本实验方案描述了在受控条件下通过溶剂法进行蛋白质沉淀，以在质谱分析前实现蛋白质组样品的高效、快速回收与纯化。
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本文内容
摘要
摘要
尽管质谱（MS）仪器的多项进展已改善了蛋白质组的定性和定量分析，但在质谱分析前采用更可靠的前端方法对蛋白质进行分离、富集和处理，对于成功的蛋白质组表征至关重要。蛋白质回收率低、回收量不一致以及表面活性剂等残留杂质均会对质谱分析产生不利影响。与其他样品前处理策略相比，蛋白质沉淀常被认为可靠性差、耗时且技术操作困难。通过采用优化的蛋白质沉淀方案，可克服上述问题。对于丙酮沉淀，特定盐类、温度控制、溶剂组成和沉淀时间的组合至关重要；而氯仿/甲醇/水沉淀的效率则依赖于正确的移液操作和离心管处理。此外，这些沉淀方案也可在一次性离心柱中实现流程简化和半自动化。本文展示了传统方式下基于溶剂的蛋白质沉淀以及使用一次性两步过滤与提取柱的预期结果，包括通过自下而上（bottom-up）LC-MS/MS分析对蛋白质组混合物进行的详细表征。同时，还展示了基于SDS的工作流程相较于无污染蛋白质样品所表现出的更优性能。
引言
由于现代质谱仪在灵敏度、分辨率、扫描速度和多功能性方面的提升，基于质谱的蛋白质组分析已变得日益严谨。质谱技术的进步显著提高了蛋白质鉴定效率和定量准确性1,2,3,4,5。随着质谱仪器性能的改进，研究人员对前端样品制备策略提出了更高要求，期望在整个工作流程的各个阶段均能以最短时间实现高纯度蛋白质的定量回收6,7,8,9,10,11。为了准确反映生物系统的蛋白质组状态，必须以高效且无偏倚的方式从原始样品基质中分离蛋白质。为此，在提取过程中加入变性表面活性剂（如十二烷基硫酸钠，SDS），可确保蛋白质的有效提取和溶解12。然而，SDS会对电喷雾离子化产生强烈干扰，若未被彻底去除，....
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方案
1. 材料考虑与样品预处理
- 仅使用高纯度溶剂（丙酮、氯仿、甲醇）（>99.5%）和化学试剂，无过量水分。
- 在水中配制氯化钠和硫酸锌溶液（1 M）。
注意：盐溶液可在室温下长期保存， 只要无污染物或微生物生长即可。 - 使用能够容纳所需样品和溶剂体积并诱导沉淀的最小规格聚丙烯（PP）微量离心管。
- 确保待沉淀样品中的SDS浓度不超过2%（w/v）。如果SDS浓度过高，用水稀释样品。
- 确保蛋白浓度在 0.01 至 10 g/L 之间，以获得最佳沉淀效率。
注意：沉淀反应的最佳蛋白质量范围为1-100 µg。 - 确保使用前所有溶剂和溶液均无颗粒物。可进行过滤处理（<0.5 µm）或离心步骤（10,000 x g 室温下离心1分钟，以去除未溶解的颗粒物。
- 如果需要进行二硫键还原和烷基化，请在蛋白质沉淀之前完成这些步骤。过量的还原剂和烷基化试剂将通过沉淀过程被去除。
- 通过选择并执行以下任一方案（步骤 2、3、4 或 5）使蛋白质沉淀。
2. 基于离心管的丙酮快速蛋白沉淀法
- 将90 µL（无颗粒）蛋白质或蛋白质组溶液移入一个聚丙烯（PP）微量离心管中，然后加入....
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结果
图4总结了使用丙酮在一次性滤芯中通过小瓶法或柱式辅助沉淀蛋白质后预期的SDS去除效果。将传统的丙酮中过夜孵育（-20 °C）与室温下的快速丙酮沉淀方案（步骤2）以及CMW沉淀法（步骤4）进行了比较。残留的SDS通过亚甲蓝活性物质（MBAS）测定法29进行定量。简言之，将100 µL样品与100 µL MBAS试剂（250 mg亚甲蓝，50 g硫酸钠，10 mL硫酸，加水定容至1.0 L）混合，随后加入400 µL氯仿，并在紫外/可见光分光光度计上测定有机层在651 nm处的吸光度。所有方法均能将SDS降低至适合进行理想质谱分析的水平。
通过快速丙酮沉淀和CMW沉淀，可实现定量且可重复的蛋白质回收，如图5中经处理的酵母全细胞裂解液的SDS-PAGE分析所示。在一次性过滤柱中进行沉淀，可避免在含有SDS的上清液中进行精细移液操作，同时使聚集的蛋白质保留在膜滤器上方。所有沉淀方案均获得一致的回收效果，在三次独立重复实验中，.......
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讨论
当残留的SDS浓度低于10 ppm时，可实现最佳的质谱表征效果。尽管其他方法（如FASP和磁珠上消化）能够实现定量去除SDS，但回收率存在差异31,32,33，而沉淀法的主要目标是同时最大化纯度和得率。这取决于能否在不扰动蛋白质沉淀物的前提下，有效分离上清液（含SDS）。在采用离心管进行沉淀时，当通过移液去除大部分上清液后，聚集的沉淀物意外丢失的风险会逐渐增加。因此，有必要保留较多的残余溶剂（约20 µL），并增加洗涤步骤34。洗涤步骤可稀释并去除管中的残余溶剂。特别是使用CMW时，一旦沉淀形成，无需对样品管进行涡旋振荡。剧烈震荡破坏沉淀物会增加因移液操作不当而导致样品丢失的风险。如果按照先前方案建议进行涡旋（vortexing）35，部分CMW沉淀物可能黏附在管盖内侧；再次离心后，沉淀物会固定在管盖上，可能导致约50%的样品损失。
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披露
Doucette 实验室提出了本研究中使用的 ProTrap XG 并为其申请了专利。AAD 也是 Proteoform Scientific 的创始合伙人，该公司实现了样品制备柱的商业化。
致谢
本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会资助。作者感谢加拿大滑铁卢市生物信息解决方案公司（Bioinformatics Solutions Inc.）以及加拿大多伦多市病童医院SPARC生物中心（分子分析部）在质谱数据获取方面的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙酮 | Fisher Scientific | AC177170010 | ≤0.002% 醛类 |
| 乙腈 | Fisher Scientific | A998-4 | HPLC 级 |
| 碳酸氢铵 | Millipore Sigma | A6141-1KG | 固体 |
| β-巯基乙醇 | Millipore Sigma | M3148-25ML | 分子生物学级 |
| 溴酚蓝 | Millipore Sigma | B8026-5G | 溴酚蓝钠盐 |
| 氯仿 | Fisher Scientific | C298-400 | 氯仿 |
| 甲酸 | Honeywell | 56302 | LC-MS 流动相添加剂 |
| Fusion Lumos 质谱仪 | ThermoFisher Scientific | 用于标准蛋白质混合物的分析 | |
| 甘油 | Millipore Sigma | 356352-1L-M | 分子生物学用，>99% |
| 异丙醇 | Fisher Scientific | A4641 | HPLC 级 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A452SK-4 | HPLC 级 |
| 微量离心机 | Fisher Scientific | 75-400-102 | 最高可达 21,000 ×g |
| 微量离心管（1.5 mL） | Fisher Scientific | 05-408-130 | 锥形底 |
| 微量离心管 （2 mL） | Fisher Scientific | 02-681-321 | 圆底 |
| 移液器吸头 （0.1–10 μL） | Fisher Scientific | 21-197-28 | 通用型移液吸头，非无菌 |
| 移液器吸头 （1–200 μL） | Fisher Scientific | 07-200-302 | 通用型移液吸头，非无菌 |
| 移液器吸头 （200–1000 μL） | Fisher Scientific | 07-200-303 | 通用型移液吸头，非无菌 |
| 微量移液器 | Fisher Scientific | 13-710-903 | 微量移液器三件套 |
| 胃蛋白酶 | Millipore Sigma | P0525000 | 冻干粉末， >3200 单位/mg |
| ProTrap XG | Proteoform Scientific | PXG-0002 | 每盒 50 个完整单元 |
| 氯化钠 | Millipore Sigma | S9888-1KG | ACS 试剂，>99% |
| 十二烷基硫酸钠 | ThermoFisher Scientific | 28312 | 粉末状固体 |
| timsTOF Pro 质谱仪 | Bruker | 用于肝脏蛋白质组提取物的分析 | |
| 三氟乙酸 | ThermoFisher Scientific | L06374.AP | 99% |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | 分子生物学级 |
| 胰蛋白酶 | Millipore Sigma | 9002-07-7 | 来源于牛胰腺，经 TPCK 处理 |
| 尿素 | Bio-Rad | 1610731 | 固体 |
| 水（去离子） | Sartorius Arium Mini 水纯化系统 | 76307-662 | 1 级超纯水（18.2 MΩ·cm） |
| 硫酸锌 | Millipore Sigma | 307491-100G | 固体 |
参考文献
- Kilpatrick, L. E., Kilpatrick, E. L. Optimizing high-resolution mass spectrometry for the identification of low-abundance post-translational modifications of intact proteins. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3255-3265 (2017).
- Scheffler, K., Viner, R., Damoc, E.
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