本方案描述了猪的筋膜皮瓣模型及其在血管化复合组织研究中的潜在应用。
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摘要
摘要
血管化复合组织异体移植（VCA），如手、面部或阴茎移植，是针对严重皮肤缺损且无法通过重建阶梯的初始步骤修复的前沿治疗方法。尽管其美学和功能效果令人期待，但主要限制因素仍是需要长期严格使用免疫抑制剂及其广为人知的医学风险，从而限制了其更广泛的应用。因此，克服VCA中的免疫屏障对于扭转伦理权衡、并利用最先进的外科技术改善患者生活质量至关重要。de novo构建患者特异性移植物是重建性移植领域的下一个重大突破。通过组织工程技术，可利用灌注-脱细胞-再细胞化方法去除VCA中的供体细胞，并根据受体进行个性化定制。为了发展这些新技术，需要建立大规模的动物VCA模型。因此，由皮肤、脂肪、筋膜和血管组成的猪筋膜-皮瓣模型，是开展VCA初步研究的理想模型。然而，文献中描述的大多数VCA模型均包含肌肉和骨骼。本研究报道 一种在猪体内可靠且可重复的隐静脉筋膜-皮瓣切取技术，该技术可作为多种研究领域的实用工具，尤其适用于血管化复合组织工程研究。
引言
带血管复合组织异体移植（VCA）已彻底改变了手、面部和阴茎等难以修复的躯体部位缺损的治疗方式1,2,3遗憾的是，首批长期结果4 已表明，终生使用高剂量免疫抑制剂可能导致严重的并发症，包括糖尿病、感染、肿瘤以及肾血管功能障碍5最近，血管化复合组织异体移植（VCA）领域的专家团队不得不应对慢性排斥反应导致移植物丢失的风险，并已开展了首例面部再移植手术。6,7已提出多种策略以克服血管化复合组织移植（VCA）中免疫抑制的局限性。第一种策略是通过在同种异体移植物受者中诱导免疫混合嵌合状态，从而建立对移植物的长期耐受8,9。第二个涉及 从头合成 创建患者特异性移植物 通过 组织工程
近年来，生物组织的灌注脱细胞技术已成功制备出天然的细胞外基质（ECM）支架，能够保留完整器官的血管网络和组织结构10。因此，利用受者特异性细胞对这些ECM进行再细胞化，有望构建出无免疫排斥限制的个性化移植物。在血管化复合组织移植（VCA）生物工程研究中，多个研究团队已实现脱细胞并获得保留完整结构的ECM11,12,13。然而，再细胞化过程仍面临挑战，在大型动物模型中尚未取得成功14,15。这些突破性技术的发展迫切需要可靠且可重复的大型动物复合组织模型。猪模型在生物工程研发流程中是最优选择，因为猪皮肤在解剖和生理特征上与人类皮肤最为接近16。在构建“定制化”血管化复合组织移植物的初期阶段，使用筋膜皮瓣（FCF）尤为理想。事实上，FCF是一种包含皮肤、脂肪、筋膜和内皮细胞的基本VCA模型。文献中已有对猪肌皮瓣17和骨肌皮瓣18的描述。然而，目前尚缺乏针对筋膜皮瓣获取技术的系统性关注。
因此，本研究旨在为研究人员提供一种猪隐静脉游离皮瓣获取技术的详细描述，并全面展示该皮瓣的各项特性，以促进其在多个研究领域的应用，尤其是在血管化复合组织工程中的应用。
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方案
所有动物均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》接受人道护理。本实验方案已获机构动物护理和使用委员会批准（IACUC-方案编号 #2020N000015）。所有实验共使用七只雌性约克夏猪（20-25 kg）。
1. 术前护理
- 手术前 12 小时禁食固体食物。
- 使用 4.4 mg/kg 的替拉唑（Telazol）、2.2 mg/kg 的赛拉嗪（Xylazine）和 0.04 mg/kg（肌内注射）的硫酸阿托品（Atropine sulfate）对动物进行镇静（参见 材料表）。
- 在耳缘静脉置入 18 G 外周静脉导管。
- 使用合适的气管插管（6–15 mm 可用于 10–200 kg 的猪）对猪进行气管插管，并连接呼吸机。术前给予丁丙诺啡（buprenorphine）镇痛（0.05 mg/kg，肌内注射）（参见 材料表）。
2. 术中监测
- 使用1.5%-3%异氟烷与1.5 L/min氧气流量的吸入混合气体维持麻醉。
- 持续监测心率、脉搏血氧饱和度和呼气末二氧化碳2每5分钟评估一次血压和体温。
注意：心率的目标范围为 90-100 次/分钟，血氧饱和度必须高于 93%，且呼气末 CO₂2 范围在5%–6% CO2. - 在整个过程中以每小时5-10 mL/kg的速度输注0.9%生理盐水，以将平均动脉压维持在60 mmHg至90 mmHg之间。
3. 双侧隐静脉皮瓣的制备
- 将动物置于仰卧位。剃除并消毒双侧腹股沟及后肢，手术区域应包括整个后肢，并以无菌方式铺巾。
- 在髌骨内侧约三个手指宽度处触诊隐动脉搏动，并进行标记。
- 确定并绘制皮瓣的边界。
注：上界为平行于腹股沟皱襞并在其下方3 cm处的轴线；外侧界为从髂前上棘至髌骨内侧部分的轴线。 - 以隐动脉蒂为中心绘制一个直径为10 cm的类椭圆形皮瓣，该皮瓣应位于前述步骤3.3所描述的皮瓣边界内。
- 在皮瓣标记处、血管蒂远端部分做1.5 cm的皮肤切口。
- 切开筋膜，钝性分离以暴露隐动脉及其两条伴行静脉。进行双重结扎，并将其作为一束分离。
- 使用刀片切开皮瓣其余部分的皮肤。
- 使用电凝切开皮下组织及周围筋膜。使用双极电凝钳进行彻底止血（参见 Table of Materials）。
- 使用3-0不可吸收缝线将皮瓣的皮肤部分固定于下方筋膜，以避免意外牵拉及穿支血管的损伤。
- 通过分离筋膜与股薄肌之间的连接，将皮瓣从股薄肌上松解。
注：隐动脉蒂远端部分走行于股薄肌与筋膜之间的平面。适当的张力及对侧支血管谨慎使用双极电凝止血，是顺利解剖血管蒂的关键因素。 - 使用手术刀在腹股沟皱襞处做12 cm长的切口。做一垂直切口连接腹股沟皱襞与皮瓣近端部分。抬起连接的皮肤，使用电凝切开皮下层。
- 继续沿隐血管向股血管方向解剖血管蒂。
注：隐动脉蒂近端部分可能走行于肌间隔内，或进入股薄肌内部。 - 游离股动静脉，并在隐支远端分别对动脉和静脉进行双重结扎。从远端向近端继续解剖股血管，直至达到腹股沟韧带水平。使用双极电凝钳进行电凝或使用血管夹，结合2-0丝线结扎并切断深股动静脉。
注：在切断血管前也可先使用血管夹。 - 在对侧后肢重复步骤3.2–3.13，以获取第二个隐动脉皮瓣。
- 在步骤3.16前5分钟，通过静脉注射肝素（100 IU/kg）对动物进行肝素化处理。
- 尽可能靠近腹股沟韧带近端结扎股血管蒂（动脉和静脉），并将皮瓣从供体猪体上分离。
- 扩张股血管断端，分别在动脉和静脉中插入20 G套管针。使用3-0丝线将套管针固定于血管上。
- 缓慢冲洗筋膜皮瓣动脉，注入10 mL肝素化生理盐水（100 IU/mL），直至观察到清晰的静脉流出液（Figure 1）。
图1：自体及脱细胞大隐静脉筋膜-皮瓣 (A) 在股动脉中插入20 G套管针的游离皮瓣，可用于冲洗皮瓣内的血液，并进行不同实验（血管造影、灌注脱细胞）。B去细胞化皮瓣。经10天去垢剂灌注后，灌注去细胞化方法获得呈白色的无细胞支架。H&E染色的全层横切面C) 原位皮瓣和（D去细胞化皮瓣 请点击此处以查看此图的放大版本。
- 通过静脉注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）实施动物安乐死。通过确认心跳和呼吸运动消失来判定死亡。
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结果
在开展活体动物实验之前，首先在三具尸体标本上确定了隐静脉穿支皮瓣区（图2）。将一种有色灌注液注入隐静脉动脉，以显影该动脉发出的特定血管网络。灌注液由10 mL蓝色甘油制剂与10 mL稀释剂混合而成（见材料表）。该方法生成了隐静脉供血皮肤区域的着色图谱，从而可划定隐静脉游离皮瓣（FCF）的边界范围。
图2：穿支皮瓣区域的确定。 向尸体标本的大隐静脉动脉内注射彩色灌注液，以精确定位由大隐静脉血管蒂供血的皮肤范围。
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讨论
本文介绍了一种在猪后肢获取可靠且可重复的筋膜皮瓣的方法。按照本逐步手术方案，可在不到2小时内仅使用一只动物获取两个皮瓣。手术中最关键的步骤是在股薄肌纤维内对血管蒂进行游离，这需要由技术娴熟的外科医生进行细致的解剖。使用皮肤缝线将皮肤固定于筋膜是至关重要的技巧，可避免剪切力破坏穿支血管，从而防止皮瓣皮肤发生继发性缺血坏死。大隐静脉筋膜皮瓣具有血管蒂长、血管口径适中等优点，且可靠性高，因此成为多个研究领域的理想模型。
多个研究团队已在此通过脱细胞与再细胞化进行皮肤组织工程的方案中对该模型表现出兴趣11肌肉的缺失是在实施该操作中的一个关键点 生物工程实验方案。因此，我们寻找位于前肢、背部中段、大腿或腹股沟区域的筋膜皮瓣，这些部位缺乏肉膜（panniculus carnosus，即猪体内分隔浅层与深层脂肪层的薄层肌肉结构）19在初步实验中，根据已发表的方案，切取了以腹壁浅上动脉为基础的腹部皮瓣20,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由儿童烧伤医院基金会资助，资助编号为#85127（BEU和CLC）和#84702（AA）。作者感谢"Gueules Cassées"基金会为参与该项目的研修人员提供的薪金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 18 G 血管导管 | BD Insyte Autoguard | 381409 | |
| 20 G 血管导管 | BD Insyte Autoguard | 381411 | |
| Adson 组织镊，11 cm，1×2 齿，带结扎平台 | ASSI | ASSI.ATK26426 | |
| 硫酸阿托品 | AdvaCare | 212-868 | |
| 双极电凝线 | ASSI | 228000C | |
| 盐酸布托啡诺 | Pharmaceutical, Inc | 42023-179-01 | |
| 扩张镊 | 精细科学工具（FST） | 18131-12 | |
| 气管内插管 | Jorgensen Labs | JO615X | 根据猪的体重选择 6 至 15 mm 的尺寸 |
| Ethilon 3-0 16 mm 3/8 | Ethicon | MPVCP683H | |
| 戊巴比妥钠安乐死剂（Euthasol） | Virbac AH | 200-071 | |
| 肝素封闭冲洗液，USP，100 单位/mL | BD PosiFlush | 306424 | |
| 异氟烷 | Patterson Veterinary | 14043-704-06 | |
| 珠宝级双极镊，防粘，11 cm，直尖头，尖端直径 0.25 mm | ASSI | ASSI.BPNS11223 | |
| 梅岑鲍姆剪刀，180 mm | B Braun | BC606R | |
| Microfil 蓝色灌注剂 | Flow tech | LMV-120 | |
| Microfil 稀释液 | Flow tech | LMV-112 | 有色填充溶液 |
| 单极电刀 | ASSI | 221230C | |
| N°15 手术刀片 | Swann Morton | NS11 | |
| Omnipaque | 通用电气 | 4080358 | 造影剂 |
| Perma-Hand Silk 3-0 | Ethicon | A184H | |
| 小型 Ligaclip 结扎夹 | Ethicon | MCM20 | |
| Stevens 剪刀，115 mm | B Braun | BC008R | |
| Telazol | Zoetis | 106-111 | |
| Xylamed（赛拉嗪） | Bimeda | 200-529 |
参考文献
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