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用于生物医学研究的犬类肝和肠三维类器官培养的标准化与维持

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DOI：

10.3791/63515

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2022年1月31日

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1Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 33D Health Solutions Inc., 4Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了从犬类肠道和肝组织中分离成体干细胞以建立三维类器官培养的实验方法。此外，还讨论了确保类器官稳定生长的实验室技术，以及犬类肠道和肝类器官的分离、生物样本库保存和复苏的标准操作流程。

摘要

犬类会罹患多种与人类相似的复杂多因素疾病，包括炎症性疾病、代谢性疾病和癌症。因此，犬类是具有转化医学潜力的、适用于人类医学研究的相关大型动物模型。类器官是由干细胞衍生而来的三维（3D）自组装结构，能够模拟其来源器官的微观解剖结构和生理功能。这些类器官具有转化应用价值。 体外 模型可用于药物渗透性与药物发现应用、毒理学评估，并为多因素慢性疾病的病理生理机制提供深入理解。此外，犬类类器官可改善伴侣犬的生活质量，为兽医学研究的多个领域提供支持，并推动兽医临床中的个体化治疗应用。少量供体即可建立类器官生物样本库，减少对持续组织采集的需求，因为类器官细胞系可无限传代培养。本文提供了三种聚焦于源自成体干细胞的犬肠道与肝类器官培养的技术方案。《犬类类器官分离方案》概述了组织处理方法及细胞分离物在支持性基质（溶解的细胞外基质）中的包埋操作。《犬类类器官维持方案》描述了类器官的生长与维持过程，包括清洗、传代以及扩增的适宜时机。《类器官收获与生物样本库保存方案》介绍了类器官的提取、冷冻及长期保存方法，以供后续分析使用。

引言

啮齿类动物是生物医学和转化研究中最常用的动物模型1。尽管它们在研究疾病的基本分子发病机制方面具有极高价值，但近年来其在慢性多因素疾病中的临床相关性受到质疑2。与啮齿类动物相比，犬类模型具有多项优势3,4。犬与人类在代谢组学和肠道微生物组方面具有相似性，这种相似性是在犬驯化过程中长期摄入人类饮食而形成的5,6,7。犬与人类在胃肠道解剖结构和生理功能上的相似性是另一个典型例子8。

此外，犬类通常与其主人共享相似的生活环境和生活方式9与啮齿类动物相比，犬类的寿命更长，可自然发生多种慢性疾病10炎症性肠病或代谢综合征是人类与犬类之间具有重要相似性的多因素慢性疾病的例子。11,12涉及患有自然发生疾病的犬类的临床前试验可能比啮齿类动物模型获得的数据更可靠13然而，为了尽量减少使用活体动物进行研究，并遵守3R原则（减量、优化、替代）14，替代方案 体内 使用3D进行测试 体外 犬类类器官已崭露头角15.

类器官是由干细胞衍生的自组装三维结构，能够重现其来源器官的生理功能和微观解剖特征16,17该技术最早由 Sato 等人在 2009 年描述。17 并允许更高的可转化性 体外 相较于以往使用二维癌细胞培养模型，利用上皮细胞系的研究能够实现更深入的探索18,19,20类器官具有重要应用价值 体外 在许多生物医学领域（如临床前毒理学）的模型21,22,23吸收或代谢研究24,25,26,27,28，以及在个性化医疗方法中的应用29,30,31犬类肠道类器官的成功培养首次于2019年被报道12，而源自犬的肝类器官最早由 Nantasanti 等人在 2015 年报道32此后，犬类类器官已成功应用于研究犬慢性肠病、胃肠道间质瘤和结直肠腺癌的多项研究中12，以及威尔逊病33,34.

虽然成体干细胞可以被获取 通过 尸检，类器官技术并不总是需要牺牲动物。可通过内窥镜和腹腔镜活检，甚至器官的细针穿刺抽吸获取样本35是上皮类器官分离中成体干细胞的可行来源12在兽医临床实践中广泛采用此类非侵入性技术，为反向转化研究（即信息从兽医临床实践向人类临床实践的转化，反之亦然）提供了便利条件15通过标准化类器官培养与维持方法，可进一步推动类器官技术的发展。本文所展示的类器官实验方案部分基于Saxena等人于2015年发表的前期研究。36，并根据犬类肠道和肝脏类器官培养的具体需求对方法进行了调整。犬类类器官培养方案的整体工作流程如图所示 图1.

犬类类器官分离方案介绍了从内窥镜、腹腔镜和手术活检以及尸体解剖中获取样本的方法。该方案概述了组织样本的初步预处理步骤，以及将样本运送至实验室所采用的方法。用于类器官分离所需的材料和试剂在“分离前准备”部分进行了总结。文中进一步详细描述了从组织样本中分离成体干细胞的过程。最后，讨论了利用溶解的细胞外基质膜将类器官接种形成圆顶状结构的过程。

第二个方案，即犬类类器官培养维护方案，描述了类器官的记录与培养方法。本节讨论了培养基更换及其频率。此外，还介绍了实验室操作步骤，如传代和细胞培养物的清洁，这些步骤对于成功维持三维犬类类器官至关重要。适当的传代是该方案中的关键步骤，本文进一步讨论了该步骤可能的调整方法及故障排除措施。

最后一个方案是犬类类器官收获与生物样本库保存方案，包含将完全成熟的类器官制备用于石蜡包埋和RNA保存的方法。文中还描述了将类器官样本在液氮中进行生物样本库保存的方法。最后，讨论了如何解冻冻存样本并支持其后续生长。

总之，本文旨在通过标准化实验室间的实验方案，提供一致的犬类类器官培养流程。通过这一工作，该论文旨在促进源自犬类类器官模型数据的可重复性，从而提高其在转化生物医学研究中的相关性。

犬类类器官工作流程图；从制备到生物样本库；组织采集；培养过程。
图1：犬类类器官实验流程示意图。《犬类类器官分离方案》描述了类器官分离所需材料的准备、组织样本的获取（通过尸检、内窥镜、腹腔镜及手术活检等方式），以及细胞解离和细胞群体接种的操作指导。《犬类类器官维持方案》讨论了类器官培养物的清洁与传代操作。《类器官收获与生物样本库保存方案》则介绍了将类器官样本制备用于石蜡包埋及进一步表征的方法，并阐述了类器官培养物的生物样本库保存技术及其从液氮储存中复苏的方法。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

该研究已获爱荷华州立大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循其规定进行（IACUC-19-337；IACUC-18-065；IACUC-19-017）。

注意：以下部分（步骤 1-3）描述了犬类类器官分离方案。

1. 分离前准备

  1. 运输管：在类器官分离前（通常为24小时前），向一个50 mL锥形管中加入10 mL含0.2 mL青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（Advanced DMEM/F12）。
  2. 对于腹腔镜、切口或切除活检样本，准备另外三个50 mL锥形管，每管加入10 mL完全螯合溶液（1x CCS；见表1）。
    注意：在步骤1.2中，也可使用磷酸盐缓冲液（PBS）中含2 mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）的传统溶液进行干细胞收获。使用1x CCS或PBS中的NAC在效果上未观察到差异。两种溶液均用于释放细胞进入溶液中。
  3. 将上述管置于4 °C过夜，并在后续操作中始终冰上运输。
  4. 准备五个含有5 mL 1x CCS的15 mL离心管，一个含有3 mL 1x CCS的15 mL离心管，一个空的15 mL离心管（用于上清液），以及一个含有5 mL 1x CCS和2 mL胎牛血清（FBS）的15 mL离心管。
    注意：若需处理多个样本，上述步骤可在分离当天之前完成。示意图参见图2中的分离管布局。
  5. 在分离当天，在生物安全柜中准备培养皿、手术刀、冰桶和冷的Advanced DMEM/F12。将所需数量的24孔细胞培养板放入培养箱中（37 °C；5% CO2环境）预热。
  6. 将溶解的细胞外基质膜（ECM；见材料表）置于冰上开始解冻。
    注意：冰浴可防止快速解冻并避免凝固。可将一盒移液器吸头预先放入冷冻室，以辅助后续接种溶解的ECM。
  7. 将离心机预冷至4 °C。
  8. 将含生长因子的完全培养基（“CMGF+”或“类器官培养基”，其成分见表1）从冰箱或冷冻柜中取出，放入37 °C水浴中复温。应尽可能避免直接光照。

分离管布局示意图，显示活检样本的组织采集与分离步骤。
图 2：分离管布局。 建议的组织采集设置包括：在50 mL离心管中加入10 mL Advanced DMEM/F12和0.2 mL青霉素-链霉素（Pen Strep）。此外，对于手术活检或尸检样本，还需准备三个装有10 mL 1x CCS的50 mL离心管。建议的分离步骤管路布局包括五个装有5 mL 1x CCS的离心管，用于CCS洗涤步骤。第一个管作为样品管，盛放剪碎的组织，其余管则作为1x CCS的储备液，逐步添加至第一个管中。第六个管中含3 mL 1x CCS，用于在将样品转移至6孔板时冲洗样品管中残留的组织。这六个管将在EDTA孵育步骤前使用。EDTA孵育后，使用一个含有5 mL 1x CCS和2 mL胎牛血清（FBS）的离心管作为样品管，该管中的上清液连同干细胞一起转移至另一个空管中，继续后续的分离操作。所有离心管在开始分离前应保持在4 °C。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 组织采集

  1. 可使用大型活检钳获取肠道内镜和腹腔镜活检样本（直径 2.8 mm）。每个肠段至少采集八份内镜样本。
  2. 将样本直接收集到转运管中，并立即置于冰上。
  3. 对于手术活检和尸检，采集大小为 0.5 cm × 0.5 cm 的组织块，并将其放入第一个 1× CCS 管中。
    注意：对于肠道活检样本，需清除残留的肠内容物，并用手术刀刮除黏膜层以去除绒毛。若样本充足，可将额外的活检组织收集至含有 RNA 保存试剂（1 mL）的冻存管中，或进行石蜡包埋，以便将来比较类器官与其来源组织。若活检样本用于透射电镜（TEM）分析，则不要刮除绒毛，并将样本保存在固定液（含 3% 多聚甲醛和 3% 戊二醛的磷酸盐缓冲液（PBS））中，于 4 °C 保存。
  4. 用力振荡 1× CCS 管约 30 秒，然后用镊子将样本转移至新的 1× CCS 管中。重复此过程两次。
  5. 将最后一次洗涤后的 1× CCS 管中的样本转移至转运管（Advanced DMEM/F12 + 青霉素-链霉素）中，并尽快将样本送回实验室。
    注意：经此预处理的样本也可在冰上过夜运输（切勿使用干冰运输）。

3. 类器官分离

注意：在生物安全柜中使用无菌技术进行分离操作。犬类类器官分离流程参见图3。

  1. 将组织样本在运输管中震荡约30秒，然后通过在液面附近缓慢移液去除过量上清液，直至管中剩余0.5 mL。注意不要丢弃任何组织。
  2. 将组织及剩余上清液转移至无菌培养皿中。使用一次性手术刀（或灭菌镊子和剪刀），将组织切割并切碎成大小约为1 mm2、呈糊状的小块，持续约5分钟。
  3. 用移液器将培养皿中的切碎组织连同液体转移至第一根CCS管中。向培养皿中加入2 mL Advanced DMEM/F12，冲洗残留组织，并将冲洗液转移至第一根CCS管中。
  4. 将1x CCS管涡旋振荡约5秒，重复约五次。让活检组织在15 mL管底部沉降（约1分钟），然后去除上清液，直至管中剩余5 mL。将新管中的1x CCS转移至样本管中。
  5. 对接下来的两根管重复上一步操作。在最后两次洗涤中，将上清液去除至管中剩余3 mL为止。
  6. 将活检组织和1x CCS从样本管转移至6孔板的一个孔中。然后向样本管中加入3 mL 1x CCS，轻轻旋转以收集残留组织，并将液体转移至板中的同一孔。
  7. 向每孔加入150 µL 0.5 M EDTA（使每孔总体积达到6.15 mL）。将6孔板置于4 °C、20°倾角、24 rpm的摇摆混合仪上。肝组织样本孵育10分钟，肠组织样本孵育1小时。
  8. 将6孔板移回生物安全柜。将切碎的组织和液体转移至1x CCS/FBS管中，静置使组织沉降。将上清液（此部分现含有游离干细胞）以及约0.2 mL组织上层液体转移至另一空管中。
  9. 将含有样本的管离心（700 × g，4 °C，5分钟）。干细胞现已与切碎组织一同形成沉淀。小心去除并弃去上清液，避免扰动沉淀。
  10. 用Advanced DMEM/F12重悬沉淀，并再次离心（700 × g，4 °C，5分钟）。吸除上清液，避免扰动沉淀。
  11. 计算用于接种解离细胞和组织所需的溶解ECM体积。每24孔板每孔使用30 µL溶解ECM，以达到合适的接种密度。
    注意：根据样本中切碎组织的量，将分离后的样本接种于24孔板的4至6个孔中。
  12. 将计算好的溶解ECM体积加入样本管中，缓慢吹打混匀，避免产生气泡。将悬液接种于孔中央，以便溶解ECM形成类似圆顶的结构。
    注意：使用从-20 °C冰箱取出的移液器吸头有助于溶解ECM的铺板。若组织块大于P200移液器吸头孔径，可使用宽口冷吸头或剪切冷P1000吸头辅助铺板。尽可能将含溶解ECM的样本保持在冰上。
  13. 将培养板转移至培养箱（37 °C，5% CO2环境），使溶解ECM固化约30分钟。
  14. 将ROCK抑制剂和GSK3β加入CMGF+中混合（浓度见表1）。向每个孔中加入500 µL该溶液（CMGF+ R/G）。将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2环境）。

犬类类器官分离流程图；组织处理、离心、铺板、孵育示意图。
图3：犬类类器官分离流程。 收集的组织样本转移至培养皿中并充分剪碎。随后将样本转移至含有1x CCS的离心管中，进行洗涤步骤。在6孔板中进行EDTA孵育后，将样本转移至含有1x CCS和FBS的离心管中。待组织沉淀后，将上清液连同少量组织转移至新的空管中。随后对样本进行离心，弃去上清液，并将沉淀重悬于Advanced DMEM/F12培养基中。再次离心后，吸除并弃去上清液。向离心管中加入溶解的细胞外基质（ECM），混匀后将样本接种至24孔板中。将24孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育30分钟，随后加入培养基。 请点击此处查看该图的放大版本。

注意：以下部分（步骤 4 和 5）描述了犬类类器官维持方案。根据表 2更换培养基，并每天检查类器官是否存在凋亡、污染、过度生长以及可溶性细胞外基质脱落的迹象。必须根据图 4进行每日记录，以准确监测培养条件及实验处理对类器官的影响。参见补充表 1获取可用于准确且可重复的类器官培养记录的模板。对于肝类器官，使用添加了ROCK抑制剂和GSK3β的CMGF+培养基。

类器官大小与密度指南；显微镜图像显示大小、密度、污染及过度拥挤情况。
图4：类器官大小与密度指南。（A）用于准确追踪类器官生长的类器官大小图表。大小指南包括超小（XS）、小（S）、中等（M）、大（L）和超大（XL）等级别。（B）密度指南包括极低密度（VLD）、低密度（LD）、中等密度（MD）、高密度（HD）和极高密度（VHD）类别。（C）类器官样本中细菌和真菌污染的代表性图像。（D）类器官过度拥挤和凋亡的代表性图像。每个图板均标明了物镜放大倍数。请点击此处查看该图的高清版本。

换液建议
周一周二周三周四周五周六周日
500 μLN/A500 μLN/A750 μLN/AN/A

表2：培养基更换建议。 推荐的每周培养基更换时间表。建议每隔一天更换一次培养基（肠类器官使用500 µL CMGF+培养基，肝类器官使用500 µL CMGF+ R/G培养基）。为弥补周末期间额外的时间，建议在周五下午添加750 µL培养基，并于周一上午进行培养基更新。

4. 类器官清洗

注意：为了维持类器官培养的健康状态，必须定期进行类器官清洗或传代。当观察到培养物中出现细胞凋亡、存在碎片、类器官过度拥挤或溶解的细胞外基质脱落时，应进行清洗操作。参见图4D。

  1. 倾斜培养板以去除孔中的培养基，避免破坏已溶解的细胞外基质（ECM）。
    注意：如果发现溶解的ECM脱落较为严重，建议将培养基转移至15 mL离心管中，以防止含有样本的ECM碎片丢失。
  2. 向每孔中加入0.5 mL预冷的Advanced DMEM/F12培养基，使用P1000枪头反复吹打以溶解基质小滴。将含有类器官的溶解基质转移至15 mL离心管中。将离心管置于冰上，若体积低于6 mL，缓慢加入Advanced DMEM/F12培养基至总体积达到6 mL。
  3. 离心处理（700 × g，4 °C，5分钟），小心去除上清液，注意不要扰动沉淀。
  4. 加入所需体积的溶解ECM（每孔30 µL，以达到合适的接种密度），通过移液轻轻重悬沉淀。将悬液接种于24孔板中央，形成小滴状隆起。
  5. 将培养板放入培养箱中（37 °C，5% CO2 气氛）孵育约30分钟，然后加入适当体积的培养基（表2）。

5. 类器官传代

注意：通常在初次培养后的5-7天进行传代，以扩增类器官细胞系。类器官培养物通常可按1:3的比例进行扩增。健康且适合传代的培养物图像见图4。类器官的大小至少需达到中等程度。

  1. 执行步骤 4.1 至 4.3。
  2. 去除上清液，管中保留 0.5 mL。注意不要扰动沉淀。
  3. 加入 0.5 mL 类胰蛋白酶蛋白酶（见材料表），用移液器反复吹打充分混匀，然后在 37 °C 水浴中孵育（肠类器官孵育 8 分钟，肝类器官孵育 10 分钟）。在孵育时间过半时，轻轻弹击管壁数次以继续混匀溶液。
  4. 将含有样品的管子移回生物安全柜，缓慢加入 6 mL 预冷的 Advanced DMEM/F12 培养基，以灭活类胰蛋白酶蛋白酶并终止细胞解离过程。
  5. 离心管子（4 °C 下 700 × g 离心 5 分钟），去除上清液。注意不要扰动沉淀。
  6. 执行步骤 4.4 和 4.5。
    注意：以下部分（步骤 6–9）描述的是类器官收获与生物样本库保存方案。类器官培养物必须不含之前传代过程中残留的组织碎片。培养物应保持健康状态，体积至少较大，密度为中等到高。可用于下游应用的健康培养物图像见图 4。若对质量不佳的类器官培养物进行后续保存和收获操作，可能对表征结果及生物样本库的存活率产生负面影响。请参阅图 5中推荐的 24 孔板布局。

用于样本固定、RNALater保存和冷冻方法的24孔板布局示意图。
图 5：推荐的24孔板布局。 该布局适用于类器官培养扩增后进行基本表征。将六个孔（中等到大尺寸、中等到高密度的类器官）进行石蜡包埋，通常可在组织学切片块中获得较高浓度的类器官。四个孔的类器官可合并至一个冻存管中，加入RNA保存试剂，用于后续实验。其余十四个孔用于类器官样本的生物样本库保存，可提供足够材料制备最多七支冻存管。请点击此处查看此图的放大版本。

6. 类器官的固定

  1. 移除孔中的培养基，并注意不要扰动已溶解的细胞外基质（ECM）凝胶。
  2. 加入 500 µL 用作固定液的福尔马林-乙酸-酒精溶液（FAA；成分见表1）。
  3. 将类器官置于室温下保存。24 小时后，吸除 FAA 溶液，并向孔中加入 70% 乙醇。用实验室封口膜（见材料表）包裹培养板，以防止乙醇快速挥发。此时类器官已可进行石蜡包埋。类器官培养物的石蜡包埋操作采用传统的金属底模进行。

7. RNA 保存

  1. 移除孔中的培养基，并注意不要扰动已溶解的细胞外基质穹顶。
  2. 每孔使用 0.5 mL 预冷的 Advanced DMEM/F12，通过反复吹打溶解已溶解的 ECM 小滴（避免产生过多气泡）。将类器官转移至 15 mL 离心管中。将离心管置于冰上，若体积低于 6 mL，缓慢加入 Advanced DMEM/F12 至总体积达到 6 mL。
  3. 离心管（700 × g） g 4 °C 下离心 5 分钟，弃去所有上清液，注意不要扰动沉淀。
  4. 向样品管中加入 100 µL PBS，通过轻柔吹打重悬沉淀。将样品管中的内容物转移至冻存管中。
  5. 加入 900 µL RNA 保存试剂（参见 材料表将样本管中的残留类器官收集至冻存管中并混匀。将这些残留类器官转移至冻存管，于 -80 °C 保存（通常四个孔的类器官合并至一个冻存管，足以用于后续实验，包括 qPCR 和 RNA 测序）。
    注意：一个冻存管通常可提取出总量为 4,000 ng 的 RNA（测定值） 通过 分光光度计分析

8. 类器官生物样本库

注意：生物样本库保存通常在传代后3-4天进行。进行此方法时，细胞培养物中不应出现凋亡迹象。请参见 图4 用于参考适合冷冻的大小和密度。将生物样本库中的中等到大型类器官以中等到极高的密度进行冷冻。如果某类器官细胞系特别稀有或无法保证后续存活率，可采取紧急冷冻步骤。紧急冷冻时遵循与常规类器官生物样本保存相同的步骤（步骤8.1至8.4），但适用于体积较小、密度较低的培养物。按照步骤8.1至8.4，将多个培养孔中生长的类器官合并至同一支冻存管中。需注意，应保留足够数量的活类器官，以尝试扩增培养（紧急冷冻仅作为防止培养物丢失的备用措施）。 通过 污染或其他意外情况。

  1. 按照步骤 7.1 至 7.3 操作。
  2. 向每支冻存管中加入 1 mL 冻存液（成分见表 1），将沉淀轻轻吹打重悬。
  3. 将 1 mL 悬液转移至一支冻存管中（每支冻存管对应两个孔），并将冻存管置于冰上保存。
  4. 将冻存管从冰上转移至冻存盒中（定期向储液槽中补充异丙醇），立即放入 -80 °C 环境中。24 小时后，将样本转移至液氮（-196 °C）中进行长期保存。
    注意：也可使用无酒精细胞冻存盒替代传统冻存盒。确保样本在从 -80 °C 转移至长期液氮保存过程中不发生融化。反复冻融会降低细胞培养物的存活率。

9. 从液氮储存中复苏

注意：在选择复苏类器官品系时，必须尽快将复苏后的一部分类器官重新冻存，并至少用一个（最好更多）冻存管替换回生物样本库中。

  1. 将溶解的细胞外基质（ECM）置于冰上缓慢解冻，将24孔板放入培养箱（37 °C；5% CO2 环境）中，并准备好所需试剂，如15 mL离心管和Advanced DMEM/F12培养基。
  2. 从液氮储存中取出含有类器官样本的冻存管，立即转移至37 °C水浴中解冻2分钟。
  3. 在生物安全柜中将冻存管内容物转移至15 mL离心管中。缓慢加入预冷的Advanced DMEM/F12培养基，使总体积达到6 mL。
  4. 离心处理（4 °C下，700 × g 离心5分钟）。小心吸除上清液，注意不要扰动沉淀。
  5. 向沉淀中加入180 µL（每孔30 µL）溶解的ECM，将悬液接种至预热的24孔板中。一个冻存管的样本可接种至24孔板的六个孔中。
  6. 将24孔板放入培养箱（37 °C；5% CO2 环境）中孵育约30分钟，随后加入CMGF+ R/G培养基（对于肠道类器官，应在24至48小时内切换至CMGF+培养基）。
    注意：当样本在24孔板中接种并开始生长后，必须至少恢复培养2天，方可进行传代，以提高细胞存活率。

结果

犬类类器官实验方案通常每孔可生成约50,000至约150,000个肠或肝细胞，每孔对应24孔板中的一个孔。典型的类器官图像见图6。

犬类类器官显微镜图像：十二指肠、空肠、回肠、结肠、肝脏。细胞形态示意图。
图6：犬类类器官的代表性图像。 图中展示了使用本方案分离获得的类器官图像。（A,B）来源于十二指肠的肠道类器官（分别以10倍和5倍物镜放大拍摄）。注意可见较老的出芽状类器官及较年轻的球状体。（C,D）来源于空肠下段的犬类肠类器官（分别以10倍和20倍物镜放大拍摄）。（E,F）回肠肠类器官（分别以20倍和5倍物镜放大拍摄），以及（G,H）结肠类器官（以10倍物镜放大拍摄）。（I）以20倍物镜放大拍摄的肝脏类器官代表性图像。大多数类器官呈出芽形态，图中亦可见较年轻的肝球状体。（J）代表性图像显示一种罕见的形成导管样结构的肝脏类器官（以10倍物镜放大拍摄）。每幅图像左上角均标有比例尺（500 µm）。请点击此处查看该图的高清版本。

使用本方案获得的类肠体和结肠类器官此前由 Chandra 等人在 2019 年进行了表征12。犬类肠道类器官由肠道上皮的规律性细胞群体组成。通过 RNA 原位 杂交，确认了干细胞生物标志物（富含亮氨酸重复序列的 G 蛋白偶联受体 5 - LGR5 和 SRY-Box 转录因子 9 - SOX9）、潘氏细胞生物标志物（Ephrin B 型受体 2 - EPHB2）、吸收性上皮细胞标志物（碱性磷酸酶 - ALP）以及肠内分泌细胞标志物（Neurogenin-3 - Neuro G3）的表达12。对石蜡包埋切片进行阿利新蓝染色以确认杯状细胞的存在。此外，还进行了光学代谢成像（OMI）或囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）肿胀实验等功能检测，以确认类器官的代谢活性。使用该方案还分离获得了来自被诊断为炎症性肠病、胃肠道间质瘤（GIST）或结直肠腺癌犬只的犬类类器官12。

干细胞分离后，犬肝类器官的生命周期始于扩增的球状体，约7天后转变为出芽并开始分化的类器官。根据本方案分离和培养的犬肝球状体被用于定量其生长情况，以确定最佳传代时间。来源于健康成年犬腹腔镜肝活检组织的球状体（n = 7）在培养的前7天内被持续测量。拍摄了代表性图像，并在整个培养过程中测量了球状体（n = 845）的纵向半径（a）和对角线半径（b）。计算了球状体的体积（V）、表面积（P）、二维椭圆面积（A）和周长（C）。实验的计算过程与结果总结于图7中。二维椭圆面积和周长可用于在光学显微镜下评估类器官培养体系的健康状态。这些数值可为培养维护决策提供参考依据。

简而言之，类球体的体积、表面积、二维椭圆面积和周长均迅速增加。后续计算采用了七只比格犬的测量数据平均值。从第2天到第3天，体积增加了479%（±6%）。在同一时间段，类球体的表面积和二维椭圆面积分别增加了211%（±208%）和209%（±198%）。二维椭圆周长从第2天到第3天增加了73%（±57%）。肝类器官从第2天到第7天总体积增长超过365倍，表面积和二维椭圆面积增加了49倍，二维椭圆周长增加了6倍。

接下来，来自两个成年犬样本的球状体在传代后继续培养，并于每天（第2至7天）收集用于RNA提取 原位 杂交（RNA原位杂交）。犬源探针的设计（探针列表作为补充材料提供） 补充表 2），并评估了干细胞标志物（LGR5）、胆管细胞特异性标志物（细胞角蛋白7 - KRT-7 和水通道蛋白1 - AQP1），以及肝细胞标志物（叉头框蛋白A1 - FOXA1；细胞色素P450 3A12 - CYP3A12）的mRNA表达水平。标志物的表达采用半定量方式评估（代表性图片见 图8类球体优先表达胆管细胞标志物KRT-7，其信号面积/细胞总面积的比例范围为1%至26%。类器官样本中未检测到AQP1的表达，这可能是因为该蛋白在犬肝组织样本中本就稀少。干细胞标志物（LGR5）的表达水平介于0.17%至0.78%之间，而肝细胞标志物的表达水平相对较低，FOXA1为0.05%–0.34%，CYP3A12为0.03%–0.28%。

肝类球体生长；显微镜图像、方程和图表；体积、表面积、分析。
图7：肝类球体的测量结果。（A）在培养第2至第7天期间，每天观察肝类球体的生长情况。类球体最早于第2天形成，最后一批类球体在第7天开始出芽。另一项实验在传代后使用两种犬类类器官细胞系，每天收集类球体用于石蜡包埋，以进行RNA原位杂交（第2天图像放大倍数为40x，第6天为10x，其余图像均为20x）。（B）显示在分离后第4天，一个肝类球体簇附着于溶解的细胞外基质（ECM）中的一块组织碎片上。测量了类球体的纵向和对角半径（图像放大倍数为10x）。图（C）展示了用于计算体积（V）、表面积（P）、二维椭圆面积（A）和周长（C）的公式。在这些计算中，假设犬肝类球体为理想球体。图（D）展示了肝类球体在不同生长天数下的体积、表面积、二维椭圆面积和二维椭圆周长的测量结果。误差线表示平均值的标准误（SEM）。（E）检测了犬肝类球体样本在传代后第2天至第7天期间KRT-7、LGR5、FOXA1和CYP3A12的mRNA表达水平。AQP1在这些样本中未表达。每张图像左上角均标有比例尺（5x：500 µm；10x：200 µm；20x：100 µm；40x：50 µm）。已注明物镜放大倍数。请点击此处查看该图的放大版本。

采用此标准化技术后，类器官在传代过程中很少发生破碎。如果解离未发生，可调整传代时间以达到最佳的细胞簇解离效果。然而，长时间暴露于类胰蛋白酶蛋白酶中可能对类器官的生长产生不利影响。在后续实验中，使用肝类器官来探究最佳解离时间并建立合适的传代方法。简言之，分别从两只健康犬只获取的肝类器官（每种6个孔重复）使用类胰蛋白酶蛋白酶处理12分钟和24分钟进行传代。每6分钟振荡一次样品。在解离时间结束时，向溶液中加入6 mL预冷的Advanced DMEM/F12培养基，并将样品离心（700 × g，4 °C，5分钟）。弃去上清液（含稀释类胰蛋白酶蛋白酶的Advanced DMEM/F12），将沉淀物按上述步骤（4.4–4.5）包埋于溶解的细胞外基质（ECM）中。在溶解的ECM和CMGF+ R/G培养基中培养12小时后，两种处理组样品之间观察到差异。结果显示，12分钟的类胰蛋白酶蛋白酶孵育未抑制类器官生长；然而，24分钟的孵育时间对类器官生长产生了负面影响（见图9）。

犬肝类器官实验；显微镜图像；TrypLE Express；细胞生长分析。
图9：犬肝类器官传代实验。 来自两只犬（D_1 和 D_2）的类器官在使用类胰蛋白酶消化法传代时，分别孵育12分钟或24分钟的代表性图像。对照样本使用类胰蛋白酶消化10分钟进行传代。每张图像左上角均标有比例尺（µm），代表500 µm（5倍物镜放大倍数）。请点击此处查看该图的放大版本。

接下来，研究了采用本方案获得的犬肝类器官在不利环境（缺乏结构支持和营养）下的存活能力。该研究重点在于确定肝类器官成功生长和存活所需的类器官培养基和基底膜基质的体积，并明确这些条件对类器官培养的影响。存活能力在96孔板中进行测定，使用有限数量的类器官。来自两只犬的类器官按上述方法传代后，分别包埋于不同体积的溶解ECM（10 µL 或 15 µL）中（共12个重复）。细胞接种浓度为每10 µL孔400个细胞或每15 µL孔600个细胞，相当于40,000 cells/mL。添加两种类型的培养基（CMGF+ 或 CMGF+ R/G），体积分别为25 µL、30 µL 或 35 µL。实验过程中从未更换培养基，也未进行任何维护操作。每天监测类器官的存活情况。类器官死亡定义为超过50%的类器官结构发生溶解。在这些条件下，类器官的存活时间范围为12.9（±2.3）天至18（±1.5）天，结果总结于表3。存活时间最长的两个样本是来源于包埋于15 µL溶解ECM和30 µL CMGF+培养基中的犬类器官。这两个样本在经历18天的营养剥夺后，被转移至标准的24孔板中，重新包埋于溶解ECM（30 µL）并加入新鲜培养基（500 µL），以确认类器官仍具备扩增能力（图10）。

培养基类型平均存活天数中位数变异系数%平均存活天数中位数变异系数%平均存活天数中位数变异系数%平均存活天数中位数变异系数%
培养基 (μL)30253530
ECM (μL)10101015
D_1CMGF+ R/G12.501311.5712.83134.5011.8311.512.9112.081312.46
CMGF+17.081716.2618.50194.8918.421914.5417.82198.99
D_2CMGF+ R/G13.671413.3613.001312.7014.0014.517.2313.08138.90
CMGF+15.501518.5617.501810.4817.501920.8917.001714.41
TOTALCMGF+ R/G13.081313.1312.92139.3912.921317.5212.581311.22
CMGF+16.2916.517.6918.0018.58.3517.961917.6517.431711.70
死亡定义：类器官质量中超过50%失去活性

表3：存活率实验结果。 本实验基于两种类器官培养物在缺乏结构支持或营养条件下的情况。结果包括各只犬个体中可溶性细胞外基质和培养基浓度的平均值、中位数以及标准差（变异系数%）。

类器官分析、显微图像、96孔板、细胞活力、营养剥夺、第4-7天
图10：类器官的营养与结构剥夺。 将类器官重新接种至24孔板中，以确认其在剥夺处理后仍具有扩增能力（A）。重新接种后第4天和第7天的代表性图像显示类器官发生扩增，表明可通过视觉识别存活的类器官（图像采用5倍物镜放大拍摄）。存活或死亡的类器官代表性图像见（B）。图像采用5倍物镜放大拍摄。 请点击此处查看该图的高清版本。

肝类球体RNA原位杂交；7天内基因表达显微图像；实验结果。
图8：肝类球体RNA in situ 杂交代表性图像。 LGR5、KRT7、FOXA1和CYP3A12标志物的代表性图像取自传代后第2至第7天的样本，物镜放大倍数为60倍。阳性mRNA分子呈红色染色。AQP1在样本中无表达。请点击此处查看该图的放大版本。

不完全螯合溶液（ICS）成分终浓度
500 mL H2ONA
2.49 g Na2HPO4-2H2O4.98 mg/mL
2.7 g KH2PO45.4 mg/mL
14 g NaCl28 mg/mL
0.3 g KCl0.6 mg/mL
37.5 g 蔗糖75 mg/mL
25 g D-山梨醇50 mg/mL
完全螯合溶液（CCS）成分体积比% 或 终浓度
不完全螯合溶液20%
无菌 H2O80%
DTT520 μM
青霉素-链霉素（Pen Strep）青霉素：196 U/mL；链霉素：196 µg/mL
类器官培养基成分终浓度
高级 DMEM/F12NA
FBS8%
Glutamax2 mM
HEPES10 mM
Primocin100 µg/mL
B27 添加剂1x
N2 添加剂1x
N-乙酰-L-半胱氨酸1 mM
小鼠 EGF50 ng/mL
小鼠 Noggin100 ng/mL
人 R-Spondin-1500 ng/mL
小鼠 Wnt-3a100 ng/mL
[Leu15]-胃泌素 I 人源10 nM
烟酰胺10 mM
A-83-01500 nM
SB202190（P38 抑制剂）10 µM
TMS（甲氧苄啶-磺胺甲噁唑）10 µg/mL
额外组分终浓度
ROCK 抑制剂（Y-27632）10 µM
Stemolecule CHIR99021（GSK3β）2.5 µM
冻存培养基成分体积百分比
类器官培养基和 ROCK 抑制剂50%
FBS40%
二甲基亚砜（DMSO）10%
FAA 固定液成分体积百分比
乙醇（100%）50%
冰醋酸5%
甲醛（37%）10%
蒸馏水35%

表1：溶液与培养基的组成。 不完全螯合溶液、完全螯合溶液、CMGF+（类器官培养基）、冻存培养基及FAA的成分与浓度列表。

补充表 1：类器官培养记录模板。该模板可用于每天准确且可重复地记录类器官培养的相关信息。请点击此处下载该表格。

补充表 2：RNA 原位杂交探针。 本表列出了由该技术制造商专门针对犬 mRNA 靶标设计的探针列表，用于开展 RNA 原位 杂交实验。表中包含各标志物的意义、探针名称、参考编号及其靶向区域的信息。请点击此处下载该表格。

讨论

目前尚缺乏用于犬肝和肠道类器官分离与维持的标准化方案。为了使该模型适用于不同的实验室环境，有必要建立类器官培养的标准操作程序。具体而言，提供这些犬类类器官模型培养的标准化操作流程，对于表征类器官在培养和传代过程中的正常生长、进而确定最佳的扩增与维持时间点至关重要。采用本方案培养的犬肠道类器官此前已被 Chandra 等人表征12。

该实验方案中最关键的步骤之一是类器官的传代。根据肝类球体的测量结果，确定肝类球体首次传代的最佳时间为分离后的第7天。类球体在第7天达到最大体积，同时开始出芽并形成肝类器官。自分离后第2天至第7天，类器官总体积的增加超过365倍，表明其最佳传代时间长于犬肠道类器官培养。培养7天后，即使未进行清洗或传代，肝类球体中也未观察到明显的细胞凋亡迹象（图7）。肠道和肝类器官的传代操作可能具有挑战性，因为该过程可能导致细胞丢失和活力改变。实验结果表明，将肝类器官与类胰蛋白酶蛋白酶共孵育较长时间（长达12分钟）不会对后续传代产生负面影响；但若孵育时间超过24分钟，则可能对类器官的后续传代造成不利影响。

若类器官传代过程中细胞簇的破碎效果不理想，采用机械解离可能比延长胰蛋白酶样蛋白酶的孵育时间更为有利。如果类器官解离过程中遇到困难，可尝试短暂涡旋震荡样本以提高传代效率。然而，涡旋震荡有可能破坏培养物并损伤细胞，因此仅应在其他方法反复失败时使用。将肝类器官解离为单细胞会降低其生长速率，而将其解离为细胞簇则可显著提高存活率。类器官实验方案中选择的孵育时间为10分钟。在胰蛋白酶样蛋白酶实验中，12分钟的孵育时间点相较于24分钟孵育未表现出细胞毒性。

存活率实验证实，犬肝类器官在不利条件（结构和营养耗竭）下可存活长达19.5天。在这些条件下存活时间最长的类器官是使用CMGF+培养基培养的。这一现象可能是由于在未添加Rock抑制剂和GSK3β抑制剂的培养基中，肝类器官生长较慢所致。而添加了R/G的CMGF+培养基中的类器官生长更快，可能因此更快地耗尽了营养资源。该实验为缩小犬类器官培养规模以实现高通量系统转化提供了可能性。这一技术有望以显著降低的成本促进药物发现或毒理学研究。

在犬类类器官培养维持过程中，一些常见问题包括接种时样本凝固不当、培养污染以及类器官密度和大小的控制不当。如果溶解的细胞外基质（ECM）在接种过程中过早凝固，应立即将其置于冰上10分钟。如果溶解的ECM未能形成圆顶状结构，可能是样本中去除的培养基不足。若出现此情况，可使用更多溶解的ECM稀释样本，直至形成圆顶状结构。

当整块培养板出现真菌或细菌污染时（见图4），最佳处理方法是丢弃该培养板。可尝试使用抗真菌或抗生素药物进行处理，但此类尝试的成功率极低。若培养板中仅单个孔发生污染，可将存活且未受影响的孔转移至新培养板中进行清洁（执行步骤4.1至4.5），并密切监测。如果样本已经进行了紧急冷冻，则建议丢弃整个样本，因为解冻样本会增加孵育箱被进一步污染的风险。

健康的类器官培养应至少达到中等大小和中等密度或更高水平。最佳密度对类器官培养的生长至关重要。若密度过低，必须通过传代将类器官调整至中等密度。如果出现密度过高（过度拥挤）的情况，应将类器官扩增至更多的孔中。明显的细胞凋亡现象常伴随类器官培养中过度拥挤和密度过低的情况。若这些问题未能及时纠正，整个类器官培养可能在数日内全部进入凋亡状态。当类器官达到超大尺寸或极高密度时，应将其用于实验、冻存或固定处理。

目前类器官培养基包含17种组分，因此添加类器官维持和扩增所需的生长因子可能成本较高。该问题可通过培养能够合成这些生长因子的二维（2D）细胞来制备条件培养基CMGF+加以解决。L-WRN细胞系可产生Wnt-3a、R-Spondin-3和Noggin三种生长因子37。该细胞培养使用含90% DMEM/F12和10% FBS的培养基。当细胞融合度达到90%时，连续一周每天收集培养基。收集的培养基随后与不含上述生长因子的2倍浓缩CMGF+培养基混合。尽管二维培养可在显著降低成本的情况下生产所需生长因子，但需额外投入时间和准备工作。此外，不同批次条件培养基中生长因子的浓度可能存在差异37,38。

犬类成体干细胞来源的类器官培养物是一种独特的生物医学模型，有助于实现“同一健康”倡议（One Health Initiative）的目标39。类器官技术可用于多种基础和生物医学研究领域，涵盖发育生物学、病理生理学、药物发现与筛选、毒理学，以及传染病研究和再生医学40。转化研究和逆向转化研究均为犬类类器官适用的研究方向15。数百年来，犬类一直被用于转化实验研究，其作为伴侣动物的地位也使其成为兽医学中研究最为深入的物种之一。

综上所述，本文提供了犬类肝和肠类器官的分离、维持、收获及生物保存的标准化操作流程，以促进该模型在多种生物医学领域的应用。该模型特别适用于推动反向转化研究，可作为“同一健康”倡议的工具，促进跨学科和学科内部的知识共享。

披露

K. Allenspach 是 LifEngine Animal Health 和 3D Health Solutions 的联合创始人。她担任 Ceva Animal Health、Bioiberica、LifeDiagnostics、Antech Diagnostics、Deerland Probiotics 和 Mars 的顾问。J. P. Mochel 是 LifEngine Animal Health 和 3D Health Solutions 的联合创始人。Mochel 博士担任 Ceva Animal Health 和 Ethos Animal Health 的顾问。其他作者均无任何利益冲突需要声明。

致谢

作者谨向爱荷华州立大学兽医诊断实验室的工作人员表示感谢，特别是Haley M. Lambert、Emily Rahe、Rosalyn M. Branaman、Victoria J. Green和Jennifer M. Groeltz-Thrush，感谢他们及时处理所提供的样本。作者希望感谢Faculty Startup、ISU VPR Miller奖、ISU VPR Miller奖以及NSF SBIR授予爱荷华州立大学的子奖项（编号#1912948）所提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>螯合溶液
D-山梨醇Fisher ChemicalBP439-500
DTTPromegaV3151
KClFisher ChemicalP217-500
KH2PO4SigmaP5655-100G
Na2HPO4-2H2OSigmaS5136-100G
NaClFisher ChemicalS271-500
青霉素-链霉素Gibco15140-122
蔗糖Fisher ChemicalS5-500
<强>类器官培养基
[Leu15人胃泌素 ISigmaG9145-.5MG
A-83-01PeproTech9094360
高级DMEM/F12Gibco12634-010
B27添加剂Gibco17504-044
FBS康宁35-010-CV
GlutamaxGibco35050-061
HEPESVWR生命科学J848-500ML
人R-脊椎蛋白-1PeproTech120-38-500UG
小鼠EGFPeproTech315-09-1MG
小鼠NogginPeproTech250-38-250UG
小鼠 Wnt-3aPeproTech315-20-10UG
N2 补充剂Gibco17502-048
N-乙酰-L-半胱氨酸SigmaA9165-25G
烟酰胺SigmaN0636-100G
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ROCK抑制剂（Y-27632）EMD Millipore Corp.SCM 075
SB202190（P38抑制剂）SigmaS7067-25MG
Stemolecule CHIR99021（GSK3抑制剂）β)Reprocell04-0004-基础
甲氧苄啶SigmaT7883-5G
磺胺甲噁唑Sigma-AldrichS7507-10G
<强>试剂
冰醋酸Fisher ChemicalA38-500
二甲基亚砜（DMSO）Fisher ChemicalsD128-500
EDTA，pH 8.0，0.5 MInvitrogen15575-038
甲醛（37%）Fisher ChemicalF79P-4
戊二醛溶液SigmaG5882
用于类器官培养的Matrigel基质康宁356255细胞外基质膜
多聚甲醛，97%Alfa AesarA11313
PBS，1×（磷酸盐缓冲液）康宁21-040-CM
PBS，1×（磷酸盐缓冲液）康宁21-040-CM
RNA之后 溶液InvitrogenAM7021RNA保存试剂
TrypLE ExpressGibco12604-021类胰蛋白酶蛋白酶
<强>其他
6孔细胞培养板康宁3516
ACD Hybez II 杂交系统ACD，biotechne 品牌321710
离心管，15 mLCorning430766
CoolCell LX康宁BCS-405MC
冻存管康宁430488
一次性离心管（50 mL）Fisherbrand05-539-13
GyroMini 旋转混匀仪（摇床）LabnetS0500-230V-EU
水浴加热Lab-Line Instruments3000
Mr. Frosty 冷冻容器赛默飞世尔科技5100-0001
NanoDrop 2000赛默飞世尔科技ND2000CLAPTOP分光光度法分析
松下培养箱松下MCO-170ML-PA
Parafilm M 封口膜Bemis Company IncPM996/EMD实验室用柔性薄膜胶带
一次性防护手术刀巴德-帕克239844
RNAscope 2.5 HD 检测试剂盒 – 红色ACD，biotechne 品牌322350
RNAscope H2O2 &蛋白酶Plus试剂ACD，biotechne 品牌322330
RNAscope 靶标回收试剂ACD，一个Bio-Techne品牌322000
RNAscope 洗涤缓冲液试剂ACD，一个Bio-Techne品牌310091
组织培养皿Dot Scientific6676621
24孔组织培养板FisherbrandFB012929

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