方法文章

用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间剖析

DOI：

10.3791/63620

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2022年9月13日

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1Department of Neurology, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 3Department of Neurosurgery, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 4Dartmouth Cancer Center, Dartmouth-Hitchcock Medical Center

本文内容

摘要

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蛋白质组学失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散中起重要作用，但几种相关蛋白质仍未鉴定。数字空间处理（DSP）提供了一种高效、高通量的方法，用于表征可能导致浸润性胶质瘤侵袭和迁移的候选蛋白的差异表达。

摘要

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弥漫性浸润性胶质瘤由于肿瘤扩散的浸润性而与高发病率和死亡率相关。它们是形态复杂的肿瘤，在肿瘤本身及其异质微环境中具有高度的蛋白质组学变异性。这些肿瘤的恶性潜力通过参与几个关键途径的蛋白质失调而增强，包括维持细胞稳定性和保持微环境结构完整性的过程。尽管已经进行了大量和单细胞胶质瘤分析，但这些蛋白质组学数据的空间分层相对缺乏。了解内在肿瘤、侵袭边缘和微环境之间致瘤因子和免疫细胞群的空间分布差异，为肿瘤增殖和增殖的机制提供了有价值的见解。数字空间剖析 （DSP） 代表了一种强大的技术，可以为这些重要的多层分析奠定基础。

DSP是一种有效定量组织标本中用户指定空间区域内蛋白质表达的方法。DSP是研究区分区域内和跨区分区域多种蛋白质差异表达的理想选择，可实现多层次的定量和定性分析。DSP协议是系统且用户友好的，允许对蛋白质组学数据进行定制的空间分析。在该实验中，组织微阵列由存档的胶质母细胞瘤核心活检构建。接下来，选择一组抗体，靶向样品中感兴趣的蛋白质。然后将预偶联到紫外光切割DNA寡核苷酸的抗体与组织样品一起孵育过夜。在抗体的荧光显微镜可视化下，用样品定义用于定量蛋白质表达的感兴趣区域（ROI）。然后将紫外线照射到每个ROI，切割DNA寡核苷酸。微吸寡核苷酸在每个ROI内计数，在空间基础上量化相应的蛋白质。

引言

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弥漫性浸润性胶质瘤是成人中最常见的恶性脑肿瘤类型，并且总是致命的。神经胶质瘤细胞在大脑中广泛迁移的倾向是一个主要的治疗挑战。它们的传播机制包括定向迁移和不受控制的入侵。浸润性胶质瘤细胞已被证明沿白质束1 表现出嗜性和迁移性，最近的研究表明这些束脱髓鞘是一种活跃的促肿瘤特征2。侵袭由上皮到间充质转化介导，其中胶质瘤细胞通过减少编码细胞外基质蛋白和细胞粘附分子的基因的表达来获得间充质特性，放大迁移并促进通过肿瘤微环境的繁殖3，4，5。

在分子水平上，已经证明了几种赋予细胞稳定性并与免疫原性成分界面的蛋白质的破坏6。已知浸润性胶质瘤会抑制具有抗凋亡（例如PTEN）特性的蛋白质7。它们还过表达促进逃避宿主免疫反应的蛋白质（例如，PD1/PDL1）8。这些复杂途径的失调增强了致瘤性并增加了恶性潜力。

在侵袭性胶质瘤样本中，目的是评估对细胞生长、存活和增殖以及侵袭性和非侵入性成分之间的微环境结构完整性至关重要的蛋....

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方案

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下面概述的协议遵循达特茅斯 - 希区柯克人类研究伦理委员会的指导方针。从本研究中包括组织样本的患者获得知情同意。有关此协议中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 部分。

1. 载玻片准备17

  1. 从人成人型弥漫性浸润性胶质瘤中检索或制备福尔马林固定的石蜡包埋组织。
    注意:在该实验中，使用了来自三名胶质母细胞瘤患者的石蜡包埋活检块。
  2. 创建组织微阵列 （TMA） 模块。从每个活检中取出几个2毫米的核心，并将它们放在一个TMA块中（图1，顶部）。从 TMA 块上切割 4 μm 的部分并安装到载玻片上。将每张载玻片放在载玻片支架垫圈内。将载玻片在60°C孵育30分钟。

2. 半自动IHC系统准备和软件配置（用于载玻片的加载和运行）17

  1. 设置试剂。单击试剂设置按钮。单击"设置"选项卡中的"添加"。
    1. 通过在"名称"字段中键入洗涤缓冲区的名....

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结果

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图4 显示了对胶质母细胞瘤样本进行的DSP实验的代表性结果。展示了一个热图，说明了使用DSP软件直观地捕获数据的方法之一。行代表蛋白质靶标，每列对应于一个感兴趣区域。蓝色到红色的颜色范围分别表示低到高表达。行内颜色的变异性反映了区域蛋白质的异质性，并表明可能与差异蛋白质表达的空间关联。例如，在本实验中，S100和CD56普遍较高，因为它们是神经标记。

变异性最大的标志物包括B7-H3、Ki-67、CD44和纤连蛋白。这些标志物分别与肿瘤增殖、迁移和转移有重要关联。因此，在恶性核心、恶性侵袭和非恶性组织样本之间表现出区域差异是合理的。数值数据表示也是可能的;可以以表格形式导出包含ROI中每个蛋白质标记物的表达值的文件，以进行数学和统计分析。该表达值由DSP提供的数字计数功能产生，该功能可量化每个ROI内的微量吸出PC寡核苷酸（图1 和 图2）。

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讨论

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鉴于可能影响胶质瘤侵袭性的蛋白质的多样性，以及其中一些蛋白质仍未被发现的概念，高通量蛋白质定量方法是一种理想的技术方法。此外，鉴于肿瘤样品中的空间数据通常与差异表达相关18，将空间分析纳入蛋白质定量方法可以实现更有效的分析。

DSP的高通量方法还使其能够用于类似霰弹枪的方法，这是发现疾病和治疗反应的潜在新型生物标志物的理想选择。在两项黑色素瘤研究中，DSP用于评估伊匹木单抗和纳武利尤单抗联合治疗与纳武利尤单抗单药治疗19 的反应，以及伊匹木单抗和纳武利尤单抗的新辅助联合治疗与标准辅助治疗20的反应。在这两项研究中，治疗后各种蛋白质靶标的DSP分析显示出关键免疫标志物的差异相对表达，表明治疗反应的潜在生物标志物的作用。

DSP还有助于确定复杂的分子水平过程的最终病理意义。例如，侵袭性胶质瘤的一个显着特征是它们倾向于直接通过细胞外基质（ECM）迁移，并且它们的迁移路径通常由血管和白质束引导.......

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披露

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作者没有利益冲突需要披露。

致谢

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作者感谢达特茅斯希区柯克卫生系统病理学和实验室医学系临床基因组学和先进技术实验室的支持。作者还承认达特茅斯癌症中心的病理学共享资源与NCI癌症中心支持补助金5P30 CA023108-37。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BOND Research 检测系统Leica Biosystems，Wetzlar，德国DS9455开放式检测系统，在试剂盘中装有开放容器
BOND WashLeica Biosystems，Wetzlar，德国AR950 用于洗涤固定组织的 10X 浓缩缓冲溶液
缓冲液 WNanoString，华盛顿州西雅图联系公司封闭试剂
Cy3 偶联试剂盒英国剑桥 AbcamAB188287Cy3 荧光抗体偶联试剂盒
GeoMx 数字空间分析器 （DSP）NanoString，华盛顿州西雅图联系公司和 RNA 靶标成像和表征系统
GeoMx DSP 仪器 BufferKitNanoString，华盛顿州西雅图100471GeoMX DSP 缓冲液试剂盒（包括用于样品处理和制备的缓冲液）
GeoMx Hyb 代码 Pack_ProteinNanoString，华盛顿州西雅图121300401运行 GeoMX DSP 实验的对照
GeoMx 免疫细胞检测组合 （Imm Cell Pro_Hs）NanoString，华盛顿州西雅图121300101人类免疫细胞和免疫肿瘤靶标靶标的蛋白质模块
GeoMx 泛肿瘤检测组合 （Pan-Tumor_Hs）NanoString，华盛顿州西雅图121300105蛋白质模块，具有多种人类肿瘤类型和上皮-间质转化标志物的靶标
GeoMx 蛋白质载玻片制备 FFPENanoString，华盛顿州西雅图121300308用于 GeoMX DSP 蛋白质分析的样品制备试剂
LEICA Bond RXLeica Biosystems，Wetzlar，德国联系公司全自动 IHC 染色机
主试剂盒--12 次反应NanoString，华盛顿州西雅图100052用于 nCounter 分析系统的材料和试剂
nCounter 分析系统 NanoString，西雅图，华盛顿州 联系公司用于多重靶标表达定量的自动化系统（与 GeoMx DSP 一起使用）
TMA Master II3DHistech Ltd.，匈牙利组织微阵列块
蛋白质 具有布达佩斯 创建

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
  2. Wang, J., et al. Invasion of white ....

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重印与许可

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