Method Article

用于迭代表观基因组分析的可重复使用的单细胞

DOI:

10.3791/63456

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February 11th, 2022

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1Laboratory of Cellular Oncology, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Biostatistics and Data Management Section, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 3CCR Collaborative Bioinformatics Resource (CCBR), Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 4Advanced Biomedical Computational Science, Frederick National Laboratory for Cancer Research sponsored by the National Cancer Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本协议描述了一种使用可重复使用的单细胞进行迭代表观基因组分析的单细胞方法。可重复使用的单细胞允许分析同一单细胞中的多个表观遗传标记并对结果进行统计验证。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前的单细胞表观基因组分析是为一次性使用的而设计的。该细胞在单次使用后被丢弃，防止分析单个细胞中的多个表观遗传标记，并需要来自其他细胞的数据来区分单个细胞中的信号和实验背景噪声。本文描述了一种重复使用同一单细胞进行迭代表观基因组分析的方法。

在这种实验方法中，细胞蛋白首先锚定在聚丙烯酰胺聚合物上，而不是将它们与蛋白质和DNA交联，从而减轻结构偏差。这一关键步骤允许使用相同的单细胞重复实验。接下来，将具有用于邻近连接的支架序列的随机引物退火到基因组 DNA 上，并使用 DNA 聚合酶通过延伸将基因组序列添加到引物中。随后，针对表观遗传标记物和对照IgG的抗体（每个抗体用不同的DNA探针标记）与同一单细胞中的相应靶标结合。

通过在随机引物和抗体-DNA探针的支架序列中添加具有互补序列的连接器DNA，诱导随机引物和抗体之间的邻近连接。这种方法将抗体信息和附近的基因组序列整合到邻近连接的单个DNA产物中。通过对同一单细胞进行重复实验，该方法可以增加稀有细胞的数据密度，并仅使用来自同一细胞的IgG和抗体数据进行统计分析。通过该方法制备的可重复使用的单细胞可以存储至少几个月，并在以后重复使用以扩大表观遗传学表征并提高数据密度。这种方法为研究人员及其项目提供了灵活性。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞技术正在进入单细胞多组学时代，它集成了单个单细胞组学技术1。最近，单细胞转录组学已与检测染色质可及性（scNMT-seq2 和SHARE-seq3）或组蛋白修饰（Paired-seq4 和Paired-Tag5）的方法相结合。最近，单细胞转录组学和蛋白质组学与染色质可及性（DOGMA-seq6）相结合。这些方法使用基于转座酶的标记来检测染色质可及性或组蛋白修饰。

基于转座酶的方法切割基因组DNA，并在基因组DNA片段的末端添加DNA条形码。每个切割的基因组片段最多只能接受两个DNA条形码（=每个切割位点一个表观遗传标记），并且切割位点的基因组DNA丢失。因此，基于切割的方法需要在测试的表观遗传标记数量和信号密度之间进行权衡。这阻碍了对同一单细胞中多个表观遗传标记的分析。开发了一种不切割基因组DNA的单细胞表观基因组方法来克服这个问题7，8。

除了上面提到的切割衍生问题外，基于转座酶的方法还有其他局限性。在单细胞表观基因组分析中，了解组蛋白和DNA相关蛋白在基因组上的位置至关重要。在目前的方法中，这是通过使用未固定的单细胞和保留蛋白质 - DNA和蛋白质 - 蛋白质相互作用来实现的。然而，即使在组蛋白修饰的分析中，这也会对可接近的染色质区域产生强烈的偏差9。使用聚丙烯酰胺支架7，8，可以在不交联蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质的情况下保留组蛋白和基因组相关蛋白在基因组上的位置。这种方法减少了在当前依赖于蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用的方法中观察到的结构偏差。

基于转座酶的方法只能从单个细胞获取一次信号。因此，由于信号的下降，很难描绘出单个细胞的完整表观基因组。已经开发出可重复使用的单细胞，通过允许在同一单细胞中进行迭代表观基因组分析来克服当前的局限性。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注意:该方法的示意图如图 1所示。

figure-protocol-1
图 1:协议工作流程的示意图。 步骤7.2-13通过示意图进行说明。每行表示协议中的一个步骤。绿色的细胞蛋白是基于晶体结构（PDB:6M4G）产生的人核小体。 请点击此处查看此图的大图。

1. 脱盐塔的平衡

注意:脱盐离心柱按以下步骤所述进行平衡。平衡脱盐塔用于步骤2.1、3.4和4.6。

  1. 拆下脱盐柱的底部封盖（7 kDa截止值，0.5 mL树脂珠体积，参见 材料表），松开脱盐柱顶部的盖子。
  2. 将色谱柱置于1.5 mL蛋白质低结合管（收集管，参见 材料表）中，并在室温下以1，500 × g 离心1分钟以除去色谱柱中的储存溶液。
    注意:使用摆动转子离心机压平珠床的顶部。
  3. 取出 1.5 mL 管中的流出物，并在树脂床顶部加入 300 μL 150 mM NaCl/100 mM 磷酸盐缓冲液，pH 8.0（见 表 1）。
  4. 在室温下以1，500× g 离心1分钟，并除去收集管中的流出物。
  5. 再重复步骤 1.3-1.4 三次。
  6. 从收集管中丢弃缓冲液，并将色谱柱放入新的收集管中。
  7. 使用步骤2.1、3.4和4.4中的平衡脱盐柱。

2. 抗体的缓冲液置换

注意:从抗H3K27ac 10，抗H3K27me3 10，抗Med111和抗PolII 10中去除甘油，精氨酸和叠氮化钠（参见表1所示的缓冲液组成）。以下所有程序均在干净的罩子下进行，以避免DNase污染。时间:1小时

  1. 将抗体溶液（100 μL，参见 表2）施加到按照步骤1制备的平衡脱盐柱上。
  2. 在4°C下以1，500× g 离心2分钟，并将流出物从收集管转移到1.5mL蛋白质低结合管中。
  3. 使用280nm12 处的吸光度测量IgG浓度（使用微量分光光度计）。
  4. 将抗体溶液转移到超滤盒（截止分子量100kDa，0.5mL，参见 材料表）中，并在4°C下以12，000× g 离心5分钟。
  5. 使用280nm处的吸光度测量IgG浓度。
  6. 重复步骤2.4-2.5，直到IgG浓度达到1mg / mL。

3. 抗体活化

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:2.5小时

  1. 将 1 mg 琥珀酰亚胺基 6-肼烟酸丙酮腙（S-HyNic，参见材料表）与 100 μL 无水 N，N-二甲基甲酰胺（DMF，参见材料表）溶解。
    注意:DMF是一种易燃的有机溶剂，是一种通过皮肤吸收的强效肝毒素。戴上手套、护目镜和实验室外套。遵循机构安全准则。根据机构指南丢弃用过的实验室器具。
  2. 将 0.6 μL S-HyNic/DMF 加入 100 μL 抗体溶液（1 mg/mL 在 150 mM NaCl/100 mM 磷酸钠中，pH 8.0。所用抗体和对照IgG参见 表2 。
  3. 在室温下孵育2小时（避光）。
  4. 将 100 μL S-HyNic 反应抗体施加到平衡脱盐柱的顶部（参见步骤 1），并在 4 °C 下以 1，500 × g 离心 2 分钟以收集样品。
  5. 使用后丢弃脱盐柱。
    注意:蛋白质和其他生物分子上HyNic基团的稳定性各不相同。建议立即偶联HyNic修饰的生物分子。

4. DNA探针的激活

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:2.5小时

  1. 用 20 μL 150 mM NaCl/100 mM 磷酸钠缓冲液（pH 8.0）溶解用于抗体或对照 IgG（抗体探针， 表 3）的胺修饰 DNA 探针沉淀。
    注意:在管底部寻找薄的透明颗粒/薄膜。将缓冲液直接涂在沉淀上。如果颗粒不可见，则颗粒可能已脱落并粘附在墙壁或盖子上。在这种情况下，离心管并在管底部寻找颗粒。
  2. 将 1 mg 琥珀酰亚胺基 4-甲酰基苯甲酸酯（S-4FB，参见 材料表）与 50 μL 无水 DMF 溶解，并向溶解的抗体探针中加入 10 μL DMF。
  3. 加入步骤4.2中制备的4μLS-4FB / DMF，混合，并在室温下孵育2小时（避光）。
  4. 将 34 μL S-4FB 反应抗体探针涂于平衡脱盐柱顶部（参见步骤 1）。
  5. 样品完全吸收后，将 15 μL 150 mM NaCl/100 mM 磷酸钠缓冲液（pH 8.0）涂于凝胶床顶部，并在 4 °C 下以 1，500 × g 离心 2 分钟以收集 S-4FB 修饰的抗体探针。
  6. 使用流过进行后续共轭;测量260nm处的吸光度;并计算抗体探针的回收率。

5. S-HyNic修饰抗体与S-4FB修饰抗体探针的偶联

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间: 2 小时

  1. 混合S-HyNic修饰的抗体和S-4FB修饰的抗体探针，上下移液混合。
  2. 在室温下孵育2小时（避光）。
  3. 要淬灭反应，加入478.8μL淬灭和储存溶液（见 表1）。
  4. 将抗体探针偶联的抗体溶液转移到超滤盒中（截止分子量100 kDa）。
  5. 在12，000× g，4°C下离心5分钟。
  6. 通过移液检查盒内溶液的体积。
  7. 重复步骤5.5-5.6，直到体积达到100μL并储存在-20°C。
    注意:IgG浓度使用IgG标准品通过夹心ELISA13，14，15测量。

6.磁珠的制备

注意:在这种方法中，将单个细胞嵌入双层丙烯酰胺珠中（见 图2）。核心是磁性聚丙烯酰胺珠。外层是单独的聚丙烯酰胺。磁芯磁珠在本节中生成。此部分对于实验不是必需的。 时间:3小时

figure-protocol-2
图 2:双层聚丙烯酰胺珠的结构，可在 REpi-seq 实验中提供可见性和易于处理 。 （A）离心后步骤6.6的磁性纳米颗粒。磁性纳米颗粒用单体丙烯酰胺修饰并整合到 B所示的聚丙烯酰胺磁珠中。（B）带有聚丙烯酰胺磁珠的可重复使用的单细胞的示意图。 请点击此处查看此图的大图。

  1. 混合 50 μL 1 M 碳酸氢钠缓冲液、pH 8.5 和 450 μL 40% 丙烯酰胺溶液。
    注意:丙烯酰胺是一种神经毒素。戴上手套、护目镜和实验室外套。遵循机构安全准则。根据机构指南丢弃用过的实验室器具。
  2. 将1gNHS酯官能化的30nm氧化铁粉末（参见 材料表）悬浮在丙烯酰胺/碳酸氢钠缓冲液中，并在4°C孵育过夜。
    注意:由于丙烯酰胺磁珠是透明的，因此可能难以看到和操纵磁珠的位置。包含由氧化铁制成的磁珠提高了可见性并便于操作，因为可以使用磁铁控制磁珠的位置。但是，如果用户熟悉REpi-seq实验，则可以跳过使用核心磁性聚丙烯酰胺珠。
  3. 将纳米珠悬浮液转移到2个管（1.5mL）中，在4°C下以21，300× g 离心1小时（使用倾斜的转子），并除去上清液。
  4. 用 1 mL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1，见 材料表）悬浮底部浆料。
    注意:双丙烯酰胺是一种神经毒素。戴上手套和实验室外套。遵循机构安全准则。根据机构指南丢弃用过的实验室器具。
  5. 在4°C下以21，300× g 离心1小时（使用倾斜的转子）。
  6. 在4°C下以5，000× g 离心30分钟（使用没有制动器的摆动转子）。
  7. 使用P1000移液器慢速抽吸除去上清液。
  8. 将体积调节至 400 μL 40% 丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1，参见 材料表）。
  9. 加入 25 μL 10% 过硫酸铵溶液（见 表 1）。
    注意:过硫酸铵是一种强氧化剂。空气中含有过硫酸铵的粉尘在接触时可能会刺激眼睛、鼻子、喉咙、肺和皮肤。戴上手套、护目镜和实验室外套。遵循机构安全准则。根据机构指南丢弃用过的实验室器具。
  10. 要生成核心磁性聚丙烯酰胺珠，请将 0.5 μL 丙烯酰胺改性氧化铁悬浮液转移到 PCR 管中。
  11. 加入 50 μL 4% N，N ，N'，N'-四甲基乙二胺/矿物油（TEMED，见 表 1），并在室温下孵育过夜。
    注意:TEMED是一种易燃溶剂。在引擎盖下工作。不要吸入。远离明火、热表面和火源。戴上手套、护目镜和实验室外套。遵循机构安全准则。根据机构指南丢弃用过的实验室器具。

7.用单体丙烯酰胺修饰细胞蛋白的氨基

注意:REpi-seq旨在分析单细胞水平的小鼠和人类细胞的表观基因组。在小鼠或人类以外的物种的细胞上使用此方法时，必须优化每个步骤。

  1. 收获细胞
    注: 时间:30分钟
    1. 使用细胞计数器测量细胞浓度和活力（参见 材料表）。
      注意:此步骤中细胞的活力会影响数据分析中活细胞的数量。
    2. 用含有10%胎牛血清的培养基（*）将细胞浓度调节至1×105 个细胞/ mL。
      注意:*培养基是目标细胞的最佳培养基。
    3. 将 1 mL 细胞悬液转移到 1.5 mL 管中。
    4. 在4°C下以240× g 离心细胞悬液5分钟并除去上清液。
    5. 加入1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），通过轻柔移液混合细胞，并在4°C下以240× g 离心细胞悬液5分钟。
    6. 除去上清液。
      注意:上述所有步骤都应在层流清洁罩中进行，以防止污染。
  2. 用单体丙烯酰胺修饰细胞蛋白的氨基
    注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:1.5小时
    1. 向细胞沉淀中加入 1 mL 氨基修饰溶液（参见 表 1），并通过轻轻移液悬浮细胞沉淀。
    2. 将管在冰上孵育1小时，并在4°C下以240× g 离心细胞悬液5分钟。
    3. 除去上清液，用含有DNA插层染料的100mL 4%丙烯酰胺/ 1mM EDTA / PBS重悬细胞（参见表1， 1细胞/ μL）。

8. 可重复使用的单细胞的制备

  1. 可重复使用的单细胞制备（手动版本）
    注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:9小时/96细胞
    1. 混合 1 mL 细胞悬液 （1 细胞/μL） 和 199 mL 含有 DNA 插层染料的 1 mM EDTA/PBS（参见 表 1）。
    2. 将 200 μL 细胞悬液转移到平底 96 孔板的每个孔中（总共 10 个板，参见 材料表）。
    3. 将盖子放在96孔板上，并使用扫描显微镜扫描10块板（参见 材料表）以识别包含单个细胞的孔。
    4. 将含有单个细胞的孔的内容物转移到PCR管中。
      1. 将板倾斜（朝向操作员），等待几分钟，直到单个细胞沉到孔的下边缘。
      2. 将移液器吸头放在底角，将单个细胞和缓冲液（吸出210μL/孔= 200μL缓冲液+ 10μL空气）转移到PCR管中。
        注:请务必使用 P200 低保留吸头。
      3. 使用荧光显微镜检查孔以确认转移。
      4. 如果单个细胞仍在孔中，则添加 200 μL/孔的 1 mM EDTA/PBS，其中含有用于 DNA 的插层染料。
      5. 然后，重复传输。
    5. 使用不带制动器的摆动转子在4°C下以240× g 离心PCR管5分钟。
      注意:制动会导致管中水流漩涡，从而破坏单电池的沉淀。当使用不带制动器的摆动转子离心时，单个电池将始终沉入管底部。但是，如果使用倾斜的转子，则单个细胞附着在PCR管的侧壁上并且可能会丢失。
    6. 以非常慢的移液速度去除 195 μL 上清液。
    7. 加入 195 μL/管丙烯酰胺/双丙烯酰胺/APS 溶液（见 表 1）。
    8. 使用不带制动器的摆动转子在4°C下以240× g 离心PCR管5分钟。
    9. 以非常慢的移液速度去除 195 μL 上清液。
    10. 将底部 3 μL 转移到含有 4% TEMED/矿物油和磁性聚丙烯酰胺珠（在步骤 6 中生成）的 PCR 管中。
      注意:请务必使用 P10 低保留吸头。将磁性聚丙烯酰胺珠附近的细胞分配。在矿物油中，含有单细胞的液体通过表面张力粘附在磁性聚丙烯酰胺珠的表面上。
    11. 在室温下孵育过夜。
      注意:此过程生成双层丙烯酰胺凝胶珠。核心是磁性凝胶珠。外层是含有单个细胞的聚丙烯酰胺凝胶。单个细胞嵌入凝胶的外层。 安全停止点:用50%甘油/ 1mM EDTA / 0.05%吐温20/0.5%BSA / TBS缓冲液洗涤可重复使用的单细胞后，可重复使用的单细胞可在-20°C下储存长达6个月。
  2. 可重复使用的单细胞制备（半自动版本）
    注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:3小时/96节
    1. 混合 1 mL 细胞悬液 （1 细胞/μL） 和 199 mL 含有 DNA 插层染料的 1 mM EDTA/PBS（参见 表 1）。
    2. 将 200 μL 细胞悬液转移到 4 nL 纳米孔板的每个孔中（参见图 3 和材料表），并将 4 nL 纳米孔板放在自动单细胞拣选机器人上（参见材料表）。
    3. 将 96 孔 PCR 板作为目标板放置在自动单细胞拣选机器人上。确保每个孔含有200 μL/孔丙烯酰胺/双丙烯酰胺/APS溶液（见 表1）。
    4. 将单个细胞从4nL纳米孔转移到96孔PCR板的孔中（参见 补充视频S1）。
    5. 将盖子放在96孔PCR板的顶部，并使用没有制动器的摆动转子在4°C下以240× g 离心96孔板5分钟。
    6. 将 96 孔 PCR 板放在自动液体处理机器人的甲板上（参见 材料表、 图 4 和 补充代码 1）。
    7. 将 补充代码 1 拖放到液体处理机器人的软件窗口（参见 材料表）中。
    8. 在自动液体处理机器人上运行该程序（请参阅补充视频 S2 和补充视频 S3）。
      1. 以非常慢的移液速度去除 195 μL 上清液。
      2. 加入 50 μL 4% TEMED/矿物油。
        注意:步骤8.2.8.1-8.2.8.2可以通过手动移液进行。
    9. 在室温下孵育过夜（图5）。 安全停止点:用50%甘油/ 1mM EDTA / 0.05%吐温20 / 0.5%BSA / TBS缓冲液洗涤可重复使用的单细胞后，将可重复使用的单细胞在-20°C下储存长达6个月。

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图 3:在步骤 8.2 中自动单细胞拾取并转移到 96 孔 PCR 板中 。 （A） 单细胞拾取系统概述。单个细胞拣选机器人位于层流清洁罩中，以避免污染。（B）孔内有4nL纳米孔的24孔板。（C）来自24孔板的孔中的细胞分布。绿点是每4nL纳米孔中被标识为单个细胞的细胞。洋红色点是标识为双联或细胞倍数的细胞。（D）24孔板中孔的明场图像。绿色方块是包含单个细胞的4nL纳米孔。洋红色正方形是包含多个细胞的 4 nL 纳米孔。（E）约4 nL纳米孔的放大场。亮点是4nL纳米孔中的单细胞。单细胞拾取系统通过获取具有DAPI染色的细胞的明场和荧光图像来识别包含单个细胞的纳米孔。将鉴定出的单细胞从4nL纳米孔转移到96孔PCR板的孔中。比例尺 = 2 毫米 （C， D）， 100 μm （E）。缩写 = DAPI = 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚。 请点击此处查看此图的大图。

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图 4:使用液体处理机器人生成可重复使用的单个细胞。 （A） 液体处理机器人的甲板。该平台有 11 个用于移液器吸头架的插槽（P300 吸头:插槽 1-3，P20 吸头:插槽 5-6）、2 mL 深孔 96 孔板（插槽 4）、两个包含每孔单个细胞的 96 孔 PCR 板（插槽 7 和 10）和两个用于液体废物的平底 96 孔板（插槽 8 和 11）。（B）放置实验室器皿后的甲板。（C）步骤8.8.1中机器人移液的示意图。该程序去除上清液，而无需从96孔PCR板底部吸出单个细胞。（D） 使用补充代码生成的可重复使用的单个细胞 1.请点击此处查看此图的大图。

9. 随机引物退火和延伸

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。以下步骤中的星号（*）表示磁选机可用于控制管中含有可重复使用的单细胞的聚丙烯酰胺珠的位置。但是，磁选机的使用不是必需的。通过沿着管壁缓慢向下移动移液器吸头，将磁珠向上推以进行洗涤或缓冲液交换。 时间: 9 小时

  1. 通过移液（*）除去矿物油，并用200μL的1x TP Mg（-）缓冲液洗涤（*）5次（用超纯水将10x TP Mg（-）缓冲液稀释至1x缓冲液，见 表1）。
  2. 除去上清液（*）并加入15μL退火缓冲液（见 表1）。
  3. 在冰上孵育1小时。
    注意:这种孵育的目的是透化血浆和核膜并将随机引物递送到细胞核。
  4. 将PCR管放在热循环仪上，并在94°C下加热3分钟。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积约为20μL，包括聚丙烯酰胺珠的体积。热循环仪盖的温度为105°C。
  5. 将试管转移到冰冷的金属块中并孵育2分钟。
  6. 加入 4 μL MgSO4/NaCl/dNTP 混合物（见 表 1），并与涡旋混合器以中速混合。
  7. 加入 1 μL Bst 聚合酶、大片段（参见 材料表），并使用涡旋混合器以中速混合。
  8. 在摇床上孵育4小时（4°C下600rpm）。
    注意:这种孵育的目的是将Bst聚合酶递送到细胞核。
  9. 将PCR管放在热循环仪上并运行以下程序之一。
    1. 运行4小时程序:10°C30分钟，20°C30分钟，25°C180分钟。
    2. 或者，运行过夜程序:4°C4小时，10°C2小时，20°C2小时，25°C4小时，并保持在4°C。
      注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积约为25μL，包括聚丙烯酰胺珠的体积。热循环仪盖的温度为105°C。 安全停止点:通过将可重复使用的单细胞储存在4°C，将实验停止在这里长达1天。

10. 抗体结合

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:1.5小时

  1. 加入 1.625 μL NaCl/EDTA/BSA 溶液（见 表 1），并通过低速涡旋混合。
    注意:此步骤旨在1）促进EDTA对Mg 2 +的螯合，2 ）通过300mM NaCl稳定扩展的第一随机 引物的结合，以及3）在随后的反应中使用牛血清白蛋白（BSA）阻断抗体的非特异性结合。
  2. 在冰上孵育1小时，加入每个抗体0.1μg/ mL，并与抗体探针偶联的对照IgG（在步骤5中制备）。
  3. 在冰上孵育过夜，在摇床上轻轻摇晃。

11. 抗体探针和近端延伸随机引物的邻近连接

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。以下步骤中的星号（*）表示磁选机可用于控制管中含有可重复使用单细胞的聚丙烯酰胺珠的位置。但是，磁选机的使用不是必需的。通过沿着管壁缓慢向下移动移液器吸头，可以将磁珠向上推以进行洗涤或缓冲液更换。 时间: 6 小时

  1. 用 200 μL 1x TPM-T 缓冲液（每次洗涤孵育 20 分钟）在冰上洗涤 （*） 两次。用超纯水稀释10x TPM-T缓冲液（三盐酸/氯化钾/硫酸镁/Triton X-100）至1x）。
  2. 除去（*）上清液并用1x T4 DNA连接酶缓冲液洗涤（*）一次（参见 材料表）。
  3. 除去（*）上清液并加入19μL连接适配器溶液（见 表1）。
  4. 在25°C孵育1小时。
  5. 加入 1 μL T4 DNA 连接酶（参见 材料表），并在涡旋混合器上以中速混合管。
  6. 将管放在热循环仪上并运行以下程序:邻近连接程序，在16°C下4小时，在25°C下30分钟。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积约为25μL，包括聚丙烯酰胺珠的体积。热循环仪盖的温度为室温。
  7. 用 200 μL 1x Bst Mg（-） EDTA（+） 缓冲液短暂洗涤 （*） 两次（参见 表 1;从 10x 储备缓冲液制备 1x 缓冲液），并将细胞储存在 4 °C 下过夜。 安全停止点:通过将可重复使用的单细胞储存在4°C下，在这里停止实验长达1天。

12. 第一次随机引物的完全扩展

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间: 4.5小时

  1. 用 200 μL 1x Bst Mg（-） EDTA（-） 缓冲液洗涤两次（参见表 1，从 10x 储备缓冲液制备 1x 缓冲液），除去上清液，加入 20 μL Bst/dNTP/MgSO4 混合物（见表 1）。
  2. 与涡旋混合器以中速混合，并在轨道振荡器（6°C和500rpm）上孵育4小时。
  3. 将管放在热循环仪上并运行以下程序:完全延伸程序:10°C1小时，20°C1小时，30°C1小时，40°C1小时，50°C1小时，65°C1小时，94°C10分钟，并保持在4°C。
    注意: 安全停止点:通过将可重复使用的单细胞储存在4°C，实验可以在此处停止长达1天。

13. 多位移放大

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:2.5小时（13.1-13.2步长）+15分钟（13.3-13.4步）+1天（13.5-13.10步）

  1. 加入 0.4 μL 100 μM 第 2个 随机引物（参见 表 3），并与涡旋混合器以中速混合。
  2. 在轨道振荡器上以6°C和500rpm孵育2小时，并将管放在热循环仪上并在94°C下加热3分钟。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积约为25.4μL，包括聚丙烯酰胺珠的体积。热循环仪盖的温度为105°C。
  3. 将试管放入冰冷的金属块中，并加入 1 μL/管的 Bst DNA 聚合酶。
  4. 以低速涡旋，将管子放在热循环仪上，然后运行以下程序:
    4°C4小时，10°C30分钟，20°C30分钟，30°C30分钟，40°C30分钟，50°C30分钟，65°C60分钟，94°C3分钟，并保持在4°C。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积约为26.4μL，包括聚丙烯酰胺珠的体积。热循环仪盖的温度为105°C。 安全停止点:通过将可重复使用的单细胞储存在4°C，将实验停止在这里长达1天。
  5. 收集上清液（约20μL），并将其转移到PCR管中。
  6. 将收集的上清液储存在-80°C。
  7. 将 20 μL/管的 0.05% 吐温 20/0.1x TE 缓冲液加入包含可重复使用单细胞的 PCR 管中（参见 表 1），并将可重复使用的单细胞在 4 °C 下孵育过夜。 安全停止点:通过延长孵育时间，将实验停止几天。
  8. 收集上清液并将上清液与步骤13.5收集的样品合并。
  9. 再次重复步骤 13.7-13.8。将可重复使用的单细胞浸泡在50%甘油/ 5mM EDTA / 0.5%BSA / 0.05%吐温20 / TBS缓冲液中，并在轨道振荡器（4°C，600rpm）上孵育30分钟。将可重复使用的单细胞储存在-20°C直至下一次实验。
  10. 加入 40 μL Exo- 预混液（见 表 1），将试管放在热循环仪上并运行以下程序:i） 95 °C 5 分钟，ii） 95 °C 30 秒，iii） 60 °C 30 秒，iv） 72 °C 30 秒，v） 重复步骤 ii-iv 19 次，vi） 72 °C 5 分钟， vii）保持在4°C。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积约为45μL，包括聚丙烯酰胺珠的体积。热循环仪盖的温度为105°C。 安全停止点:通过将样品储存在-80°C，实验可以在这里停止至少几天。

14. 苯酚-氯仿纯化及聚乙二醇沉淀

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:1.5小时

  1. 将产物转移到 0.5 mL DNA 低结合管中，加入 100 μL 苯酚:氯仿:异戊醇。
    注意:苯酚:氯仿:异戊醇会引起刺激，并可能因接触而灼伤。戴上手套、护目镜和实验室外套。仅在充分通风的情况下使用，或佩戴适当的呼吸器。遵循机构安全准则。根据机构指南丢弃用过的实验室器具。
  2. 用手摇动30秒，并在4°C下以12，000× g 离心10分钟。
  3. 将水相 （80 μL） 收集到 0.5 mL DNA 低结合管中，并加入 40.84 μL/管的线性丙烯酰胺/MgCl2 混合物（见 表 1）。
  4. 加入 47.06 μL/管的 50% （w/v） PEG8000（无核糖核酸酶）并通过移液混合。
  5. 在室温下孵育20分钟，并在室温下以240× g 离心10分钟。
  6. 除去上清液并加入 400 μL/管的 80% 乙醇 （EtOH）。
  7. 用80%EtOH洗涤，使用吸气器除去上清液，然后风干沉淀。
  8. 用 20 μL 1 mM EDTA/10 mM Tris-HCl、pH 7.4 缓冲液悬浮沉淀，并将溶液储存在 -80 °C。
    注意:使用双链DNA特异性插层染料测量DNA浓度（参见 材料表）。 安全停止点:实验可以在这里安全停止至少一周。

15. 体外 转录

注意:以下程序在干净的罩下进行，以避免DNase和RNase污染。 时间: 5 小时

  1. 解冻单细胞衍生产物的DNA（来自步骤14），并通过混合2μL/细胞的DNA产物（总体积20μL）来制备单细胞衍生产物的混合文库。
  2. 加入 26 μL 体外 转录预混液（参见 材料表 和制造商的方案）并通过移液混合。
  3. 将PCR管放在热循环仪上，并在37°C下孵育4小时。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积为46μL。热循环仪盖的温度为105°C。
  4. 加入 5 μL 10x 脱氧核糖核酸酶 I 缓冲液（参见材料表）并加入 4 μL 脱氧核糖核酸酶 I（不含 RNase，4 U，参见材料表）。
  5. 混合并在37°C下孵育15分钟，然后将样品转移到0.5mL管中。
  6. 加入 300 μL/管硫氰酸胍-苯酚-氯仿（参见 材料表），并通过温和涡旋混合。
    注意:硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿可通过接触导致严重的化学灼伤。戴上手套、护目镜和实验室外套。仅在充分通风的情况下使用或佩戴适当的呼吸器。遵循机构安全准则。根据机构指南丢弃用过的实验室器具。
  7. 在摇床上在R.T.孵育5分钟，然后将样品在-80°C下储存长达3天。
    注意: 安全停止点:实验可以安全地停止长达 3 天。

16. 核糖核酸纯化

注意:以下程序在干净的罩下进行，以避免DNase和RNase污染。 时间: 2 小时

  1. 向步骤15.7的样品中加入80μL /管氯仿，并用手剧烈摇动试管15秒。
  2. 在室温下孵育2-15分钟，并在4°C下以12，000× g 离心样品15分钟。
  3. 收集样品的水相（~200 μL）并将其转移到新的1.5 mL管中。
  4. 加入 600 μL/管硫氰酸胍-苯酚-氯仿，并将样品转移到 1.5 mL 管中。
  5. 加入180μL/管氯仿，用手剧烈摇动试管15秒。
  6. 将样品在4°C下以12，000× g 离心10分钟。
  7. 收集样品的水相（~450 μL）并将其转移到1.5 mL管中。
  8. 向水相中加入 60 μL/管线性丙烯酰胺 （5 μg/μL），并向水相中加入 400 μL/管 100% 异丙醇。
  9. 将管在室温下孵育10分钟，并在4°C下以12，000× g 离心10分钟。
  10. 小心地取出上清液。
  11. 用 200 μL 75% 乙醇（不含 EtOH/RNase 的水）洗涤 RNA 沉淀 3 次，除去上清液，风干 RNA 沉淀。
    注意:不要让RNA完全干燥，因为沉淀会失去溶解度。
  12. 将 RNA 沉淀重悬于含有 RNase 抑制剂 （1 μL/20 μL） 的 20 μL 无 RNase 水中，并通过移液溶解沉淀。
  13. 测量260nm处的吸光度。

17. 逆转录

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:1小时

  1. 加入 7 μL/管的逆转录引物 + dNTP 混合物（参见表 1 和 表 3），并将试管放在热循环仪上。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积为27μL。热循环仪盖的温度为105°C。
  2. 在65°C下加热5分钟，并将管子放在冰上至少1分钟。
  3. 加入 14 μL/管的逆转录酶预混液（见 表 1）并通过移液混合。
  4. 将试管放在热循环仪上，并在55°C孵育10分钟，然后在80°C孵育10分钟。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积为60μL。热循环仪盖的温度为105°C。

18. 第二链合成

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:2.5小时

  1. 加入 40 μL/管超纯水，将 100 μL 溶液分成两个 0.2 mL PCR 管（50 μL/管）。
  2. 加入60μL/管的第二链合成混合物（见 表1），并将试管放在热循环仪上并运行以下程序:i）95°C5分钟，ii）95°C30秒，iii）60°C30秒，iv）72°C30秒，v）重复步骤ii-iv20次，vi）保持在4°C。
    注意:试管尺寸为 0.2 mL。溶液的体积为110μL。热循环仪盖的温度为105°C。
  3. 加入 4.4 μL/管的 0.5 M EDTA（最终 20 mM），并在 -80 °C 下储存过夜。
    注意: 安全停止点:实验可以安全地停止长达几天。
  4. 通过苯酚-氯仿纯化和聚乙二醇沉淀纯化DNA（如步骤14中所述）。
    注意: 安全停止点:实验可以安全地停止至少一周。

19. 限制性内切酶的酶切和大小选择

注意:以下程序在干净的罩子下执行，以避免DNase污染。 时间:3小时（步骤19.1-19.7）

  1. 通过测量260nm处的吸光度来测量纯化DNA的DNA浓度（从步骤18.4开始）。
  2. 将 6 μg DNA 转移到 PCR 管中，加入 30 μL 10x 消化缓冲液，并用超纯水将体积调节至 294 μL。
  3. 加入6μLBciVI限制性内切酶，并在37°C下孵育1小时。
  4. 用线性聚丙烯酰胺进行EtOH沉淀。
    1. 加入 60 μL/管的 3 M 乙酸钠 （pH 5.2），然后加入 40 μL/管的线性丙烯酰胺（5 mg/mL，参见 材料表）。
    2. 加入 400 μL/管的 EtOH，并在 -20 °C 下孵育过夜。
      注意: 安全停止点:实验可以在这里安全停止一天。
    3. 在4°C下离心12，000× g10 分钟并除去上清液。
    4. 用80%EtOH清洗沉淀两次，然后干燥颗粒。
    5. 用 20 μL 1xTE 缓冲液溶解沉淀，并加入 4 μL/管新鲜的 6x 凝胶上样缓冲液。
  5. 将样品加载到5%琼脂糖凝胶/ 0.5x TAE缓冲液中并进行电泳（50 V，40分钟）。
  6. 切割并收集超过 50 bp 的凝胶（见 图 6），并使用凝胶提取试剂盒提取 DNA。
    注意: 安全停止点:实验可以安全地停止至少一周。
  7. 使用DNA文库制备试剂盒构建测序文库（参见 材料表）16，17。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用步骤8中描述的方案生成K562单细胞（见 图5）。单细胞嵌入聚丙烯酰胺珠的外层。使用插入器染料对细胞DNA进行染色和可视化。

figure-results-1
图 5:生成的可重复使用的单个细胞。 用用于DNA的插层染料（绿色荧光）对细胞进行染色。白色箭头表示嵌入聚丙烯酰胺珠外层的单个细胞。将可重复使用的单细胞放置在96孔平底板中。图像由扫描显微镜BZ-X710拍摄。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看此图的大图。

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了最近报道的使用可重复使用的单细胞7进行单细胞多表观基因组分析的分步方案。在随后的段落中，我们将讨论关键点，强调协议中的潜在限制。

整个协议（从步骤7.2-13开始）的关键点之一是避免DNase污染。单个细胞只有两个基因组DNA拷贝。因此，破坏基因组DNA会严重减少信号数量。避免DNA酶污染对于保护基因组DNA的完整性至关重要。

试剂在整个方案中穿过细胞膜/细胞壁的渗透性也至关重要。REpi-seq旨在在单细胞水平上分析小鼠和人类细胞的表观基因组。预计该实验方法的最佳条件将根据细胞类型和核膜对每种试剂的渗透性而变化。因此，当将该方法应用于小鼠和人类细胞以外的细胞（如植物细胞、酵母和细菌）时，每一步的条件都需要优化。

我们认为，特定于步骤9.5（退火第一个随机引物）的关键点是基因组DNA变性后的快速冷却速度。变性后缓慢和逐渐冷却可能会降低与基因组DNA结合的随机引物的退火效率。此外，在步骤11（邻近连接）中，一个...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ohnuki博士和Tosato博士是题为"制备可重复使用单细胞的方法和分析单细胞表观基因组，转录组和基因组的方法"的专利（EP3619307和US20200102604）的共同发明人。专利申请部分是基于与当前手稿中描述的技术相关的初步结果提交的。本专利申请中描述和要求保护的发明是在发明人是美国政府的全职雇员时进行的。因此，根据 45 联邦法规第 7 部分，该专利申请的所有权利、所有权和利益已经或应该依法转让给美国政府。美国政府根据 15 美国法典 § 3710c 将其收到的部分特许权使用费转让给其雇员发明人。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢David Sanchez-Martin博士和Christopher B. Buck博士在项目概念化阶段的评论。我们还要感谢基因组学核心，癌症研究中心，国家癌症研究所，美国国立卫生研究院在初步实验中的帮助，以及协作生物信息学资源，CCR，NCI，NIH在计算分析方面的建议。我们感谢Anna Word女士帮助优化该方法中使用的DNA聚合酶。这项工作利用了NIHHPC生物武夫集群（http://hpc.nih.gov）的计算资源。该项目得到了癌症研究中心，国家癌症研究所，国立卫生研究院的校内计划，NCI主任创新奖（#397172）以及国家癌症研究所的联邦资金的支持，合同号为HHSN261200800001E。我们感谢Tom Misteli，Carol Thiele，Douglas R. Lowy博士以及细胞肿瘤学实验室的所有成员的富有成效的评论。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x CutSmart 缓冲液New England BioLabsB600410x 消化缓冲液
200 标准乙醇Warner-Graham Company200 标准乙醇
5-羟甲基胞嘧啶 （5-hmC） 单克隆抗体 [HMC/4D9]EpigentekA-1018-100抗 5hmC
吖啶橙/碘化丙啶染料Logos BiosystemsF23001细胞计数器
丙烯酰胺溶液，40% H2O 溶液，用于分子生物学MilliporeSigma01697-500ML40% 丙烯酰胺溶液
一体化荧光显微镜 BZ-X710KeyenceBZ-X710扫描显微镜
Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置MilliporeSigmaUFC510024超滤盒
分子生物学的过硫酸铵MilliporeSigmaA3678-100G过硫酸铵粉末
无水 DMF载体实验室S-4001-005无水 N，N-二甲基甲酰胺 （DMF）
抗 RNA 聚合酶 II CTD 重复 YSPTSPS（磷酸化 S5）抗体 [4H8]Abcamab5408抗 Pol II
抗 TRAP220/MED1（磷酸化 T1457）抗体Abcamab60950抗 Med1
BciVI抗体New England BioLabsR0596LBciVI
牛血清白蛋白溶液，20 mg/mL，溶于 H2O 中，低生物负荷，无蛋白酶，用于分子生物学MilliporeSigmaB8667-5ML20% BSA（表 7）
Bst DNA 聚合酶，大片段New England BioLabsM0275LBst DNA 聚合酶
BT10 系列 10 和微量;l 屏障尖端NEPTUNEBT10P10 低吸附尖端
CellCelector自动化实验室解决方案N/A自动单细胞挑取机器人
用于单细胞克隆的 4 nl 纳米孔板，板 S200-100 100K，24 孔，ULA自动化实验室解决方案CC00794 nL 纳米孔板
氯仿MilliporeSigmaChloroform
康宁 Costar 96 孔，细胞培养处理，平底微孔板康宁3596平底 96 孔板
深通气 （exo-） DNA 聚合酶New England BioLabsM0259L< 外> DNA 聚合酶
DNA LoBind 管，0.5 mLEppendorf301080350.5 mL DNA 低结合管
DNA 寡核苷酸，第 1 次随机引物集成 DNA 技术N/A，见表 3第 1 个随机引物
DNA Oligo，第 2 个随机引物 Cell#01Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 个随机引物
DNA Oligo，第 2 个随机引物 Cell#02Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 个随机引物
DNA Oligo，第 2 个随机引物 Cell#03Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 个随机引物
DNA 寡核苷酸，第 2 种随机引物 细胞#04集成 DNA 技术不适用，见表 3第 2 种随机引物
DNA 寡核苷酸，第 2 种随机引物 细胞#05集成 DNA 技术不适用，见表 3第 2 种随机引物
DNA 寡核苷酸，第 2 种随机引物 细胞#06集成 DNA 技术不适用，见表 3第 2 种随机引物
DNA 寡核苷酸， 第 2 次随机引物 Cell#07Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 次随机引物
DNA Oligo，第 2 次随机引物 Cell#08Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 次随机引物
DNA Oligo，第 2 次随机引物 Cell#09Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 次随机引物
DNA Oligo，第 2 次随机引物 Cell#10Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 个随机引物
DNA Oligo，第 2 个随机引物 Cell#11Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 个随机引物
DNA Oligo，第 2 个随机引物 Cell#12Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3 第 2个随机引物
DNA Oligo，第 2 个合成引物Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3第 2 个合成引物
DNA 寡核苷酸，连接接头Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3连接接头
DNA Oligo，逆转录引物Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3逆转录引物
DNase I（无 RNase）New England BioLabsM0303LDNase I（无 RNase，4 U）。
DNase I 反应缓冲液New England BioLabsB0303S10x DNase I 缓冲液 （NEB）
dNTP 混合物（每个 10 mM）Thermo FisherR019210 mM dNTPs
胎牛血清，美国来源，热灭活MilliporeSigmaF4135-500ML胎牛血清
HiScribe T7 高产量 RNA 合成试剂盒New England BioLabsE2040S体外转录预混液
组蛋白 H3K27ac 抗体活性基序39133抗 H3K27ac
组蛋白 H3K27me3 抗体活性基序39155抗 H3K27me3
IgGMillipore SigmaI5006-10MG对照 IgG
氧化铁（II，III）磁性纳米粉末，30 nm 平均部件大小 （TEM），NHS 酯功能化MilliporeSigma747467-1GNHS 酯功能化 30 nm 氧化铁粉
K-562美国典型培养物保藏中心 （ATCC）CCL-243细胞
线性丙烯酰胺 （5 mg/mL）Thermo FisherAM9520线性丙烯酰胺
LUNA-FL 双荧光细胞计数仪Logos BiosystemsL20001细胞计数
仪 LUNA 细胞计数玻片，50 张玻片Logos BiosystemsL12001细胞计数仪
矿物油，生物试剂，用于分子生物学，轻油MilliporeSigmaM5904-500ML矿物油
N，N，N′，N′-用于分子生物学的四甲基乙二胺MilliporeSigmaT7024-100MLN，N，N′，N′-四甲基乙二胺
NaCl （5 M），不含 RNase的赛默飞世尔AM9760G5M NaCl
NanoDrop LiteThermo Fisher2516 微量分光光度计
NEST 2 mL 96 孔深孔板，V 形底OpentronsN/A2 mL 深孔 96 孔板
无裙边 96 孔 PCR 板Genesee Scientific27-40596 孔 PCR 板
NuSive GTG 琼脂糖Lonza50081琼脂糖
OmniPur 丙烯酰胺：双丙烯酰胺 19：1,40% 溶液MilliporeSigma1300-500ML40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺
OT-2实验室机器人OpentronsOT2自动液体处理机器人
多聚甲醛，EM级，纯化，20%水溶液电子显微镜科学1571320%石蜡醛
PBS（10x），pH 7.4Thermo Fisher7001104410x PBS
PIPETMAN Classic P1000GILSONF123602A P1000移液器
蛋白 LoBind 管，1.5 mLEppendorf9250000901.5 mL 蛋白低结合管
QIAgen 凝胶提取试剂盒Qiagen28706A P1000 移液器
Quant-iT PicoGreen dsDNA 检测Thermo FisherP11495 dsDNA 特异性嵌入染料
快速连接试剂盒New England BioLabsM2200LT4 DNA 连接酶 （NEB）
RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂Thermo Fisher10777019RNAse 抑制剂
S-4FB 交联剂（DMF 可溶性）载体实验室S-1004-105琥珀酰亚胺 4-甲酰苯甲酸酯 （S-4FB）
S-HyNic载体实验室S-1002-105琥珀酰亚胺 6-肼壬烟酸酯丙酮腙 （S-HyNic）
乙酸钠，3 M，pH 5.2，分子生物学级MilliporeSigma567422-100ML3M 乙酸钠 （pH 5.2）
碳酸氢钠，1M 缓冲液，pH 8.5Alfa AesarJ604081M 碳酸氢钠缓冲液，pH 8.5
用于分子生物学的磷酸氢二钠MilliporeSigmaS3264-250G用于分子生物学的磷酸二氢钠 Na2HPO4
MilliporeSigmaS3139-250GNaH2PO4
SuperScript IV 逆转录酶Thermo Fisher18090050逆转录酶
SYBR Gold 核酸凝胶染料（10,000x 浓缩液，溶于 DMSO 中）Thermo FisherS11494插层染料
DNA 连接酶反应缓冲液New England BioLabsB0202S10x T4 DNA 连接酶反应缓冲液
ThermoPol 反应缓冲液New England BioLabsB9004S10x TPM-T 缓冲液（Tris-HCl/氯化钾/硫酸镁/Triton X-100）
TRIzol LS 试剂Thermo Fisher10296-028硫氰酸鸟 - 苯酚 - 氯仿提取
TruSeq Nano DNA 文库制备试剂盒Illumina20015965A DNA 文库制备试剂盒（另见制造商的说明）
Ultramer DNA Oligo，Anti-5hmC_Ab#005Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3用于抗体的胺修饰 DNA
探针 Ultramer DNA Oligo，Anti-H3K27ac_Ab#002Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3用于抗体
的胺修饰 DNA 探针Ultramer DNA Oligo，抗 H3K27me3_Ab#003Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3用于抗体的胺修饰 DNA
探针 Ultramer DNA Oligo，抗 Med1_Ab#004Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3用于抗体的胺修饰的 DNA 探针
Ultramer DNA Oligo，抗 Pol II_Ab#006Integrated DNA TechnologiesN/A，见表 3用于抗体的胺修饰 DNA 探针
Ultramer DNA Oligo，对照 IgG_Ab#001Integrated DNA Technologies，不适用，见表 3用于对照 IgG 的胺修饰 DNA 探针
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Thermo Fisher155750200.5 M EDTA，pH 8.0
UltraPure 蒸馏水Thermo Fisher10977023超纯水
Zeba Splin 脱盐柱，7K MWCO，0.5 mLThermo Fisher89882脱盐柱
用于 来自兔血清的试剂盒 DNA T4

References

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