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方法文章

评估能量底物氧化 体外 与 14CO2 捕获

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DOI：

10.3791/63568

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2022年3月23日

 ,  , 
1Translational Research Program of Pediatric Orthopedics, Department of Surgery, The Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Orthopedic Surgery, Tongji Hospital, Huazhong University of Science and Technology

本文内容

摘要

本方案描述了一种简便易行的方法，通过追踪底物氧化来检测其氧化过程 14CO2 生产 体外.

摘要

线粒体含有三羧酸（TCA）循环和电子传递链的分子机制 链（ETC），生成三磷酸腺苷（ATP）以维持能量稳态。葡萄糖、脂肪酸和氨基酸是大多数体细胞中线粒体呼吸的主要能量底物。研究表明，不同细胞类型可能对特定底物具有不同的偏好。然而，骨骼中各类细胞对底物的利用尚未得到深入研究。此外，由于细胞代谢会随生理和病理生理变化而调整，对骨骼细胞底物依赖性的直接评估可能为骨疾病发病机制提供重要见解。

以下实验方案基于底物分子经氧化磷酸化后释放二氧化碳的原理。通过使用含有放射性标记碳原子（14C）的底物，该方法可对细胞培养中底物氧化速率提供一种灵敏且易于使用的检测手段。以原代颅骨前成骨细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMMs）为例的研究表明，这两种细胞类型对主要底物的利用方式存在差异。

引言

真核生物中的氧化磷酸化（OXPHOS）是指营养物质在线粒体内被分解，通过消耗氧气以三磷酸腺苷（ATP）的形式释放化学能的过程。  多种底物在线粒体内的分解代谢通过三羧酸（TCA）循环直接产生的ATP分子较少，其主要作用是通过还原电子载体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD+）来储存能量。这些被还原的电子载体随后被位于线粒体内膜上的电子传递链（ETC）氧化，从而在线粒体内膜两侧建立质子浓度梯度。质子最终顺浓度梯度通过ATP合酶回流至线粒体基质，驱动ATP的合成。OXPHOS是能量底物生成ATP最有效的途径，通常在有氧环境中占主导地位。过去认为，有氧糖酵解——即在氧气存在下由葡萄糖生成乳酸的过程——属于病理生理现象，常被视为癌细胞的标志之一。然而，越来越多的研究发现，某些正常细胞类型也会采用有氧糖酵解，其具体原因尚待进一步阐明。

代谢灵活性是指细胞或生物体适应能量需求变化及可用燃料来源变化的能力。例如，在稳态下，骨骼肌的能量需求主要由氧化磷酸化（OXPHOS）来满足，而在高强度运动期间则主要依赖无氧糖酵解1。随着运动时间的延长，葡萄糖和脂肪酸的氧化对整体能量产生的贡献逐渐增加2。然而，底物的利用不仅取决于其可获得性，因为不同底物在氧化过程中会相互竞争。最显著的是，已有研究表明，脂肪酸氧化可通过一种称为兰德尔效应（Randle effect）的现象抑制骨骼肌对葡萄糖的利用3。后续研究还证实了其相反的作用4,5。此外，许多疾病与细胞底物利用偏好的改变以及代谢灵活性的丧失相关。例如，与正常对照个体相比，2型糖尿病患者骨骼肌中的脂肪酸氧化能力降低6。疾病状态下的代谢改变是当前深入研究的课题，因其可能参与疾病的发生发展过程。

骨骼细胞类型的能量代谢研究相对较少，但近年来已逐渐受到关注7先前的研究表明，有氧糖酵解是颅骨成骨细胞中的主要能量代谢途径，而通过三羧酸循环的葡萄糖氧化则在破骨细胞的形成过程中发挥作用。8,9其他研究者已提供证据，表明脂肪酸可作为成骨细胞的能量来源10谷氨酰胺分解代谢也被证明可支持成骨细胞从祖细胞分化11,12然而，目前对于不同骨骼细胞类型底物利用的全面理解仍然不足。此外，在细胞分化过程中或响应病理信号时，细胞代谢的变化预期会改变能量底物的利用方式。下文所述是一种易于使用的底物氧化检测方案 体外.

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方案

使用放射性材料（RAM）需事先获得各机构指定安全委员会的批准。本方案中使用的放射性材料已获得宾夕法尼亚大学环境健康与辐射安全办公室（EHRS）的批准。动物实验需事先获得所在机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。本研究已获得费城儿童医院动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

1. 14C标记底物储备液的制备

  1. 通过将11 g牛血清白蛋白（BSA）与33.1 mL杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）混合，并在室温下轻轻摇动约3小时，直至BSA完全溶解，制备4 mM BSA储备液。使用前将BSA储备液在70 °C水浴中预热。
  2. 在指定的放射性操作通风橱中，将50 µCi 14C-油酸（50 µCi/µmol，溶于乙醇）置于敞口小瓶中风干8小时。加入312.5 µL H2O，然后加入3.5 mg（11.5 µmol）油酸钠，充分混匀。
  3. 将所得溶液在水浴中加热至70 °C，加入0.9375 mL预热的BSA储备溶液，得到10 mM标记油酸储备液（其中14C-油酸与未标记油酸的摩尔比为1:11.5）。将储备液分装后于-20 °C长期保存。
  4. 将14C-葡萄糖和14C-谷氨酰胺解冻后直接使用。

2. 含14C标记底物的培养基制备

注意：为确保培养基中能量底物浓度的可靠性，必须使用定制培养基，并在使用前短时间内添加新鲜底物。此处使用一种不含葡萄糖、丙酮酸、谷氨酰胺、酚红和碳酸氢钠的定制改良必需培养基（MEMα）。然而，应针对每种细胞类型确定最佳培养基。

  1. 将8.67 g培养基粉末溶于1 L纯化水中。加入2.2 g碳酸氢钠调节pH至7.4，并使用0.22 µm真空滤器过滤溶液。
  2. 添加新鲜组分以制备完全培养基（cMEMα），终浓度分别为5.5 mM葡萄糖、2 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸盐和10%胎牛血清（FBS）。进一步向cMEMα中补充100 mM L-肉碱和10 µM HEPES，以促进脂肪酸氧化。
  3. 使用前立即向新配制的cMEMα中加入14C标记的底物，制备标记培养基。制备油酸标记培养基时，将10 mM标记油酸储备液按1:100稀释加入cMEMα中，使油酸终浓度为100 µM（终放射活性为0.4 µCi/mL）。
    注意：使用含1:11.5标记/非标记油酸比例的10 mM标记油酸储备液（见步骤2.4），可在培养基中达到生理浓度100 µM总油酸的同时，尽量减少放射性物质用量。
  4. 制备10 mM未标记油酸储备液：将24.36 mg油酸钠加入2 mL H2O中，在70 °C水浴中加热约20 min至完全溶解，迅速与6 mL预热至70 °C的4 mM BSA储备液混合。转移至37 °C水浴中孵育1 h，经0.22 µm滤器过滤。分装后于-20 °C长期保存。
  5. 制备葡萄糖标记培养基时，加入14C-葡萄糖至终浓度1.333 µM（1:4,125稀释，终放射活性0.4 µCi/mL）。制备谷氨酰胺标记培养基时，加入14C-谷氨酰胺至终浓度2 µM（1:1,000稀释，终放射活性0.4 µCi/mL）。
  6. 向葡萄糖和谷氨酰胺标记培养基中加入步骤2.4制备的10 mM未标记油酸储备液，使油酸终浓度达到100 µM，与油酸标记培养基中浓度一致。

3. 细胞的制备

注意：此处以颅骨前成骨细胞和骨髓巨噬细胞为例。用户应根据适当的实验方案制备所需类型的细胞。在预实验中优化胶原酶II的消化浓度，因其酶活性可能因不同批次而异。

  1. 颅骨前成骨细胞的分离与培养
    1. 通过断头法处死出生后第3至第5天（P3-5）的幼鼠，并将其转移至含有青霉素-链霉素（P/S）的冰冻DPBS中。
    2. 去除皮肤和软组织以暴露颅骨。在DPBS中从前向后切除周围组织，收集颅骨中部区域（图1A）。使用镊子轻轻刮擦颅骨的内表面和外表面，以帮助后续消化时细胞释放。
    3. 在DPBS中配制2 mg/mL和4 mg/mL的II型胶原酶溶液，并使用新的0.22 µm滤器过滤每种溶液。首先用2 mg/mL胶原酶溶液消化清洗后的颅骨15分钟，弃去消化液。再用4 mg/mL胶原酶溶液对清洗后的样本进行3次消化，每次15分钟，每次消化液均收集并合并保存。
    4. 将消化液通过70 µm细胞筛过滤，并在300 × g 条件下离心5分钟。将细胞沉淀重悬于含10% FBS和P/S的cMEMα（见步骤2.2）中。
    5. 计数后以4 × 104 个细胞/cm2 的密度接种于10 cm培养皿中。在37 °C、5% CO2 的培养箱中培养3天。
    6. 用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下解离细胞。计数后将细胞以7.5 × 105/cm2 的密度接种于24孔细胞培养板中，培养基为含10% FBS和P/S的cMEMα。每种细胞类型在每种基质上至少接种4孔，每种细胞类型还需额外接种至少3孔用于实验前的细胞计数。
    7. 在进行基质氧化实验前，于37 °C培养过夜。
  2. 骨髓来源巨噬细胞（BMMs）的分离与培养
    注：BMMs的培养需要巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），该因子可作为重组蛋白商业购买。本实验采用经基因工程改造可表达M-CSF的CMG14-12细胞系的条件培养基作为经济替代方案13。
    1. 从8周龄小鼠中取出股骨和胫骨，去除肌肉和结缔组织。用锋利的剪刀剪去骨骼两端并弃去。
    2. 使用装有23 G针头的注射器，将一根股骨和一根胫骨中的骨髓冲洗至10 cm培养皿中，冲洗液为含10% FBS、P/S和10% CMG14-12条件培养基（BMM培养基）的15 mL cMEMα。将细胞置于培养皿中，在37 °C、5% CO2 的培养箱中培养。
    3. 3天后，弃去培养基并用DPBS洗涤。用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下消化5分钟，解离贴壁细胞。离心后将细胞沉淀重悬于BMM培养基中。
    4. 计数后以7.5 × 105/cm2 的密度接种于24孔细胞培养板中，方法同步骤3.1.6所述。在开始实验前，于37 °C在BMM培养基中培养过夜。

4. 带有 CO2 捕获装置的底物氧化测定

注意：应针对每种细胞类型确定合适的接种密度，以在检测开始前达到 80–90% 的汇合度。请注意，细胞密度可能影响细胞的代谢状态。

  1. 用 DPBS 将额外培养孔中的细胞洗涤两次。用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 消化细胞，并将 20 µL 重悬于 DPBS 中的细胞与 20 µL 蒽啶橙/碘化丙啶（AO/PI）即用型商用染色液混合。使用自动细胞计数仪测定活细胞数量，并记录数据用于最终计算。
  2. 用 DPBS 将检测孔中的细胞洗涤两次。在 RAM 指定的组织培养超净台中，向每个检测孔加入 500 µL 预热培养基。用封口膜密封培养板，随后将细胞置于 RAM 指定的 37 °C 培养箱中孵育 4 小时。
  3. 在孵育期间，将滤纸剪成略大于 1.5 ml 微量离心管管盖内腔的圆形片状，并将滤纸片紧密插入管盖内（图 1B）。向每根离心管中加入 200 µL 1 M 高氯酸，并向管盖内放置的滤纸片上加入 20 µL 氢氧化钠溶液。
  4. 细胞孵育结束后，将每孔 400 µL 培养上清转移至已准备好的离心管中，并立即盖紧管盖。将离心管置于室温下的试管架中静置 1 小时。
  5. 在静置期间，为每根离心管准备一个闪烁液小瓶，并向其中加入 4 mL 闪烁液。将每片滤纸转移至闪烁液小瓶中，在室温下继续孵育 30 分钟。
  6. 对组织培养超净台、水浴锅（用于 14C-油酸制备）、冰箱、培养箱、水槽、地面以及任何其他工作区域进行擦拭取样，检测是否存在 RAM 污染。将擦拭纸放入含有闪烁液的闪烁液小瓶中。
  7. 使用闪烁计数器测定闪烁液小瓶中的 14C 放射性活度。记录测量结果。如有必要，根据辐射安全指南对工作环境进行去污处理。

5. 数据分析

注意：假设每种底物均被完全氧化以释放 CO2，则可根据捕获的 CO2 放射性计算底物氧化速率。

  1. 使用公式（1）以及表1中提供的不同底物对应的X、Y和Z值，计算底物氧化速率。
    底物氧化速率 (µmol/细胞/h) = 显示包含变量 X、Y、Z 及细胞参数的数学公式的方程；静态计算。   （1）
    1. 计算每个反应孔的总每分钟衰变数（DPM）。对于X，使用从0.5 mL总反应体系中取出的0.4 mL用于CO2捕获的反应液所测得的DPM值（液体闪烁计数器读数）。因此，每个反应孔的总DPM为X × 1.25。
    2. 将总DPM除以2,220,000，转换为µCi。
    3. 将µCi表示的放射性活度转换为14C标记分子的数量。将µCi值除以每种标记底物的比放射性（Y）。使用以下Y值（表1）：14C-葡萄糖：300 mCi/mmol；14C-谷氨酰胺：200 mCi/mmol；14C-油酸：50 mCi/mmol。
    4. 通过将已氧化的14C标记分子数量乘以热标记/总量稀释因子（Z），计算氧化分子的总数。使用以下Z值（表1）：葡萄糖：4,125；谷氨酰胺：1,000；油酸：12.5。
    5. 将所得乘积除以细胞数（cell#）和4（对应4 h的反应时间），以确定每个细胞的底物氧化速率。细胞数采用实验开始时平行孔中测定的cell#值。

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结果

在此示例中，CO2 采用捕获法比较颅骨原代前成骨细胞与骨髓来源巨噬细胞（BMMs）的底物氧化能力，后者常用于此类研究 体外 成骨细胞或破骨细胞分化。原代细胞传代后在cMEMα中过夜培养，通常可达到80-90%融合度，并呈现其特征性形态。颅骨前成骨细胞明显大于BMMs（图2）。每种细胞类型均通过执行步骤4.1至4.7进行葡萄糖、谷氨酰胺和油酸的氧化测定。结果通过使用公式（1).

结果显示，每种底物在颅骨成骨前体细胞中的氧化速率均显著高于骨髓巨噬细胞（BMMs），这可能表明成骨前体细胞通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生更多的能量（图3）。先前利用Seahorse技术的研究表明，在成骨前体细胞中，OXPHOS约占ATP生成的60%，但在成熟成骨细胞中显著下降，此时约80%的能量由有氧糖酵解提供9。本研究结果表明，三种主要底物均参与成骨前体细胞中的OX...

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讨论

该方案提供了一种易于使用的方法，用于测定主要能量底物的氧化速率。相较于其他使用带有中央小室并以橡胶塞密封的烧瓶的方法，本方案更为简便14,15,16。尽管本文示例研究采用细胞培养进行，但该方法可轻松适用于含有完整线粒体的组织外植体或组织匀浆，如先前所述17。

本方案中需要考虑的一些关键步骤包括试剂的准备以及用于14CO2捕获的试管设置。确保油酸与牛血清白蛋白（BSA）充分结合至关重要，以防止游离脂肪酸（FFAs）损伤细胞膜，并促进细胞有效摄取以进行代谢。BSA溶液加热至完全溶解即可，避免长时间孵育，因为在70 °C下长时间加热会导致BSA发生不可逆的凝固。

由于L-谷氨酰胺等底物的半衰期较短，每次实验均需配制新鲜的cMEMα。最后，滤纸应足够大，以确保...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01 AR060456（FL）支持。我们感谢费城儿童医院的Michael Robinson博士和Elizabeth Krizman在闪烁计数器使用方面提供的大力支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 滤膜Sigma-AldrichSLGVM33RS用于过滤 BSA 溶液
0.25% 胰蛋白酶-EDTAGibco25200056用于从细胞培养板上解离细胞
1.5 mL 离心管PR1MAPR MCT17 RB用于反应孵育
10 cm 培养皿TPP93100用于细胞培养
10 mL 注射器BD302995用于冲洗长骨中的骨髓
10% 胎牛血清（FBS）Atlanta biologicalsS11550用于细胞培养基的配制
14C-葡萄糖PerkinElmerNEC042X050UC用于制备含同位素的培养基（hot media）
14C-谷氨酰胺PerkinElmerNEC451050UC用于制备含同位素的培养基（hot media）
14C-油酸PerkinElmerNEC317050UC用于制备含同位素的培养基（hot media）
23 G 针头BD305120用于冲洗长骨中的骨髓
24 孔板TPP92024用于细胞培养
70 μm 细胞筛MIDSCI70CELL用于颅骨消化过程中过滤上清液
吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染料Nexcelom BiosciencesCS2-0106对活细胞进行染色以确定接种密度
牛血清白蛋白（Bovine Serum Ablumin）Proliant Biologicals68700用于脂肪酸偶联
Cellometer Auto 2000Nexcelom Biosciences测定活细胞数量
离心机Thermo FisherLegend Micro 21R用于沉淀细胞
II 型胶原酶WorthingtonLS004176用于从组织中解离细胞
定制 MEM α 培养基GIBCOSKU: ME 18459P1用于配制定制的含同位素培养基（hot media）
杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline）Gibco10010023用于溶解和稀释试剂，以及清洗培养皿
滤纸Millipore-SigmaWHA1001090利用氢氧化钠捕获 CO2
葡萄糖Sigma-Aldrichg7528用于配制定制培养基
HEPESGibco15630080在细胞培养过程中捕获 CO2
L-肉碱Sigma-AldrichC0283补充用于脂肪酸氧化
L-谷氨酰胺Sigma-Aldrichg3126用于配制定制培养基
MEM α 培养基ThermoA10490细胞培养基
Parafilm 封口膜Pecheney Plastic PackagingPM998用于密封细胞培养皿
青霉素-链霉素Thermo Fisher15140122防止细胞培养中的污染
高氯酸Sigma-Aldrich244252在代谢测定中释放 CO2
丙酮酸盐Sigma-Aldrichp5280用于配制定制培养基
液体闪烁计数器Beckman CoulterLS6500测定滤纸上放射性活度
闪烁液MP Biomedicals882453吸收放射性同位素释放的能量并以光脉冲形式重新发射
闪烁瓶Fisher Scientific03-337-1用于盛装闪烁液的反应容器
碳酸钠Sigma-AldrichS5761用于培养基缓冲液的 pH 平衡
氢氧化钠Sigma-Aldrich58045在代谢测定中捕获 CO2
油酸钠SANTA CRUZSC-215879与 BSA 偶联的脂肪酸制备
真空过滤装置 1000TPP99950用于过滤 cMEMα

参考文献

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