用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间分析

摘要

蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散过程中起着重要作用，但仍有多种相关蛋白质尚未被鉴定。数字空间分析技术（DSP）为高效、高通量地表征可能参与浸润性胶质瘤侵袭与迁移的候选蛋白质的差异表达提供了一种有效方法。

摘要

弥散性浸润性胶质瘤由于肿瘤扩散的浸润特性，常伴随较高的发病率和死亡率。这类肿瘤在形态上具有复杂性，其自身及异质性微环境中的蛋白质组均表现出高度变异性。多种关键信号通路中参与维持细胞稳定性及微环境结构完整性的蛋白质发生失调，进一步增强了这些肿瘤的恶性潜能。尽管已有大量针对胶质瘤的群体水平和单细胞分析研究，但这些蛋白质组学数据在空间分布上的分层信息仍相对匮乏。明确致瘤因子和免疫细胞群体在肿瘤实质、侵袭边缘及微环境之间的空间分布差异，有助于深入理解肿瘤增殖与播散的潜在机制。数字空间蛋白分析技术（Digital spatial profiling, DSP）正是一种强大的技术手段，可为这些重要的多层次分析提供坚实基础。

数字空间谱型分析（DSP）是一种可在组织样本中用户指定的空间区域内高效定量蛋白质表达水平的方法。DSP 非常适用于研究不同区域内部及之间多种蛋白质的差异性表达，支持多层面的定性和定量分析。DSP 实验流程系统性强且操作简便，可实现对蛋白质组学数据的定制化空间分析。在本实验中，组织微阵列由存档的胶质母细胞瘤穿刺核心样本构建而成。随后，选择一组特异性抗体，靶向样本中感兴趣的蛋白质。这些抗体预先偶联了可被紫外光（UV）裂解的DNA寡核苷酸，随后与组织样本在4℃孵育过夜。在荧光显微镜下观察抗体信号后，于样本中划定用于定量蛋白质表达的兴趣区域（ROIs）。接着，将紫外光照射至各个兴趣区域，使DNA寡核苷酸发生裂解。裂解后的寡核苷酸被微量吸取并分别计数，从而实现基于空间位置的相应蛋白质定量。

引言

弥漫性浸润性胶质瘤是成人中最常见的恶性脑肿瘤，且 invariably 致命。胶质瘤细胞在脑内广泛迁移的倾向性给治疗带来了重大挑战。其扩散机制涉及定向迁移和不受控制的侵袭。研究表明，侵袭性胶质瘤细胞表现出沿白质纤维束趋向性迁移的特性¹，近期研究进一步指出这些纤维束的脱髓鞘化是一种主动的、促肿瘤发生的特征²。这种侵袭过程由上皮-间质转化介导，胶质瘤细胞通过下调编码细胞外基质蛋白和细胞黏附分子的基因表达，获得间质样特性，从而增强迁移能力，并促进其在肿瘤微环境中的播散^3,4,5。

在分子水平上，已有研究证实多种维持细胞稳定性和与免疫原性组分相互作用的蛋白质功能受到破坏⁶。浸润性胶质瘤已知会抑制具有抗凋亡特性（如 PTEN）的蛋白质表达⁷，同时还会过表达促进逃避免疫系统识别的蛋白质（如 PD1/PDL1）⁸。这些复杂通路的失调增强了肿瘤发生能力，并提高了恶性潜能。

在侵袭性胶质瘤样本中，本研究旨在评估细胞生长....

方案

以下方案遵循达特茅斯-希契科克人类研究伦理委员会的指导原则。已获得提供组织样本的患者的知情同意。有关本方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表部分。

1. 载玻片制备¹⁷

1. 获取或制备来自成人型弥漫性浸润性胶质瘤的人体组织福尔马林固定、石蜡包埋样本。
   注意：本实验中使用了三例胶质母细胞瘤患者活检样本的石蜡包埋组织块。
2. 构建组织微阵列（TMA）蜡块。从每例活检样本中取出多个直径2 mm的组织芯，植入同一个TMA蜡块中（图1，顶部）。将TMA蜡块切成4 µm厚的切片，贴附于玻璃载玻片上。将每张载玻片放入载玻片托架垫圈内。在60 °C下孵育30分钟。

2. 免疫组化半自动系统的准备与软件配置（用于载玻片的加载与运行）¹⁷

1. 准备试剂。点击 试剂配制 按钮。单击 添加 在 设置 表。
   1. 通过在其中输入名称来注册一种洗涤缓冲液 ....

结果

图4展示了在胶质母细胞瘤样本上进行的DSP实验的代表性结果。图中显示了一个热图，用于说明如何通过DSP软件以可视化方式呈现数据。每一行代表一个蛋白质靶标，每一列对应一个感兴趣区域。颜色从蓝色到红色表示表达水平从低到高。同一行内颜色的差异反映了不同区域间蛋白质表达的异质性，提示可能存在与蛋白质差异表达相关的空间分布特征。例如，在本实验中，S100和CD56在所有区域均呈现高表达，因为它们是神经标记物。

变异程度最高的标志物包括 B7-H3、Ki-67、CD44 和纤连蛋白。这些标志物分别与肿瘤增殖、迁移和转移具有重要关联。因此，在恶性肿瘤核心、恶性浸润区域以及非恶性组织样本之间，这些标志物表现出区域性的差异是合理的。此外，也可进行数值化数据表示；可导出包含各 ROI 内每种蛋白标志物表达值的表格文件，用于数学和统计分析。该表达值由 DSP 提供的数字计数功能生成，该功能可定量每个 ROI 内微吸取的 PC-寡核苷酸（图 1 和

讨论

鉴于可能影响胶质瘤侵袭性的蛋白质具有多样性，且其中一些蛋白质尚未被发现，高通量蛋白质定量方法是一种理想的技术手段。此外，由于肿瘤样本中的空间数据通常与差异表达相关¹⁸，将空间分析整合到蛋白质定量方法中可实现更有效的分析。

DSP 的高通量方法还可用于类似鸟枪法的策略，这非常适用于发现潜在的新型疾病生物标志物以及治疗反应的标志物。在两项关于黑色素瘤的研究中，DSP 被用于评估伊匹单抗联合纳武单抗治疗与纳武单抗单药治疗的反应¹⁹，以及伊匹单抗联合纳武单抗新辅助治疗与标准辅助治疗的对比²⁰。在这两项研究中，治疗后对多种蛋白质靶标的 DSP 分析显示关键免疫标志物的相对表达存在差异，提示这些标志物可能作为治疗反应的潜在生物标志物发挥作用。

DSP 还有助于确定复杂分子水平过程的最终病理学意义。例如，侵袭性胶质瘤的一个显著特征是其直接穿过细胞外基质（ECM）迁移的倾向，且其迁移路径通常受到血管和.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BOND 研究检测系统	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	含有试剂托盘中开放式容器的开放式检测系统
BOND 洗涤液	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	用于洗涤固定组织的 10 倍浓缩缓冲液
缓冲液 W	NanoString, Seattle, WA	contact company	封闭试剂
Cy3 偶联试剂盒	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 荧光抗体偶联试剂盒
GeoMx 数字空间分析仪（DSP）	NanoString, Seattle, WA	contact company	用于成像和表征蛋白质与 RNA 靶标的系统
GeoMx DSP 仪器缓冲液试剂盒	NanoString, Seattle, WA	100471	GeoMx DSP 缓冲液试剂盒（包含样本处理和制备所需缓冲液）
GeoMx 杂交编码包_蛋白质	NanoString, Seattle, WA	121300401	用于运行 GeoMx DSP 实验的对照
GeoMx 免疫细胞面板（Imm Cell Pro_Hs）	NanoString, Seattle, WA	121300101	针对人类免疫细胞及免疫肿瘤学靶点的蛋白质模块
GeoMx 泛肿瘤面板（Pan-Tumor_Hs）	NanoString, Seattle, WA	121300105	针对多种人类肿瘤类型及上皮-间质转化标志物的蛋白质模块
GeoMx 蛋白质切片制备 FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	用于 GeoMx DSP 蛋白质分析的样本制备试剂
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	全自动免疫组化染色仪
主试剂盒——12 次反应	NanoString, Seattle, WA	100052	与 nCounter 分析系统配合使用的材料和试剂
nCounter 分析系统	NanoString, Seattle, WA	contact company	用于多重靶标表达定量的自动化系统（需与 GeoMx DSP 联用）
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		用于构建组织微阵列块