小鼠右冠状动脉永久性结扎诱导右心室心肌梗死的建立与表征

摘要

右心室与左心室之间存在多种差异，但右心室梗死（RVI）的病理生理机制尚未明确。本实验方案介绍了一种可重复的右心室梗死小鼠模型构建方法，该方法可能有助于阐明RVI的发生机制。

摘要

右心室梗死（RVI）是临床实践中常见的表现。严重的RVI可导致致命的血流动力学功能障碍和心律失常。与广泛使用的通过结扎左冠状动脉建立的小鼠心肌梗死（MI）模型相比，由于建模困难，RVI小鼠模型极少被采用。针对RVI引起右心室重构和功能障碍的机制及治疗研究，需要动物模型来模拟患者中RVI的病理生理过程。本研究介绍了一种在C57BL/6J小鼠中建立RVI模型的可行方法。此外，本研究从以下几个方面对该模型进行了表征：心肌梗死后24小时的梗死面积评估、通过超声心动图评估心脏重构和功能、右心室血流动力学评估，以及RVI后4周时梗死区域的组织学分析。另外，还进行了冠状血管铸型以观察右心室冠状动脉的分布情况。该RVI小鼠模型将有助于推动右心衰竭机制的研究，并为寻找右心室重构的新治疗靶点提供支持。

引言

长期以来，人们认为右心室（RV）只是一个与肺动脉相连的简单管道，因此在多年间被错误地忽视了¹。然而，近年来对右心室功能的兴趣日益增加，因为它在血流动力学紊乱中起着至关重要的作用^2,3，并可能作为心血管疾病的独立风险预测因子^4,5,6,7。右心室疾病包括右心室梗死（RVI）、肺动脉高压和瓣膜性疾病⁸。与对肺动脉高压的广泛关注相比，RVI 仍长期被忽视^7,9。

右心室梗死（RVI）通常伴随下壁-后壁心肌梗死^10,11，由右冠状动脉（RCA）闭塞引起。临床研究表明，严重的RVI可能引发血流动力学紊乱和心律失常，例如低血压、心动过缓和房室传导阻滞，与更高的住院期间发病率和死亡率相关^12,13,14。即使在无再灌注的情况下，右心室功能仍可在一定程度上自发恢复^15,16。左心室（LV）与右心室（RV）之间存在多种形态学和功能上的差异¹⁷。由于RVI后侧支循环形成更为广泛，RV被认为比LV对缺血更具耐受性⁸。阐明左心室梗死（LVI）与RVI之间的差异并识别其潜在机制，将为心脏再生和缺血性心力衰竭提供新的治疗靶点。然而，由于构建RVI小鼠模型存在困难 ，针对RVI的基础研究仍十分有限。

通过结扎猪的右冠状动脉（RCA）已建立了一种RVI的大动物模型¹⁸，由于RCA较为明显，该模型操作更为简便。与大动物模型相比，小鼠模型具有以下优势：基因操作更易实现、经济成本更低、实验周期更短^19,20。尽管既往已有研究报道了关注RVI对左心室（LV）功能影响的小鼠RVI模型，但该模型建立过程中的详细操作步骤、操作难点与关键环节，以及血流动力学变化等模型特征尚未被充分介绍^9,21。

本文提供了构建小鼠右心室梗死（RVI）模型的详细手术步骤。此外，通过超声心动图检测、有创血流动力学评估以及组织学分析对该模型进行了表征。进一步地，通过冠状血管铸型技术观察了右心室的冠状动脉分布情况。本文介绍的技术有助于初学者快速掌握小鼠RVI模型的制备方法，并实现可接受的手术死亡率和可靠的评估手段。小鼠RVI模型将有助于研究右心衰竭的机制，并探索右心室重构的新治疗靶点。

方案

所有操作均按照美国国立卫生研究院（NIH）出版的《实验动物护理与使用指南》（NIH出版号85-23，1996年修订版）进行，并经南方医科大学南方医院（中国广州）动物伦理委员会批准。健康雄性C57BL/6J小鼠（8-10周龄，体重25-30 g）购自南方医科大学动物中心。雌性小鼠也可使用，但由于性别差异可能带来的影响，不建议混合使用两种性别。小鼠到达后，在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养（每笼3-4只），自由摄食和饮水。

1. 手术准备

1. 手术前通过高压灭菌器对手术器械进行灭菌 。将加热垫调节至 37 °C。
2. 通过腹腔注射 50 mg/kg 的戊巴比妥钠（见材料表）对小鼠进行麻醉，以缓解手术疼痛。将小鼠分别放入独立的盒子中以诱导麻醉。通过检查趾部回缩反应是否消失来确认麻醉深度。
   注意：也建议使用 1.5% 异氟烷进行吸入麻醉，因其镇痛效果更佳。
3. 用缝线固定小鼠的门齿，并用胶带固定其四肢，使其仰卧于垫上。再次通过检查反射确认麻醉深度。
4. 使用脱毛膏去除从颈部至剑突区域的毛发。交替使用消毒液和 75% 酒精对术区进行三次消毒， 然后铺巾覆盖手术区域。
5. 按照以下步骤进行气管插管：
   1. 使用微型呼吸机（见材料表）将动物的呼吸频率调节至 150 次/分钟，潮气量调节至 300 µL。
      ​注意：无需使用呼气末正压模式。
   2. 用镊子轻轻拉出舌头，用压舌板抬起下颌以暴露声门，并将 22 G 套管插入声门完成气管内插管。
   3. 打开微型呼吸机，并将气管套管连接至呼吸机。当胸壁起伏频率与呼吸机频率一致时，表明插管成功。用胶带固定套管，防止术中滑脱。

2. 右冠状动脉的永久性结扎

1. 正确将心电图（ECG）电极（参见材料表）连接至小鼠四肢，并记录心电图。
   注意：从II、III或AVF导联中选择其中一个作为监测导联；其中III导联更为合适。
2. 打开胸腔。
   1. 使用眼科剪在右侧第3肋骨平行位置的皮肤上做一个长约1 cm的切口。再次确认第3肋间隙，并根据胸骨角确定足够的操作空间。
      注意：皮肤切口方向应从胸骨角向右前腋线延伸。
   2. 使用剪刀和显微镊子分离并剪开第3肋间隙上方的胸大肌和胸小肌。随后，用弯头镊子钝性分离肋间肌，以暴露手术视野。
      注意：仅需剪开少量胸肌组织，之后建议采用钝性分离方式以暴露心脏。
   3. 切开心包膜。用无菌棉签提起右心耳，使用无菌8-0 尼龙缝线对右冠状动脉（RCA）进行结扎，结扎范围为3–5 mm。结扎RCA后，监测导联心电图（III导联）显示ST段抬高。 
      注意：由于小鼠的右冠状动脉不可见，必须仔细确认其解剖位置。右心室心肌远薄于左心室心肌，因此难以掌握进针深度。若进针过深或结扎范围过大，容易诱发窦性心动过缓和房室传导阻滞。
3. 移除无菌棉签，使用无菌5-0尼龙缝线缝合肌肉和皮肤，关闭肋间切口。  再次用75%酒精消毒皮肤， 术后将小鼠单独饲养。 
   注意：良好的肌肉缝合对于预防气胸至关重要。可在胸腔内留置无菌引流管直至关胸完成，随后通过注射器连接引流管抽吸胸腔气体。
   注意：术后小鼠应置于加热 垫上保温。需给予镇痛药物（如布托啡诺，0.1 mg/kg体重，皮下注射），以减轻动物术后疼痛。术后可能出现的并发症包括窦性心动过缓和房室传导阻滞，术后死亡率约为10–20%。

3. 术后右心室功能的超声心动图评估

注意：进行超声心动图检查时，使用中心频率为 30 MHz 的 MS400D 探头，并连接至高分辨率超声成像系统（参见材料表）。超声心动图检查在手术后 4 周进行。

1. 用3%异氟烷麻醉小鼠 通过 吸入
2. 将小鼠仰卧位固定于动物固定及超声操作用超声平台上。将其爪子用胶带固定于电极上，通过连接至超声仪的系统记录心电图。
3. 通过心电图监测心率，并通过将麻醉剂浓度调整至1.5%至3%之间，使心率维持在450-550次/分钟。
4. 用脱毛膏去除小鼠胸部的毛发，并在胸部皮肤上涂抹超声耦合剂。
5. 将平台调至水平位置。使换能器与左腿平行，获取左心室长轴图像。顺时针旋转探头90°，获取左心室短轴切面。按下 动态影像存储 单击按钮以保存图像。
   注意：平台的左上角处于最低点。在将探头朝向小鼠右肩的同时，保持探头的左心室短轴旋转角度不变。
6. 将换能器沿垂直方向向下移动，保持其位于小鼠上腹部及膈肌下方的位置 B型超声模式轻微旋转平台的 x 轴和 y 轴以调整其位置，直至屏幕上清晰显示右心室（RV）、右心房（RA）、左心房（LA）和左心室（LV）。按下按钮保存心尖四腔切面图像 动态影像存储 或 帧存储器 按钮
   注意：B 模式用于显示心脏的二维（2D）图像。
7. 按压 M型超声模式；当出现2倍指示线后，将指示线定位至三尖瓣口，以获取三尖瓣环平面的运动。按下 动态影像存储 或 帧存储 用于保存数据和图像的按钮。
   注：M 型指运动模式，以曲线形式显示心脏或血管的运动。
8. 按压 测量 按钮以进入测量模式。单击 面积测量 点击按钮以聚焦右心室（RV）和左心室（LV）。计算RV和LV的面积，得到RV与LV的面积比值。
   1. 点击 时间线 按钮，绘制两条基线以定义三尖瓣环平面在收缩期和舒张期的心动周期中的运动范围。点击 距离 按下按钮并测量两条基线之间的距离，以获得三尖瓣环平面收缩期位移（TAPSE）。
9. 将平台左侧倾斜至最低点。保持探头与右侧腋前线水平轴成30°角。旋转平台的x轴和y轴以显示右心室（RV）。
   1. 按压 M型超声 按钮，并将指示线定位在室间隔的强回声点处，以获取右心室界面的M型图像。按下 动态影像存储 单击按钮以保存图片。
10. 打开右心室界面的M型图像，按下 测量 按下按钮进入测量模式。使用超声心动图系统内置的测量工具，测量舒张末期右心室内径（RVIDd）、右心室射血分数（RVEF）和右心室缩短分数（RVFS）。
11. 停止异氟烷给药，将小鼠置于加热垫上3-5分钟，直至其恢复意识。随后，将小鼠放回饲养笼，维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。

4. 右心室血流动力学的侵入性测量

注意：在 RVI 后 4 周通过右心导管术评估右心室血流动力学。使用 1.0 F 导管并连接监测系统。

1. 通过腹腔注射 50 mg/kg 的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉（参见 材料表）。
2. 确认足底回缩反射消失后，将小鼠保持仰卧位，并用胶带固定。
3. 剃除从胸骨角至剑突区域的胸部毛发，用 75% 酒精对术区进行消毒。
4. 进行气管插管，并按照步骤 1.5.2–1.5.3 中所述设置动物呼吸机参数。
5. 在剑突上方皮肤做一长约 1 cm 的双侧切口，使用眼科剪剪断膈肌和肋骨，以暴露心脏。
6. 用 32 G 针头穿刺右心室游离壁。拔出针头后，用棉球按压穿刺部位以止血。
7. 将导管尖端经穿刺点插入右心室，并缓慢向前推进导管。调整导管尖端位置，直至在监测器和记录系统上观察到典型的右心室压力波形。
   注：右颈静脉也是进行血流动力学测量的合适途径。
8. 稳定 10 分钟后，记录右心室收缩压（RVSBP）、右心室舒张末期压（RVEDP）和右心室 dP/dt。点击 选择 按钮以选取用于计算的心动周期，然后点击 分析 按钮，计算所选周期的平均值。
9. 记录完成后取出导管，并将其置于生理盐水中保存。
10. 通过腹腔注射过量戊巴比妥钠（150 mg/kg）处死小鼠，随后采用颈椎脱臼法进行安乐死。
11. 采集心脏和胫骨用于组织学分析。

5. 使用血管铸型剂进行冠状血管铸型

1. 通过腹腔注射每公斤体重2000 IU的肝素钠（200 IU/mL）对小鼠进行肝素化处理（参见材料表）。
2. 通过腹腔注射每公斤体重50 mg的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。
3. 将动物仰卧位固定于垫上，并按照步骤1.5.2–1.5.3进行气管插管以实施人工通气。
4. 按步骤4.5所述方法使用手术剪打开胸腔，暴露心脏。
5. 使用眼科剪在右心房处剪出一个3 mm的切口，通过注射器从心尖部注入5 mL生理盐水对心脏进行灌注。
6. 使用主动脉夹阻断主动脉血流，再通过注射器从心尖部注入0.1 mL硝酸甘油（1 mg/mL），以扩张冠状动脉。
7. 按照生产商说明书中的要求混合试剂盒中的组分，制备铸型试剂（参见材料表）。
   注意：建议同时制备铸型试剂，并提前用生理盐水和硝酸甘油进行灌注，以防止微血管闭合。
8. 通过注射器从心尖部向心脏灌注1 mL铸型试剂，随后静置2–3小时。
9. 用50%氢氧化钠腐蚀心脏组织2–3天，并用生理盐水冲洗以去除心肌组织或结缔组织。
10. 在显微镜下拍照记录。
    警告：铸型试剂对眼睛、皮肤和呼吸道有害；氢氧化钠具有腐蚀性。操作时必须佩戴防护手套、护目镜和实验服，且铸型试剂的配制必须在通风橱中进行。

结果

在本研究中，小鼠被随机分配至右心室梗死组（RVI，n = 11）和假手术组（n = 11）。两个正常小鼠心脏的冠状动脉铸型如图1A所示。右冠状动脉结扎后，心电图III导联出现ST段抬高（图1B）。此外，2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色显示，术后24小时梗死区域占右心室游离壁的45%（图1C,D）。上述数据表明成功建立了RVI小鼠模型。

4腔心尖切面的记录（图2A）以及左心室短轴的双腔观及其相应的M型超声心动图（图2B术后4周进行超声心动图检查以评估右心室（RV）重构和功能。与假手术组相比，右心室梗死（RVI）组的舒张末期右心室内径（RVIDd）增大（图2C），且是假手术组的2倍以上（<...

讨论

Sicard 及其法国同事于 2019 年首次报道了一种 RVI 小鼠模型，描述了手术过程，并重点研究了 RVI 后左心室（LV）与右心室（RV）之间的相互作用⁹。然而，迄今为止，尚无研究报道利用该模型开展进一步研究。更详细的实验操作流程将有助于研究人员使用 RVI 小鼠模型进行探索。与 Sicard 等人⁹的报道相比，我们提供了模型构建的逐步操作信息、质量控制策略，并进一步评估了右冠状动脉（RCA）的解剖分布、右心室血流动力学以及梗死区域心肌细胞的存活情况。最近一项研究表明，梗死区域的心肌细胞在心肌再生过程中发挥着关键作用²³。RVI 患者的右心室功能可在 3 至 12 个月内自发恢复，即使未进行再灌注治疗^16,24。这些发现提示，RVI 小鼠模型将有助于寻找右心衰竭或心脏再生的潜在治疗靶点。因此，推广该模型十分必要。

由...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma	T8877	用于 TTC 染色
动物微型呼吸机	Havard	型号 845	用于人工通气
动物超声系统 VEVO2100	Visual Sonic	VEVO2100	用于多普勒血流速度和动脉粥样硬化斑块的测量
Batson’s #17 解剖腐蚀试剂盒	Polyscience Inc	7349	用于血管铸型
丁丙诺啡	Isoreag	1134630-70-8	用于减轻小鼠术后疼痛
C57BL/6J 小鼠 + D29A1A2:D27	南方医科大学动物中心	-	用于建立小鼠 RVI 模型
相机	Sangnond		用于拍照
冷光源照明器	Olympus	ILD-2	手术照明
心电图仪	ADI Instrument	ADAS1000	用于记录心电图
脱毛膏	Reckitt Benckiser	RQ/B 33 型 2	去除小鼠体毛
恒温手术加热垫系统（ALC-HTP-S1）	上海奥凯生物科技有限公司	ALC-HTP-S1	加热
苏木精-伊红染液	Leagene	DH0003	用于苏木精-伊红染色
肝素钠盐	Macklin	H837056	用于肝素化处理
异氟烷	RWD 生命科学	R510-22	吸入性麻醉
实验室自制刮匙			用作喉镜
实验室自制气管插管			用于插管
Matrx VIP 3000 异氟烷挥发罐	Midmark Corporation	VIP 3000	麻醉
医用尼龙缝合线（5-0）	宁波医用针厂有限公司	5-0	用于关闭胸腔
显微外科弯头镊	RWD 生命科学	F11021-11	用于手术操作
显微外科剪刀	NAPOX	MB-54-1	用于动脉切开
Millar 导管	AD Instruments, 上海	1.0F	用于压力梯度测量
MS400D 超声探头	Visual Sonic	MS400D	用于多普勒血流速度和动脉粥样硬化斑块的测量
持针钳	Visual Sonic	F31006-12	用于手术操作
硝酸甘油	北京益民药业有限公司		用于扩张冠状动脉
眼科剪刀	RWD 生命科学	S11022-14	用于手术操作
戊巴比妥钠盐	Merck	25MG	麻醉
PowerLab 多通道生理信号记录系统	AD Instruments, 上海	4/35	压力记录
精密电子天平	Denver Instrument	TB-114	称重
丝线缝合线（8-0）	宁波医用针厂有限公司	6-0	用于冠状动脉结扎
小型动物显微手术设备	Napox	MA-65	外科手术器械
组织镊	Visual Sonic	F-12007-10	用于手术操作
组织剪	Visual Sonic	S13052-12	用于开胸进行血流动力学测量
超声耦合凝胶	广工牌	250ML	用于超声心动图检测前的准备
血管夹	Visual Sonic	R31005-06	用于阻断主动脉血流