评估能量底物氧化 体外 与 14CO2 捕获

摘要

本方案描述了一种简便易行的方法，通过追踪底物氧化来检测其氧化过程 ¹⁴CO₂ 生产 体外.

摘要

线粒体含有三羧酸（TCA）循环和电子传递链的分子机制 链（ETC），生成三磷酸腺苷（ATP）以维持能量稳态。葡萄糖、脂肪酸和氨基酸是大多数体细胞中线粒体呼吸的主要能量底物。研究表明，不同细胞类型可能对特定底物具有不同的偏好。然而，骨骼中各类细胞对底物的利用尚未得到深入研究。此外，由于细胞代谢会随生理和病理生理变化而调整，对骨骼细胞底物依赖性的直接评估可能为骨疾病发病机制提供重要见解。

以下实验方案基于底物分子经氧化磷酸化后释放二氧化碳的原理。通过使用含有放射性标记碳原子（¹⁴C）的底物，该方法可对细胞培养中底物氧化速率提供一种灵敏且易于使用的检测手段。以原代颅骨前成骨细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMMs）为例的研究表明，这两种细胞类型对主要底物的利用方式存在差异。

引言

真核生物中的氧化磷酸化（OXPHOS）是指营养物质在线粒体内被分解，通过消耗氧气以三磷酸腺苷（ATP）的形式释放化学能的过程。  多种底物在线粒体内的分解代谢通过三羧酸（TCA）循环直接产生的ATP分子较少，其主要作用是通过还原电子载体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD⁺）来储存能量。这些被还原的电子载体随后被位于线粒体内膜上的电子传递链（ETC）氧化，从而在线粒体内膜两侧建立质子浓度梯度。质子最终顺浓度梯度通过ATP合酶回流至线粒体基质，驱动ATP的合成。OXPHOS是能量底物生成ATP最有效的途径，通常在有氧环境中占主导地位。过去认为，有氧糖酵解——即在氧气存在下由葡萄糖生成乳酸的过程——属于病理生理现象，常被视为癌细胞的标志之一。然而，越来越多的研究发现，某些正常细胞类型也会采用有氧糖酵解，其具体原因尚待进一步阐明。

代谢灵活性是指细胞或生物体适应能量需求变化及可用燃料来源变化的能力。例如，在稳态下，骨骼肌的能量需求主要由氧化磷酸化（OXPHOS）来满足，而在高强度运动期间则主要依赖无氧糖酵解¹。随着运动时间的延长，葡萄糖和脂肪酸的氧化对整体能量产生的贡献逐渐增加²。然而，底物的利用不仅取决于其可获得性，因为不同底物在氧化过程中会相互竞争。最显著的是，已有研究表明，脂肪酸氧化可通过一种称为兰德尔效....

方案

使用放射性材料（RAM）需事先获得各机构指定安全委员会的批准。本方案中使用的放射性材料已获得宾夕法尼亚大学环境健康与辐射安全办公室（EHRS）的批准。动物实验需事先获得所在机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。本研究已获得费城儿童医院动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. ¹⁴C标记底物储备液的制备

1. 通过将11 g牛血清白蛋白（BSA）与33.1 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）混合，并在室温下轻轻摇动约3小时，直至BSA完全溶解，制备4 mM BSA储备液。使用前将BSA储备液在70 °C水浴中预热。
2. 在指定的放射性操作通风橱中，将50 µCi ¹⁴C-油酸（50 µCi/µmol，溶于乙醇）置于敞口小瓶中风干8小时。加入312.5 µL H₂O，然后加入3.5 mg（11.5 µmol）油酸钠，充分混匀。
3. 将所得溶液在水浴中加热至70 °C，加入0.9375 mL预热的BSA储备溶液，得到10 mM标记油酸储备液（其中¹⁴C-油酸与未标记油酸的摩尔比为1:11.5）。将储备液分装后于-20 °C长期保存。
4. 将¹⁴C-葡萄糖和¹⁴C-谷氨酰胺解冻后直接使用。

结果

在此示例中，CO₂ 采用捕获法比较颅骨原代前成骨细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMMs）的底物氧化能力，后者常用于此类研究 体外 成骨细胞或破骨细胞分化。原代细胞传代后在cMEMα中过夜培养，通常可达到80-90%融合度，并呈现其特征性形态。颅骨前成骨细胞明显大于BMMs（图2）。每种细胞类型均通过执行步骤4.1至4.7进行葡萄糖、谷氨酰胺和油酸的氧化测定。结果通过使用公式（1).

结果显示，每种底物在颅骨成骨前体细胞中的氧化速率均显著高于骨髓巨噬细胞（BMMs），这可能表明成骨前体细胞通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生更多的能量（图3）。先前利用Seahorse技术的研究表明，在成骨前体细胞中，OXPHOS约占ATP生成的60%，但在成熟成骨细胞中显著下降，此时约80%的能量由有氧糖酵解提供⁹。本研究结果表明，三种主要底物均参与成骨前体细胞中的OX.......

讨论

该方案提供了一种易于使用的方法，用于测定主要能量底物的氧化速率。相较于其他使用带有中央小室并以橡胶塞密封的烧瓶的方法，本方案更为简便^14,15,16。尽管本文示例研究采用细胞培养进行，但该方法可轻松适用于含有完整线粒体的组织外植体或组织匀浆，如先前所述¹⁷。

本方案中需要考虑的一些关键步骤包括试剂的准备以及用于¹⁴CO₂捕获的试管设置。确保油酸与牛血清白蛋白（BSA）充分结合至关重要，以防止游离脂肪酸（FFAs）损伤细胞膜，并促进细胞有效摄取以进行代谢。BSA溶液加热至完全溶解即可，避免长时间孵育，因为在70 °C下长时间加热会导致BSA发生不可逆的凝固。

由于L-谷氨酰胺等底物的半衰期较短，每次实验均需配制新鲜的cMEMα。最后，滤纸应足够大，以确保.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 µm 滤膜	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	用于过滤 BSA 溶液
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200056	用于从细胞培养板上解离细胞
1.5 mL 离心管	PR1MA	PR MCT17 RB	用于反应孵育
10 cm 培养皿	TPP	93100	用于细胞培养
10 mL 注射器	BD	302995	用于冲洗长骨中的骨髓
10% 胎牛血清（FBS）	Atlanta biologicals	S11550	用于细胞培养基的配制
14C-葡萄糖	PerkinElmer	NEC042X050UC	用于制备含同位素的培养基（hot media）
14C-谷氨酰胺	PerkinElmer	NEC451050UC	用于制备含同位素的培养基（hot media）
14C-油酸	PerkinElmer	NEC317050UC	用于制备含同位素的培养基（hot media）
23 G 针头	BD	305120	用于冲洗长骨中的骨髓
24 孔板	TPP	92024	用于细胞培养
70 μm 细胞筛	MIDSCI	70CELL	用于颅骨消化过程中过滤上清液
吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染料	Nexcelom Biosciences	CS2-0106	对活细胞进行染色以确定接种密度
牛血清白蛋白（Bovine Serum Ablumin）	Proliant Biologicals	68700	用于脂肪酸偶联
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biosciences		测定活细胞数量
离心机	Thermo Fisher	Legend Micro 21R	用于沉淀细胞
II 型胶原酶	Worthington	LS004176	用于从组织中解离细胞
定制 MEM α 培养基	GIBCO	SKU: ME 18459P1	用于配制定制的含同位素培养基（hot media）
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）	Gibco	10010023	用于溶解和稀释试剂，以及清洗培养皿
滤纸	Millipore-Sigma	WHA1001090	利用氢氧化钠捕获 CO2
葡萄糖	Sigma-Aldrich	g7528	用于配制定制培养基
HEPES	Gibco	15630080	在细胞培养过程中捕获 CO2
L-肉碱	Sigma-Aldrich	C0283	补充用于脂肪酸氧化
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	g3126	用于配制定制培养基
MEM α 培养基	Thermo	A10490	细胞培养基
Parafilm 封口膜	Pecheney Plastic Packaging	PM998	用于密封细胞培养皿
青霉素-链霉素	Thermo Fisher	15140122	防止细胞培养中的污染
高氯酸	Sigma-Aldrich	244252	在代谢测定中释放 CO2
丙酮酸盐	Sigma-Aldrich	p5280	用于配制定制培养基
液体闪烁计数器	Beckman Coulter	LS6500	测定滤纸上放射性活度
闪烁液	MP Biomedicals	882453	吸收放射性同位素释放的能量并以光脉冲形式重新发射
闪烁瓶	Fisher Scientific	03-337-1	用于盛装闪烁液的反应容器
碳酸钠	Sigma-Aldrich	S5761	用于培养基缓冲液的 pH 平衡
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	58045	在代谢测定中捕获 CO2
油酸钠	SANTA CRUZ	SC-215879	与 BSA 偶联的脂肪酸制备
真空过滤装置 1000	TPP	99950	用于过滤 cMEMα