用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间分析

摘要

蛋白质组失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散过程中起着重要作用，但仍有多种相关蛋白质尚未被鉴定。数字空间分析技术（DSP）为高效、高通量地表征可能参与浸润性胶质瘤侵袭与迁移的候选蛋白质的差异表达提供了一种有效方法。

摘要

弥散性浸润性胶质瘤由于肿瘤扩散的浸润特性，常伴随较高的发病率和死亡率。这类肿瘤在形态上具有复杂性，其自身及异质性微环境中的蛋白质组均表现出高度变异性。多种关键信号通路中参与维持细胞稳定性及微环境结构完整性的蛋白质发生失调，进一步增强了这些肿瘤的恶性潜能。尽管已有大量针对胶质瘤的群体水平和单细胞分析研究，但这些蛋白质组学数据在空间分布上的分层信息仍相对匮乏。明确致瘤因子和免疫细胞群体在肿瘤实质、侵袭边缘及微环境之间的空间分布差异，有助于深入理解肿瘤增殖与播散的潜在机制。数字空间蛋白分析技术（Digital spatial profiling, DSP）正是一种强大的技术手段，可为这些重要的多层次分析提供坚实基础。

数字空间谱型分析（DSP）是一种可在组织样本中用户指定的空间区域内高效定量蛋白质表达水平的方法。DSP 非常适用于研究不同区域内部及之间多种蛋白质的差异性表达，支持多层面的定性和定量分析。DSP 实验流程系统性强且操作简便，可实现对蛋白质组学数据的定制化空间分析。在本实验中，组织微阵列由存档的胶质母细胞瘤穿刺核心样本构建而成。随后，选择一组特异性抗体，靶向样本中感兴趣的蛋白质。这些抗体预先偶联了可被紫外光（UV）裂解的DNA寡核苷酸，随后与组织样本在4℃孵育过夜。在荧光显微镜下观察抗体信号后，于样本中划定用于定量蛋白质表达的兴趣区域（ROIs）。接着，将紫外光照射至各个兴趣区域，使DNA寡核苷酸发生裂解。裂解后的寡核苷酸被微量吸取并分别计数，从而实现基于空间位置的相应蛋白质定量。

引言

弥漫性浸润性胶质瘤是成人中最常见的恶性脑肿瘤，且 invariably 致命。胶质瘤细胞在脑内广泛迁移的倾向性给治疗带来了重大挑战。其扩散机制涉及定向迁移和不受控制的侵袭。研究表明，侵袭性胶质瘤细胞表现出沿白质纤维束趋向性迁移的特性¹，近期研究进一步指出这些纤维束的脱髓鞘化是一种主动的、促肿瘤发生的特征²。这种侵袭过程由上皮-间质转化介导，胶质瘤细胞通过下调编码细胞外基质蛋白和细胞黏附分子的基因表达，获得间质样特性，从而增强迁移能力，并促进其在肿瘤微环境中的播散^3,4,5。

在分子水平上，已有研究证实多种维持细胞稳定性和与免疫原性组分相互作用的蛋白质功能受到破坏⁶。浸润性胶质瘤已知会抑制具有抗凋亡特性（如 PTEN）的蛋白质表达⁷，同时还会过表达促进逃避免疫系统识别的蛋白质（如 PD1/PDL1）⁸。这些复杂通路的失调增强了肿瘤发生能力，并提高了恶性潜能。

在侵袭性胶质瘤样本中，本研究旨在评估细胞生长、存活、增殖以及微环境结构完整性相关关键蛋白在侵袭性与非侵袭性组分之间的差异表达。此外，我们还致力于研究具有主动免疫原性作用的蛋白质的差异调控，以揭示宿主免疫防御功能受损如何增强胶质瘤增殖和侵袭潜能的机制。这一点尤为重要，因为近期大量研究已表明，恶性肿瘤中免疫标志物及失调驱动因子可作为免疫治疗的靶点。在参与免疫监视和免疫应答的众多蛋白质中识别出可行的治疗靶点，需要采用高灵敏度且全面的研究方法。

鉴于可研究的候选蛋白质种类繁多，我们寻求一种类似于免疫组织化学但具有更高数据处理效率的方法。在癌症生物学领域，数字空间分析（DSP）已发展成为一种强大的技术，在蛋白质组分析与定量方面相较于其他工具具有重要优势。DSP 的显著特征是其高通量多重检测能力，可在同一样本中同时研究多种不同蛋白质，这使其与标准但低重数的技术（如免疫组织化学，IHC）形成重要区别^9,10。DSP 的多重检测特性并未牺牲其作为定量与分析工具的准确性，已有研究通过将 DSP 与 IHC 进行比较证实了这一点。例如，在对非小细胞肺癌标本进行蛋白质组定量时，DSP 所得结果与 IHC 相似¹¹。此外，DSP 提供可自定义的区域选择功能，用户可手动划定进行蛋白质组分析的特定区域，这一优势优于全切片多重检测方法^10,12。因此，在单次处理过程中，DSP 即可通过对多个感兴趣区域内的多种蛋白质靶标进行检测，实现多层次的分析。

DSP 在多种不同的病理条件下具有应用价值。在肿瘤学分析中，DSP 尤其具有优势，因为空间异质性可能与细胞转化及差异性蛋白表达相关。例如，DSP 已被用于比较乳腺癌与其邻近肿瘤微环境的蛋白质组学特征。这对于理解该肿瘤的自然病程及其进展，以及潜在的治疗反应具有重要意义¹³。其他体现 DSP 多功能性的情境包括：在前列腺癌中对蛋白质多样性进行空间定量分析¹⁴，在头颈部鳞状细胞癌中将免疫细胞标志物表达与疾病进展相关联¹⁵，以及揭示区分转移性与原发性透明细胞卵巢癌的上皮-间质蛋白表达梯度¹⁶。通过应用 DSP，我们能够表征可能影响胶质瘤发生及侵袭行为的蛋白质空间分布特征。

方案

以下方案遵循达特茅斯-希契科克人类研究伦理委员会的指导原则。已获得提供组织样本的患者的知情同意。有关本方案中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表部分。

1. 载玻片制备¹⁷

1. 获取或制备来自成人型弥漫性浸润性胶质瘤的人体组织福尔马林固定、石蜡包埋样本。
   注意：本实验中使用了三例胶质母细胞瘤患者活检样本的石蜡包埋组织块。
2. 构建组织微阵列（TMA）蜡块。从每例活检样本中取出多个直径2 mm的组织芯，植入同一个TMA蜡块中（图1，顶部）。将TMA蜡块切成4 µm厚的切片，贴附于玻璃载玻片上。将每张载玻片放入载玻片托架垫圈内。在60 °C下孵育30分钟。

2. 免疫组化半自动系统的准备与软件配置（用于载玻片的加载与运行）¹⁷

1. 准备试剂。点击 试剂配制 按钮。单击 添加 在 设置 表。
   1. 通过在其中输入名称来注册一种洗涤缓冲液 名称 领域。选择 辅助的 在 类型 领域。点击 保存.
   2. 使用相同的步骤（根据实际情况进行相应修改，例如在以下情况中）重复操作以配制封闭溶液 名称 视野），但选择 一抗 在 类型 领域。在下拉框中选择所需的方案 默认染色方案 和 默认HIER方案选择一个 默认酶反应方案 如有需要，可选择此选项（本方案中该选项框留空）。点击 保存.
2. 注册 检测系统，由一个条形码 试剂容器托盘. 扫描 的 条形码.
   1. 开始输入试剂系统的详细信息 添加研究试剂系统 窗口。键入 a 名称 用于检测系统。
   2. 输入一个 有效期. 重点 的 第一行 的 试剂 图表和 扫描 的 条形码 30 mL的新款 试剂容器，此时条形码将填充至第1行。
   3. 将容器置于位置1 检测系统. 在下拉框中选择洗涤缓冲液的名称 试剂 柱并单击 添加重复上述步骤，依次在后续各列中加入其他试剂，包括封闭液。
3. 设置 免疫组化蛋白质实验方案 点击 实验方案设置. 选中与所需方案对应的行，然后点击 复制。输入 名称 并填写其他任何相关字段 编辑实验方案属性 窗口
   1. 选择该复选框 显示洗涤步骤确认 增量（分钟） 和 分配类型 每种试剂的字段均正确10 分钟 对于 封闭液，0 分钟 对于 洗涤缓冲液，以及 150 µL 每个 分配类型）。点击 保存.
4. 准备实验。将位置1的容器装满 洗涤缓冲液. 每张载玻片加入150 µL，死体积为5 mL；保持盖子打开。对位于位置2的容器重复上述步骤，该容器应装入 封闭液该容器每张载玻片应含有150 µL，死体积为350 µL。
   1. 加载 试剂容器托盘 上机。让系统执行容器识别和体积确认操作。点击 载玻片设置 | 添加研究. 输入 研究编号 和 研究名称 并选择 150 µL 下 分配体积 的 理想方案 在 制备方案 下拉菜单烘烤与脱蜡 建议）突出显示该研究并点击 添加载玻片.
   2. 选择 测试组织 下 组织类型 | 150 µL 在……下方 分配体积 | 单通道 和 常规 从 染色模式 下拉框。选择一个 过程 (免疫组织化学 （针对本研究）| 该 封闭液名称 在下拉框中 标记物 领域 IHC DSP 实验方案 在 染色 领域 实验方案 标签 | *烘烤与脱蜡 用于 制备 | *HIER 20 分钟，使用 ER1 用于 HIER。静置 酶 现场空白样
   3. 对每张载玻片重复此过程。点击 关闭 完成后，点击 打印标签检查 当前研究尚未打印全部载玻片标签 并点击 打印将标签贴在载玻片的顶部。
5. 加载并运行切片。将切片放置于切片托盘上，确保样本面和标签面朝上。放置 盖玻片 将载玻片推入载片架中，确保载玻片方向正确，标签朝下。将载片架装入仪器。
   1. 按压 LED 按钮以降低托盘，使仪器开始扫描和识别载玻片。单击 开始 开始实验的按钮。
6. 完成实验。按下 LED 当按钮闪烁绿色时，表示运行完成，此时取出仪器中的托盘，小心地从每张载玻片上取下覆盖片。将载玻片置于1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，去除多余缓冲液，再用疏水笔在每张组织切片周围画线，形成疏水屏障。

3. 抗体孵育与细胞核染色¹⁷

1. 选择一组抗体以定位目标抗原（本实验所用抗体见表1）。
   注意：每种抗体已与一段带有紫外光可切割片段（PC-oligo）的DNA寡核苷酸共价连接，该寡核苷酸可特异性识别对应抗体（索引寡核苷酸，图2）。
2. 配制工作浓度的抗体-PC-oligo溶液：每张切片加入8 µL每种抗体（按1:40稀释），用封闭试剂作为稀释液，使每张切片总体积达到200 µL。4 °C孵育过夜（图3，步骤1）。
   注意：此步骤中也可向溶液中添加形态学标记物、生物染料或荧光标记抗体。
3. 次日，将切片置于考普林瓶中，用1x TBS-T缓冲液洗涤3次，每次10分钟。随后在室温下用4%多聚甲醛固定30分钟，再用1x TBS-T缓冲液洗涤2次，每次5分钟。
4. 加入SYTO13核染色剂（用1x TBS缓冲液按1:10稀释），室温孵育15分钟。用1x TBS-T缓冲液洗涤2次后，将切片保存于1x TBS-T缓冲液中。

4. 在 DSP 仪器上进行荧光可视化、ROI 鉴定和紫外光解¹⁷

1. 在控制中心将鼠标悬停于数据采集上，然后选择新建/继续运行。
2. 将切片放入切片架中，标签朝向用户。放下切片托盘夹，确保组织在长条形窗口中可见。 加入 6 mL 缓冲液 S。
3. 按照控制中心中的提示操作。使用X-和Y-滑块在不同轴之间缩放，以划定扫描区域。选择扫描。让扫描持续进行，直至整个定义的目标区域完成成像。
4. 生成 20 倍图像。通过自动或手动方式定义感兴趣区域（ROI）（图 3，步骤 2）。为遵循本方案，为每个组织芯选择三个尺寸相同、呈圆形的 ROI（直径为 250 µm）（图 4，底部）。
   注意：ROI 的大小和形状可自定义。每个切片中可选择多个 ROI。本实验中，ROI 为手动定义。
5. 单击退出扫描工作区按钮以确认 ROI。等待紫外光将寡核苷酸从抗体上解离。
6. 当清洗仪器过程完成后，选择新建数据采集以继续使用当前切片或微孔板；否则选择移除切片和微孔板。
7. 在控制中心右下角双击微孔板图标区域，打开完成微孔板窗口。如果已知杂交（Hyb）编码包批号（#），请输入该编号并单击更新（此步骤中为可选项）。单击完成。
8. 根据提示拆下切片架和收集板。将切片储存在 TBS-T 中。如果切片长时间不使用，应覆盖水性介质并加盖盖玻片。

5. 蛋白质检测¹⁷

1. 使用透气封膜，在热循环仪中于65 °C下将吸出液干燥（仪器盖子保持打开状态）。加入7 µL经焦碳酸二乙酯处理的水并混匀。室温孵育10分钟，然后快速离心。
2. 从表2中选择合适的Probe R和Probe U计算公式，以指导探针/缓冲液混合液的配制。根据本实验中杂交所需的Hyb Codes数量，应用如下公式（1）。混匀后立即快速离心。
   # Hyb Codes 探针R工作母液 探针U工作母液 杂交缓冲液 n = _______ (n × 8 µL) = _____ µL + (n × 8 µL) = ______ µL + (n × 80 µL) = _____ µL （1）
3. 向每个待使用的Hyb Code Pack中加入84 µL探针/缓冲液混合液。轻弹混匀后快速离心。在新的96孔杂交板中，将每种Hyb Code主混合液各8 µL加入指定行的全部12个孔中。
4. 从DSP收集板中转移7 µL液体至杂交板的对应孔中，轻轻混匀。热封后快速离心。然后在67 °C下过夜孵育。将板置于冰上冷却，再进行一次快速离心。
5. 将每个孔中的杂交产物汇集至一条排管中，用移液器轻柔吹打每孔5次以充分混匀。盖紧排管后离心。将未混合的剩余杂交产物于-80 °C冷冻保存。将排管载入分析系统。
6. 将CDF文件保存至U盘，然后将数据从DSP仪器传输至数字分析仪。通过完成以下步骤完成设置：
   1. 将耗材和混合样品加载到前处理工作站上。在屏幕上点击开始处理。选择高灵敏度，然后点击下一步。针对有样品的孔数点击全选，然后点击| 完成 | 下一步，设置电子邮件通知，最后点击| 开始。
   2. 当前处理工作站运行完成后，密封检测盒并转移至数字分析仪。点击开始计数，选择载台位置，点击加载已有CDF文件，并选择先前上传的文件。点击完成，再次选择载台位置，点击完成 | 开始以运行程序。
7. 将分析系统生成的报告计数转换文件的压缩包保存至U盘，然后将U盘插入DSP仪器。在DSP控制中心中，将鼠标悬停于数据采集，然后点击上传计数，并选择相应的压缩文件。

6. 数据分析¹⁷

1. 在DSP Control Center中点击Records。要查看队列中的扫描数据，请选择Add Selected Scans to Queue | My Analysis Queue。将鼠标悬停在Control Center中的Data Analysis选项上，然后选择New Study from Queue。
2. 从Task Bar Options中选择QC。可继续使用默认值，或根据需要进行调整。选择Run QC并查看Results Grid。点击Run QC以继续并创建新数据集，将数值归一化至阳性杂交对照。
3. 将新标签导入XLSX文件。在Scans面板中选择Manage Annotations，下载模板，插入标签，然后导入该文件。
4. 可选：运行QC后，可使用其他工具栏选项进一步调整数据。使用Visualizations面板中的工具绘制转换后的数据图。
5. 在Visualizations面板中，通过灰色下拉参数框设置每个图表的参数。在图表中选择特定区域，可在Scans面板中高亮显示相应片段，右键单击以生成标签或分组。在Dataset Summary中，查看来自Normalization、Scaling及其他选项的图表，用于分析和展示。
6. 通过点击Save图标保存可视化结果；在Summary下查看已保存的可视化内容。点击Export (.svg)按钮以.svg格式导出可视化图像。点击Export (.xlsx)按钮导出可视化所基于的数据。将鼠标悬停在第二个面板中的数据集名称上，然后点击export图标，可导出该特定数据集中的所有数据。

结果

图4展示了在胶质母细胞瘤样本上进行的DSP实验的代表性结果。图中显示了一个热图，用于说明如何通过DSP软件以可视化方式呈现数据。每一行代表一个蛋白质靶标，每一列对应一个感兴趣区域。颜色从蓝色到红色表示表达水平从低到高。同一行内颜色的差异反映了不同区域间蛋白质表达的异质性，提示可能存在与蛋白质差异表达相关的空间分布特征。例如，在本实验中，S100和CD56在所有区域均呈现高表达，因为它们是神经标记物。

变异程度最高的标志物包括 B7-H3、Ki-67、CD44 和纤连蛋白。这些标志物分别与肿瘤增殖、迁移和转移具有重要关联。因此，在恶性肿瘤核心、恶性浸润区域以及非恶性组织样本之间，这些标志物表现出区域性的差异是合理的。此外，也可进行数值化数据表示；可导出包含各 ROI 内每种蛋白标志物表达值的表格文件，用于数学和统计分析。该表达值由 DSP 提供的数字计数功能生成，该功能可定量每个 ROI 内微吸取的 PC-寡核苷酸（图 1 和

讨论

鉴于可能影响胶质瘤侵袭性的蛋白质具有多样性，且其中一些蛋白质尚未被发现，高通量蛋白质定量方法是一种理想的技术手段。此外，由于肿瘤样本中的空间数据通常与差异表达相关¹⁸，将空间分析整合到蛋白质定量方法中可实现更有效的分析。

DSP 的高通量方法还可用于类似鸟枪法的策略，这非常适用于发现潜在的新型疾病生物标志物以及治疗反应的标志物。在两项关于黑色素瘤的研究中，DSP 被用于评估伊匹单抗联合纳武单抗治疗与纳武单抗单药治疗的反应¹⁹，以及伊匹单抗联合纳武单抗新辅助治疗与标准辅助治疗的对比²⁰。在这两项研究中，治疗后对多种蛋白质靶标的 DSP 分析显示关键免疫标志物的相对表达存在差异，提示这些标志物可能作为治疗反应的潜在生物标志物发挥作用。

DSP 还有助于确定复杂分子水平过程的最终病理学意义。例如，侵袭性胶质瘤的一个显著特征是其直接穿过细胞外基质（ECM）迁移的倾向，且其迁移路径通常受到血管和...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BOND 研究检测系统	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	DS9455	含有试剂托盘中开放式容器的开放式检测系统
BOND 洗涤液	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	AR950	用于洗涤固定组织的 10 倍浓缩缓冲液
缓冲液 W	NanoString, Seattle, WA	contact company	封闭试剂
Cy3 偶联试剂盒	Abcam, Cambridge, UK	AB188287	Cy3 荧光抗体偶联试剂盒
GeoMx 数字空间分析仪（DSP）	NanoString, Seattle, WA	contact company	用于成像和表征蛋白质与 RNA 靶标的系统
GeoMx DSP 仪器缓冲液试剂盒	NanoString, Seattle, WA	100471	GeoMx DSP 缓冲液试剂盒（包含样本处理和制备所需缓冲液）
GeoMx 杂交编码包_蛋白质	NanoString, Seattle, WA	121300401	用于运行 GeoMx DSP 实验的对照
GeoMx 免疫细胞面板（Imm Cell Pro_Hs）	NanoString, Seattle, WA	121300101	针对人类免疫细胞及免疫肿瘤学靶点的蛋白质模块
GeoMx 泛肿瘤面板（Pan-Tumor_Hs）	NanoString, Seattle, WA	121300105	针对多种人类肿瘤类型及上皮-间质转化标志物的蛋白质模块
GeoMx 蛋白质切片制备 FFPE	NanoString, Seattle, WA	121300308	用于 GeoMx DSP 蛋白质分析的样本制备试剂
LEICA Bond RX	Leica Biosystems, Wetzlar, Germany	contact company	全自动免疫组化染色仪
主试剂盒——12 次反应	NanoString, Seattle, WA	100052	与 nCounter 分析系统配合使用的材料和试剂
nCounter 分析系统	NanoString, Seattle, WA	contact company	用于多重靶标表达定量的自动化系统（需与 GeoMx DSP 联用）
TMA Master II	3DHistech Ltd., Budapest, Hungary		用于构建组织微阵列块