肝组织3D细胞培养模型中组蛋白翻译后修饰的全球水平定量

Summary

该协议概述了如何使用三维细胞培养系统在接近生理状态下对染色质修饰进行建模，治疗和分析。

Abstract

哺乳动物细胞的平面培养是一种广泛用于了解细胞生理学 的体外 方法，但由于细胞复制不自然的快速，该系统在模拟固体组织方面受到限制。在模拟成熟染色质时，这尤其具有挑战性，因为快速复制的细胞经常参与DNA复制并且具有异质多倍体群体。下面介绍的是使用三维（3D）细胞培养系统建模，处理和分析静态染色质修饰的工作流程。使用该协议，肝细胞癌细胞系在培养箱中作为可重复的3D球体生长，提供活性营养扩散和低剪切力。用丁酸钠和琥珀酸钠治疗分别诱导组蛋白乙酰化和琥珀酰化的增加。组蛋白乙酰化和琥珀酰化水平的增加与更开放的染色质状态有关。然后收集球状体以分离细胞核，从中提取组蛋白以分析其翻译后修饰。组蛋白分析 通过 液相色谱法在线与串联质谱法相结合，然后进行内部计算管道。最后，显示了数据表示的示例，以研究组合组蛋白标记的频率和发生。

Introduction

自19^世纪末 以来，细胞培养系统已被用作研究人体外细胞生长和发育的模型^1，2。它们的使用也已扩展到研究组织和器官如何在健康和患病环境中发挥作用^1，3。悬浮细胞（例如，血细胞）在培养皿或烧瓶中无缝且可互换地生长，因为它们 在体内不以三维（3D）结构组装。来自实体器官的细胞可以在二维（2D）或3D培养系统中生长。在2D培养中，细胞在粘附在平坦表面^{的单层中生长2，4}。2D细胞培养系统的特点是指数增长和快速倍增时间，通常为24小时至几天⁵。3D系统中的细胞生长形成复杂的细胞 - 细胞相互作用，更紧密地模拟组织样砾岩，并且它们的特征在于它们能够达到动态平衡，其中它们的倍增时间可以达到1个月或更长时间⁵。

本文介绍了一种在模拟重力降低的旋转细胞培养系统中培养3D球体的创新方法⁶。这是NASA在1990年代推出的细胞培养系统的简化衍生物

Protocol

1. 缓冲液和试剂的制备

1. 细胞生长培养基（用于HepG2 / C3A细胞）:将胎牛血清（FBS）（10%v / v），非必需氨基酸（1%v / v），L-谷氨酰胺补充剂（1%v / v）和青霉素/链霉素（0.5%v / v）添加到Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM，含有4.5 g / L葡萄糖）中。生长培养基在4°C下储存最多2周。
2. 200 mM丁酸钠（NaBut）溶液:制备10 mL，将220.18mg NaBut重悬于10 mL ddH₂O中，在-20°C下储存1mL等分试样。 在细胞处理之前，使用0.45mm注射器过滤器过滤溶液，并将1 mL过滤后的溶液加入9 mL细胞生长培养基中，工作浓度为20 mM。
3. 100mM琥珀酸钠（NaSuc）溶液:为了制备10mL，将162.05mg NaSuc重悬于10mL ddH₂O中，在-20°C下储存1mL等分试样。 在细胞处理之前，使用0.45mm注射器过滤器过滤溶液，并将1 mL过滤溶液加入9 mL细胞生长培养基中，工作浓度为10 mM。
4. 冷0.2 M H₂SO₄:制备1 L，加入10 mL浓缩H₂SO₄ 至990 mL HPLC级水。储存在4°C。
5. 冷丙酮+ 0.1%盐酸（HCl）:向丙酮中加入浓缩的HCl（0.1....

Results

在该方案中，用20 mM NaBut和10 mM NaSuc处理HepG2 / C3A球体，两者都影响组蛋白PTM的全局水平（图3A）。然后 通过 MS / MS采集在单个残留水平上鉴定和定量组蛋白PTM（图3B）。

当样品在重复中运行时，可以进行统计分析以评估样品之间PTM的倍变富集以及观察的可重复性。显示的数据表明，用乙酰化修饰的肽在用NaBut处理的球状体中富集（图3C），而用NaSuc处理的样品具有更高的组蛋白肽相对丰度用赖氨酸琥珀酰化修饰（图3D）。这些计算是在电子表格程序中完成的，详见单独的出版物³⁴。给定组蛋白修饰的总体增加可以在雷达图中得到更好的表示，其中观察某种修饰的较高全局丰度变得更加直观，即使保持有关所分析的修饰位点的详细信息（

Discussion

组蛋白PTM的分析与典型的蛋白质组学分析管道有根本的不同。大多数组蛋白PTM仍然具有神秘的生物学功能;因此，诸如基因本体论或通路数据库之类的注释不可用。存在几种资源将组蛋白修饰与负责其催化的酶或含有结合这些PTM的结构域的蛋白质（例如，HISTome³⁶）相关联。同样，当组蛋白PTM的全球水平受到调节时，可以推测染色质的整体状态。例如，组蛋白乙酰化或其他酰化（如琥珀酰化）的总体增加通常与染色质脱缩^37，38有关。

MS分析提供了有关这些修饰的更详细的信息，例如它们在氨基酸序列上的确切定位。在该协议中，MS / MS采集用于鉴定和定量组蛋白PTM，这对于生物学解释至关重要。例如，组蛋白H3（H3K4me3）赖氨酸4上的三甲基化在主动转录基因³⁹的启动子上富集，而对赖氨酸9（H3K9me3）基准的相同修饰是组成性异染色质⁴⁰。组.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Gibco	25300054
0.5-20 &微量;L 移液器吸头	BRAND	13-889-172 （Fisher Scientific）
1.5 mL 微量离心管	Bio-Rad	2239480
10 &微量;L 多通道移液器	BRAND	BR7059000 （Millipore Sigma）
10 mL 注射器	Henke Sass Wolf	14-817-31 （Fisher Scientific）	鲁尔锁头，刻度至 12 mL
10、20、200 和 1000 &微量;L 单通道移液器	Eppendorf	14-285-904 （Fisher Scientific）
1000 µL 移液器吸头	Rainin	30389164
18 G 注射器针头	Air-Tite	14-817-100 （Fisher Scientific）	3 英寸长，0.05 英寸直径
200 µL 多通道移液器	Corning	4082
2-200 & micro;L 型移液器吸头	BRAND	Z740118 （Millipore Sigma）
24 孔超低吸附微孔板	Corning	07-200-602
75 cm2 U 形细胞培养瓶	Corning	461464U	未处理，带通气帽
96 孔裙边板	Axygen	PCR-96-FS-C （Corning）
丙酮	Fisher Scientific	A949-1	丙酮应冷使用
氢铵 （NH4HCO3）	Sigma-Aldrich	A6141-25G
氢氧化铵解决方案	Fisher Scientific	AC423300250
细胞培养级水	康宁	25-055-CV
ClinoReactor	CelVivo	10004-12	用于 3D 细胞培养的生物反应器
ClinoStar	CelVivo	N/A	用于 3D 细胞培养的 CO2 培养箱
用于	CelVivo	N/A	片剂设置
Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM）	康宁	17-205-CV	1X 溶液，含 4.5 g/L 葡萄糖和丙酮酸钠，不含 L-谷氨酰胺和酚红
胎牛血清 （FBS）	康宁	35-010-CV
甲酸	Thermo Scientific	28905
通风橱	Mott	N/A	型号 7121000
玻璃巴斯德移液器	Fisher Scientific	13-678-8B	9"，棉塞，硼硅酸盐玻璃，非无菌
Glutagro 补充剂	Corning	25-015-CI	200 mM L-ananyl-L-glutamine
Hank's 平衡盐溶液 （HBSS）	康宁	21-022-CV	不含钙、镁和酚红的 1X 溶液
HPLC 级乙腈	Fisher Scientific	A955-4
HPLC 级水	Fisher Scientific	W6-1
盐酸 （HCl）	Fisher Scientific	A481-212
冰	N/A	N/A
MEM非必需氨基酸	康宁	25-025-CI	100X 溶液
Oasis HLB 树脂	Waters	186007549	亲水亲脂平衡 （HLB） 树脂与 30µm 粒径
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 质谱仪	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	高分辨率质谱仪
Oro-Flex I 聚丙烯滤板	Orochem	OF1100	96 孔聚丙烯滤板，带 10 µM PE 筛板
青霉素-链霉素	康宁	30-002-CI	100X 溶液
pH 纸	水合Z111848	（Sigma-Aldrich）	0-13 pH 试纸
移液器枪	Eppendorf	Z666467 （Millipore Sigma）
多微毛细管	Molex	50-110-7740 （Fisher Scientific）	带聚酰亚胺涂层的柔性熔融石英毛细管，75 µM ID x 363 和微型;M OD
聚苯乙烯 10 mL 血清移液管，无菌	Fisher Scientific	1367549
丙酸酐	Sigma-Aldrich	240311-50G
冷冻离心机	Thermo Scientific	75-217-420
Reprosil-Pur 树脂	MSWIL	R13。AQ.0003	120 Å 孔径，C18-AQ 固定相，3 µM 珠子大小
旋转器	Clay Adams	25477（美国实验室贸易）	章动器混合器 1105
测序级改良胰蛋白酶	Promega	V5111
丁酸钠	Thermo Scientific	A11079
琥珀酸钠氢二酯	Sigma-Aldrich	14160-100G
SpeedVac 真空浓缩仪（1.5 mL 微量离心管）	Savant	20249（美国实验室贸易公司）
SpeedVac 真空浓缩仪（96 孔）	Thermo Scientific	15308325	Savant SPD1010
无菌罩	Thermo Scientific	1375	II 级，A2 型
（H2SO4）	Fisher Scientific	02-004-375	Baker 分析型 ACS 试剂
经组织培养处理的 100 mm x 20 mm 培养皿	Fisher Scientific	08-772-23
三氯乙酸 （TCA）	Thermo Scientific	AC421451000	在 HPLC 级水中重悬 100% w/v 三
氟乙酸 （TFA）	Fisher Scientific	PI28904	测序级
真空歧管 96 孔	Millipore	MAVM0960R
涡旋	Sigma-Aldrich	Z258415
水浴	Fisher Scientific	FSGPD10
宽口径移液器吸头 1000 µL	Axygen	14-222-703 （Fisher Scientific）
大口径移液器吸头 200 µL	Axygen	14-222-730（费舍尔科学）