钟。
  6. 加入 4 µL MgSO4/NaCl/dNTP 混合液（参见 表 1），用涡旋振荡器以中等速度混匀。
  7. 加入 1 µL Bst DNA 聚合酶大片段（参见 材料表），用涡旋振荡器以中等速度混匀。
  8. 在摇床上孵育 4 小时（4 °C，600 rpm）。
    注意：此孵育步骤的目的是将 Bst 聚合酶递送至细胞核内。
  9. 将 PCR 管置于热循环仪中，运行以下程序之一：
    1. 运行 4 小时程序：10 °C 孵育 30 分钟，20 °C 孵育 30 分钟，25 °C 孵育 180 分钟。
    2. 或运行过夜程序：4 °C 孵育 4 小时，10 °C 孵育 2 小时，20 °C 孵育 2 小时，25 °C 孵育 4 小时，最后 4 °C 保存。
      注意：PCR 管规格为 0.2 mL。溶液总体积约为 25 µL，包含聚丙烯酰胺微球的体积。热循环仪盖子温度为 105 °C。安全暂停点：可在此处暂停实验，将可重复使用的单细胞在 4 °C 保存最多 1 天。

10. 抗体结合

注意：以下步骤需在洁净罩内进行，以避免DNase污染。时间：1.5 h

  1. 添加 1.625 µL NaCl/EDTA/BSA 溶液（参见 表1）并用低速涡旋振荡混合。
    注意：此步骤旨在 1）促进 Mg 的螯合2+ 通过EDTA，2）稳定延长的1结合st 使用300 mM NaCl的随机引物，并在后续反应中使用牛血清白蛋白（BSA）阻断抗体的非特异性结合。
  2. 冰上孵育1小时，然后加入 0.1 µg/mL 每种抗体及对照IgG与抗体探针（步骤5中制备）偶联。
  3. 在冰上轻轻振荡孵育过夜。

11. 抗体探针与邻近延伸的随机引物的连接

注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免 DNase 污染。后续步骤中的星号（*）表示可在该步骤使用磁力架来控制管内含有可重复使用单细胞的聚丙烯酰胺微珠的位置。然而，使用磁力架并非必需。通过将移液器吸头沿管壁缓慢下移，即可将微珠推至管壁上方，以便进行洗涤或缓冲液置换。时间：6 h

  1. 在冰上用 200 µL 的 1x TPM-T 缓冲液洗涤 (*) 两次（每次洗涤孵育 20 分钟）。将 10x TPM-T 缓冲液（Tris-HCl/氯化钾/硫酸镁/Triton X-100）用超纯水稀释至 1x。
  2. 去除 (*) 上清液，并用 1x T4 DNA 连接酶缓冲液洗涤 (*) 一次（参见材料表）。
  3. 去除 (*) 上清液，加入 19 µL 连接接头溶液（参见表 1）。
  4. 在 25 °C 下孵育 1 小时。
  5. 加入 1 µL T4 DNA 连接酶（参见材料表），并在涡旋振荡器上以中等速度混匀。
  6. 将离心管置于热循环仪中，运行以下程序：邻近连接程序，16 °C 反应 4 小时，25 °C 反应 30 分钟。
    注意：离心管规格为 0.2 mL。溶液总体积约为 25 µL，包括聚丙烯酰胺微球的体积。热循环仪盖温度为室温。
  7. 用 200 µL 的 1x Bst Mg(-) EDTA(+) 缓冲液（参见表 1；用 10x 储存液配制 1x 缓冲液）短暂洗涤 (*) 两次，并在 4 °C 下过夜保存细胞。安全暂停点：将可重复使用的单细胞在 4 °C 下保存，实验可在此处暂停最多 1 天。

12. 第一个随机引物的完全延伸

注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免 DNase 污染。时间：4.5 h

  1. 用 200 µL 1x Bst Mg(-) EDTA(-) 缓冲液（见表 1，由 10x 储存缓冲液配制 1x 缓冲液）洗涤两次，弃去上清液，加入 20 µL Bst/dNTPs/MgSO4 混合液（见表 1）。
  2. 中速涡旋振荡混匀，在摇床中孵育 4 小时（6 °C，500 rpm）。
  3. 将离心管置于热循环仪中，运行以下程序：完全延伸程序：10 °C 反应 1 小时，20 °C 反应 1 小时，30 °C 反应 1 小时，40 °C 反应 1 小时，50 °C 反应 1 小时，65 °C 反应 1 小时，94 °C 反应 10 分钟，然后在 4 °C 保存。
    注意：安全暂停点：实验可在此处暂停，将可重复使用的单细胞在 4 °C 保存最多 1 天。

13. 多重置换扩增

注意：以下操作需在洁净工作台内进行，以避免DNase污染。时间：2.5小时（步骤13.1–13.2）+ 15分钟（步骤13.3–13.4）+ 1天（步骤13.5–13.10）

  1. 添加 0.4 µL 的 100 µM 2nd 随机引物（参见 表3）并用涡旋混合器以中等速度混匀。
  2. 孵育 2 h，温度为 6 °C 并在轨道摇床上以500 rpm振荡，将离心管置于热循环仪中加热 94 °C 3 分钟。
    注意：试管规格为 0.2 mL，溶液的体积约为 25.4 µL，包括聚丙烯酰胺微珠的体积。热循环仪盖的温度为 105 °C.
  3. 将试管置于冰浴的金属块中，并加入 1 µL/tube Bst DNA聚合酶
  4. 缓慢涡旋混匀，将试管置于热循环仪中，运行以下程序：
    4 °C 4 小时， 10 °C 30 分钟 20 °C 30 分钟 30 °C 30 分钟 40 °C 30 分钟 50 °C 30 分钟 65 °C 60 分钟， 94 °C 3 分钟，然后保持在 4 °C.
    注意：离心管规格为 0.2 mL，溶液的体积约为 26.4 µL，包括聚丙烯酰胺微球的体积。热循环仪盖的温度为 105 °C. 安全暂停点在此停止实验，将可重复使用的单细胞置于适当条件下储存，最长可暂停1天 4 °C.
  5. 收集上清液（约 20 µL，并转移至PCR管中。
  6. 将收集的上清液于 -80 °C.
  7. 添加 20 µL/tube 含可重复使用单细胞的PCR管中加入0.05% Tween 20/0.1x TE缓冲液 表1）并将可重复使用的单细胞置于其中孵育 4 °C，过夜。 安全暂停点：通过延长孵育时间，将实验暂停数天。
  8. 收集上清液，并将该上清液与步骤13.5中采集的样品混合。
  9. 重复步骤13.7–13.8一次。将可重复使用的单细胞装置浸泡于50%甘油/5 mM EDTA/0.5% BSA/0.05% Tween20/TBS缓冲液中，在旋转摇床上孵育30分钟4 °C，600 转/分钟）。将可重复使用的单细胞储存于 -20 °C 直至下一次实验。
  10. 添加 40 µL 外泌体的- 预混液（参见 表1）并将试管放入热循环仪中，运行以下程序：i） 95 °C 5 分钟，ii) 95 °C 30秒，iii) 60 °C 30 s，iv） 72 °C 30秒，v) 重复步骤ii–iv共19次，vi) 72 °C 5 分钟，vii) 保持于 4 °C.
    注意：离心管规格为 0.2 mL，溶液的体积约为 45 µL，包括聚丙烯酰胺微球的体积。热循环仪盖的温度为 105 °C. 安全暂停点：通过将样品在 -80 °C.

14. 酚-氯仿纯化与聚乙二醇沉淀

注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免 DNase 污染。时间：1.5 小时

  1. 将产物转移至0.5 mL DNA低吸附离心管中，加入100 µL 苯酚:氯仿:异戊醇。
    注意：苯酚:氯仿:异戊醇接触后可能引起刺激甚至灼伤。操作时需佩戴手套、护目镜和实验服。仅可在充分通风条件下使用，或佩戴合适的呼吸防护装置。请遵循机构安全指南。废弃实验耗材应按照机构规定进行处理。
  2. 手动振荡30秒，于4 °C下以12,000 × g 离心10分钟。
  3. 收集水相（80 µL）至0.5 mL DNA低吸附离心管中，每管加入40.84 µL线性丙烯酰胺/MgCl2 混合液（见表1）。
  4. 每管加入47.06 µL 50% (w/v) PEG8000（RNase-free），用移液器吹打混匀。
  5. 室温孵育20分钟，于室温下以240 × g 离心10分钟。
  6. 弃去上清，每管加入400 µL 80%乙醇（EtOH）。
  7. 用80% EtOH洗涤，用抽吸法去除上清，空气干燥沉淀。
  8. 用20 µL 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲液重悬沉淀，并将溶液于-80 °C保存。
    注意：使用双链DNA特异性嵌入染料测定DNA浓度（见材料表）。安全暂停点：实验在此步骤可安全暂停至少一周。

15. 体外 转录

注意：以下操作需在洁净工作台内进行，以避免 DNase 和 RNase 污染。时间：5 h

  1. 解冻单细胞来源产物的DNA（来自步骤14），并通过混合制备单细胞来源产物的混合文库 2 µL/cell DNA产物的（总体积 20 µL).
  2. 添加 26 µL 的 体外 转录预混液（参见 材料表 并用移液器吹打混匀。
  3. 将PCR管置于热循环仪中，在4 h内孵育 37 °C.
    注意：试管规格为 0.2 mL。溶液的体积为 46 µL热循环仪盖子的温度为 105 °C.
  4. 添加 5 µL 10x DNase I 缓冲液（参见 材料清单）并加入 4 µL DNase I（无RNase，4 U，参见） 材料清单).
  5. 混合并在 15 分钟内孵育 37 °C，将样品转移至0.5 mL离心管中。
  6. 添加 300 µL/tube 硫氰酸胍-苯酚-氯仿法（参见 材料表）并轻轻涡旋混匀。
    注意：硫氰酸胍-苯酚-氯仿接触可导致严重化学灼伤。操作时须佩戴手套、护目镜和实验服。仅可在通风良好的环境中使用，或佩戴合适的呼吸防护装置。遵循机构安全指南。废弃实验器具应按照机构规定进行处理。
  7. 室温下在摇床上孵育 5 分钟，然后将样品置于 -80 °C 长达 3 天。
    注意： 安全暂停点：实验可在此处安全暂停，最长可达3天。

16. RNA 纯化

注意：以下操作需在洁净工作台内进行，以避免 DNase 和 RNase 污染。时间：2 h

  1. 向第15.7步的样品中加入80 µL/管的氯仿，并用手剧烈振荡试管15秒。
  2. 在室温下孵育2-15分钟，然后在4 °C下以12,000 × g 离心15分钟。
  3. 收集并转移样品的水相部分（约200 µL）至新的1.5 mL离心管中。
  4. 加入600 µL/管的硫氰酸胍-苯酚-氯仿溶液，并将样品转移至1.5 mL离心管中。
  5. 加入180 µL/管的氯仿，用手剧烈振荡试管15秒。
  6. 在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟。
  7. 收集并转移样品的水相部分（约450 µL）至1.5 mL离心管中。
  8. 向水相中加入60 µL/管的线性丙烯酰胺（5 µg/µL），并加入400 µL/管的100%异丙醇。
  9. 将离心管在室温下孵育10分钟，然后在4 °C下以12,000 × g 离心10分钟。
  10. 小心移除上清液。
  11. 用200 µL 75%乙醇（EtOH/无RNase水）洗涤RNA沉淀3次，每次均移除上清液，然后将RNA沉淀在空气中晾干。
    注意：切勿使RNA完全干燥，否则沉淀可能失去溶解性。
  12. 将RNA沉淀重悬于20 µL含RNase抑制剂（1 µL/20 µL）的无RNase水中，并通过移液操作溶解沉淀。
  13. 测定260 nm处的吸光度。

17. 逆转录

注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免 DNase 污染。时间：1 h

  1. 加入 7 µL/管的逆转录引物 + dNTP 混合物（参见表 1和表 3），并将管子置于热循环仪中。
    注意：管子规格为 0.2 mL。溶液总体积为 27 µL。热循环仪盖温为 105 °C。
  2. 在 65 °C 下加热 5 分钟，然后将管子置于冰上至少 1 分钟。
  3. 加入 14 µL/管的逆转录酶预混液（参见表 1），并通过移液混匀。
  4. 将管子置于热循环仪中，在 55 °C 下孵育 10 分钟，随后在 80 °C 下孵育 10 分钟。
    注意：管子规格为 0.2 mL。溶液总体积为 60 µL。热循环仪盖温为 105 °C。

18. 第二链合成

注意：以下操作需在洁净工作台内进行，以避免 DNase 污染。时间：2.5 小时

  1. 每管加入 40 µL 超纯水，将 100 µL 溶液分装至两个 0.2 mL PCR 管中（每管 50 µL）。
  2. 每管加入 60 µL 第二链合成混合液（见表 1），将 PCR 管放入热循环仪中，运行以下程序：i) 95 °C 5 分钟，ii) 95 °C 30 秒，iii) 60 °C 30 秒，iv) 72 °C 30 秒，v) 重复步骤 ii–iv 共 20 次，vi) 4 °C 保存。
    注意：PCR 管体积为 0.2 mL，溶液总体积为 110 µL，热循环仪盖温度为 105 °C。
  3. 每管加入 4.4 µL 0.5 M EDTA（终浓度 20 mM），于 -80 °C 过夜保存。
    注意：安全暂停点：实验在此步骤可安全暂停，最长可暂停数天。
  4. 采用酚-氯仿纯化及聚乙二醇沉淀法纯化 DNA（见步骤 14 的描述）。
    注意：安全暂停点：实验在此步骤可安全暂停至少一周。

19. 限制性内切酶消化与片段大小选择

注意：以下操作需在洁净罩内进行，以避免 DNase 污染。时间：3 小时（步骤 19.1–19.7）

  1. 通过测量260 nm处的吸光度，测定纯化后DNA（来自步骤18.4）的浓度。
  2. 将6 µg DNA转移至PCR管中，加入30 µL 10x消化缓冲液，并用超纯水定容至294 µL。
  3. 加入6 µL BciVI限制性内切酶，在37 °C下孵育1小时。
  4. 使用线性聚丙烯酰胺进行乙醇沉淀。
    1. 每管加入60 µL 3 M醋酸钠（pH 5.2），然后每管加入40 µL线性聚丙烯酰胺（5 mg/mL，参见材料表）。
    2. 每管加入400 µL乙醇，在-20 °C下孵育过夜。
      注意：安全暂停点：实验在此步骤可安全暂停一天。
    3. 在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，弃去上清液。
    4. 用80%乙醇洗涤沉淀两次，并将沉淀干燥。
    5. 用20 µL 1xTE缓冲液溶解沉淀，并每管加入4 µL新鲜的6x凝胶上样缓冲液。
  5. 将样品上样至5%琼脂糖凝胶/0.5x TAE缓冲液中，进行电泳（50 V，40分钟）。
  6. 切下并收集大于50 bp的凝胶条带（参见图6），使用凝胶回收试剂盒提取DNA。
    注意：安全暂停点：实验在此步骤可安全暂停至少一周。
  7. 使用DNA文库构建试剂盒构建测序文库（参见材料表）16,17。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

使用第8步所述方案制备K562单细胞（见图5）。将单细胞包埋于聚丙烯酰胺微球的外层。采用DNA嵌入染料对细胞DNA进行染色并可视化观察。

用于光学研究中标记分析的液体内微滴显微图像。
图 5：生成的可重复使用单细胞。 细胞使用DNA嵌入染料染色（绿色荧光）。白色箭头指示嵌入聚丙烯酰胺微珠外层的单细胞。可重复使用的单细胞被置于96孔平底板中。图像由BZ-X710扫描显微镜拍摄。比例尺 = 1 mm。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文介绍了近期报道的利用可重复使用单细胞进行单细胞多表观基因组分析的逐步实验方案7。在接下来的段落中，我们将讨论该方案的关键要点，并强调其中可能存在的局限性。

在整个实验方案中（从步骤 7.2 到 13），一个关键点是避免 DNase 污染。单个细胞仅含有两份基因组 DNA，因此基因组 DNA 的损伤会显著降低信号数量。避免 DNase 污染对于保护基因组 DNA 的完整性至关重要。

试剂穿过细胞膜/细胞壁的通透性在整个实验过程中也至关重要。REpi-seq 被设计用于在单细胞水平上分析小鼠和人类细胞的表观基因组。该实验方法的最佳条件可能因不同细胞类型以及核膜对各种试剂的通透性差异而有所不同。因此，当该方法应用于小鼠和人类细胞以外的细胞（如植物细胞、酵母和细菌）时，需对每一步的实验条件进行优化。

我们认为，第9.5步（退火第一个随机引物）的一个关键点在于基因组DNA变性后的快速冷却速度。变性后若缓慢渐进地冷却，可能会降低随机...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

Ohnuki 博士和 Tosato 博士是专利“用于制备可重复使用的单细胞以及用于分析单细胞表观基因组、转录组和基因组的方法”（EP3619307 和 US20200102604）的共同发明人。该专利申请部分基于与本文所述技术相关的初步研究结果。本专利申请中描述并主张的发明是在发明人作为美国政府全职雇员期间完成的。因此，根据《美国联邦法规》第45篇第7部分，该专利申请的全部权利、所有权和权益已依法归属或应依法归属于美国政府。美国政府根据《美国法典》第15篇的规定，将其所获部分专利使用费授予其雇员发明人。 § 3710c

致谢

我们感谢 David Sanchez-Martin 博士和 Christopher B. Buck 博士在本项目构思阶段提出的宝贵意见。我们还感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心基因组学核心实验室在初步实验中提供的帮助，以及癌症研究中心协作生物信息资源（CCR, NCI, NIH）在计算分析方面给予的建议。我们感谢 Anna Word 女士在优化本方法所用DNA聚合酶过程中提供的协助。本研究使用了美国国立卫生研究院高性能计算生物云集群（NIHHPC Biowulf cluster，http://hpc.nih.gov）的计算资源。本项目得到了国家癌症研究所癌症研究中心院内计划、国家癌症研究所主任创新奖（#397172）以及美国国家癌症研究所合同编号 HHSN261200800001E 项下联邦资金的资助。我们感谢 Tom Misteli 博士、Carol Thiele 博士、Douglas R. Lowy 博士以及细胞肿瘤学实验室全体成员提出的富有建设性的意见。 

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10x CutSmart 缓冲液New England BioLabsB600410x 消化缓冲液
200 proof 乙醇华纳-格雷厄姆公司200 proof乙醇
5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）单克隆抗体 [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100抗-5hmC
吖啶橙/碘化丙啶染色Logos BiosystemsF23001细胞计数仪
丙烯酰胺溶液，40% 溶于 H2O，分子生物学用MilliporeSigma01697-500ML40% 丙烯酰胺溶液
一体化荧光显微镜BZ-X710KeyenceBZ-X710扫描显微镜
Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置MilliporeSigmaUFC510024超滤离心管
分子生物学用过硫酸铵MilliporeSigmaA3678-100G过硫酸铵粉末
无水 DMFVector LaboratoriesS-4001-005无水 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）
抗RNA聚合酶II CTD重复序列YSPTSPS（磷酸化S5）抗体 [4H8]Abcamab5408抗Pol II
抗TRAP220/MED1（磷酸化T1457）抗体Abcamab60950抗Med1
BciVINew England BioLabsR0596LBciVI
牛血清白蛋白溶液，20 mg/mL，溶于 H2O，低生物负载，无蛋白酶，用于分子生物学MilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA（表7）
Bst DNA聚合酶，大片段New England BioLabsM0275LBst DNA聚合酶
BT10 系列 10 µl 屏障尖端NEPTUNEBT10P10 低吸附吸头
CellCelector自动化实验室解决方案N/A自动化单细胞挑选机器人
CellCelector 4 nl 微孔板，用于单细胞克隆，型号 S200-100 100K，24 孔，超低吸附自动化实验室解决方案CC00794 nL 纳米孔板
氯仿MilliporeSigma氯仿
康宁科斯特96孔细胞培养处理平底微孔板康宁3596平底96孔板
Deep Vent (exo-) DNA聚合酶New England BioLabsM0259L外泌体- DNA聚合酶
DNA LoBind 离心管，0.5 mLEppendorf301080350.5 mL DNA低吸附管
DNA寡核苷酸，第一随机引物Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第一随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#01Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#02Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞编号03Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#04Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#05Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞编号06Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 Cell#07Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#08Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#09Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#10Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#11Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二轮随机引物 细胞#12Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二轮随机引物
DNA寡核苷酸，第二条合成引物Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3第二条合成引物
DNA 寡核苷酸，连接接头Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3连接接头
DNA寡核苷酸，逆转录引物Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3反转录引物
DNase I（无RNase）新英格兰生物实验室M0303LDNase I（无RNase，4 U）
DNase I 反应缓冲液New England BioLabsB0303S10x DNase I 缓冲液（NEB）
dNTP混合液（各10 mM）赛默飞世尔科技R019210 mM dNTPs
胎牛血清，美国来源，已灭活处理MilliporeSigmaF4135-500ML胎牛血清
HiScribe T7 高产 RNA 合成试剂盒新英格兰生物实验室E2040S体外转录主混合液
组蛋白H3K27ac抗体活性基序39133抗H3K27ac
组蛋白H3K27me3抗体活性基序39155抗H3K27me3
兔血清中的IgGMillipore SigmaI5006-10MG对照 IgG
四氧化三铁磁性纳米粉末，平均粒径30 nm（TEM），N-羟基琥珀酰亚胺酯功能化MilliporeSigma747467-1GNHS酯功能化的30 nm氧化铁粉末
K-562美国典型培养物保藏中心（ATCC）CCL-243细胞
线性聚丙烯酰胺（5 mg/mL）赛默飞世尔科技AM9520线性丙烯酰胺
LUNA-FL 双荧光细胞计数仪Logos BiosystemsL20001细胞计数仪
LUNA 细胞计数板，50 片Logos BiosystemsL12001细胞计数仪
矿物油，生物试剂，分子生物学用，轻质油MilliporeSigmaM5904-500ML矿物油
N,N,N′，N′-分子生物学用四甲基乙二胺MilliporeSigmaT7024-100MLN,N,N′，N′四甲基乙二胺
NaCl (5 M)，无RNase赛默飞世尔科技AM9760G5M NaCl
NanoDrop Lite赛默飞世尔科技2516 微量分光光度计
NEST 2 mL 96孔深孔板，V型底OpentronsN/A96孔深孔板，每孔2 mL
无裙边96孔PCR板Genesee Scientific27-40596孔PCR板
NuSive GTG 琼脂糖Lonza50081琼脂糖
OmniPur 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 19:1，40% 溶液MilliporeSigma1300-500毫升40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺
OT-2 实验室机器人OpentronsOT2自动化液体处理机器人
多聚甲醛，电镜级，纯化，20% 水溶液电子显微镜科学公司1571320% 甲醛
PBS（10倍浓度），pH 7.4赛默飞世尔科技7001104410x PBS
PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602一个P1000移液器
蛋白低吸附管，1.5 mLEppendorf9250000901.5 mL 蛋白低吸附管
QIAgen 胶回收试剂盒Qiagen28706一个P1000移液器
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测试剂盒赛默飞世尔科技P11495 dsDNA特异性嵌入染料
快速连接试剂盒New England BioLabsM2200LT4 DNA连接酶（NEB）
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂赛默飞世尔科技10777019RNase抑制剂
S-4FB 交联剂（DMF 可溶）Vector LaboratoriesS-1004-105琥珀酰亚胺基-4-甲醛苯甲酸酯（S-4FB）
S-HyNicVector LaboratoriesS-1002-105乙酰丙酮腙琥珀酰亚胺-6-酰肼基烟酸酯（S-HyNic）
醋酸钠，3 M，pH 5.2，分子生物学级MilliporeSigma567422-100ML3M 醋酸钠（pH 5.2）
碳酸氢钠，1 M 缓冲液，pH 8.5Alfa AesarJ604081 M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5
分子生物学用磷酸氢二钠MilliporeSigmaS3264-250GNa2HPO4
分子生物学用磷酸二氢钠MilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
SuperScript IV 逆转录酶赛默飞世尔科技18090050逆转录酶
SYBR Gold 核酸凝胶染料（DMSO 中 10,000 倍浓缩液）赛默飞世尔科技S11494一种用于DNA的嵌入染料
T4 DNA连接酶反应缓冲液New England BioLabsB0202S10x T4 DNA连接酶反应缓冲液
ThermoPol反应缓冲液套装New England BioLabsB9004S10倍TPM-T缓冲液（Tris-HCl/氯化钾/硫酸镁/Triton X-100）
TRIzol LS 试剂赛默飞世尔科技10296-028异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法
TruSeq Nano DNA文库制备试剂盒Illumina20015965DNA文库制备试剂盒（另请参阅生产商说明书）
Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3用于抗体的氨基修饰DNA探针
Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3用于抗体的胺基修饰DNA探针
Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-H3K27me3_Ab#003Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3用于抗体的氨基修饰DNA探针
Ultramer DNA 寡核苷酸，Anti-Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3用于抗体的氨基修饰DNA探针
Ultramer DNA 寡核苷酸，抗 Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3用于抗体的氨基修饰DNA探针
Ultramer DNA 寡核苷酸，对照 IgG_Ab#001Integrated DNA TechnologiesN/A，参见表3用于对照 IgG 的胺基修饰 DNA 探针
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0赛默飞世尔科技155750200.5 M EDTA，pH 8.0
UltraPure 无DNase/RNase纯水赛默飞世尔科技10977023超纯水
Zeba™ 脱盐柱，7K 分子量截留值，0.5 mL赛默飞世尔科技89882脱盐柱

参考文献

  1. Perkel, J. M. Single-cell analysis enters the multiomics age. Nature. 595 (7868), 614-616 (2021).
  2. Clark, S. J., et al. scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells. Nature Communications. 9 (1), 781(2018).
  3. Ma, S., et al. Chromatin potential identified by shared single-cell profiling of RNA and Chromatin. Cell. 183 (4), 1103-1116 (2020).
  4. Zhu, C., et al. An ultra high-throughput method for single-cell joint analysis of open chromatin and transcriptome. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 1063-1070 (2019).
  5. Zhu, C., et al. Joint profiling of histone modifications and transcriptome in single cells from mouse brain. Nature Methods. 18 (3), 283-292 (2021).
  6. Mimitou, E. P., et al. Scalable, multimodal profiling of chromatin accessibility, gene expression and protein levels in single cells. Nature Biotechnology. 39 (10), 1246-1258 (2021).
  7. Ohnuki, H., Venzon, D. J., Lobanov, A., Tosato, G. Iterative epigenomic analyses in the same single cell. Genome Research. 31 (10), 1819-1830 (2021).
  8. Tosato, G., Ohnuki, H. Methods of preparing a re-usable single cell and methods fro analyzing the epigenome, transcriptome, and genome of a single cell. , EP 3619307, US 202001026704 (2021).
  9. Harada, A., et al. A chromatin integration labelling method enables epigenomic profiling with lower input. Nature Cell Biology. 21 (2), 287-296 (2019).
  10. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
  11. Marina, R. J., et al. TET-catalyzed oxidation of intragenic 5-methylcytosine regulates CTCF-dependent alternative splicing. EMBO Journal. 35 (3), 335-355 (2016).
  12. Weast, R. C., et al. Handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and physical data. 56th edn. Weast, R. C., Astle, M. J., Beyer, W. H. , Chemical Rubber Company Press. (1975).
  13. Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
  14. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133 (9), 12(2013).
  15. Porstmann, T., Kiessig, S. T. Enzyme immunoassay techniques. An overview. Journal of Immunological Methods. 150 (1-2), 5-21 (1992).
  16. Chao, H. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).
  17. Song, Y., et al. A comparative analysis of library prep approaches for sequencing low input translatome samples. BMC Genomics. 19 (1), 696(2018).
  18. Rotem, A., et al. Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state. Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).
  19. Ku, W. L., et al. Single-cell chromatin immunocleavage sequencing (scChIC-seq) to profile histone modification. Nature Methods. 16 (4), 323-325 (2019).
  20. Carter, B., et al. Mapping histone modifications in low cell number and single cells using antibody-guided chromatin tagmentation (ACT-seq). Nature Communications. 10 (1), 3747(2019).
  21. Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

迭代表观基因组分析单细胞表观基因组邻近连接聚丙烯酰胺包埋抗体DNA探针组蛋白修饰多重置换扩增毛细管电泳多组学分析
可重复使用的单细胞用于迭代表观基因组分析
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。