用于表征成人型弥漫性浸润性胶质瘤微环境的数字空间剖析

摘要

蛋白质组学失调在弥漫性浸润性胶质瘤的扩散中起重要作用，但几种相关蛋白质仍未鉴定。数字空间处理（DSP）提供了一种高效、高通量的方法，用于表征可能导致浸润性胶质瘤侵袭和迁移的候选蛋白的差异表达。

摘要

弥漫性浸润性胶质瘤由于肿瘤扩散的浸润性而与高发病率和死亡率相关。它们是形态复杂的肿瘤，在肿瘤本身及其异质微环境中具有高度的蛋白质组学变异性。这些肿瘤的恶性潜力通过参与几个关键途径的蛋白质失调而增强，包括维持细胞稳定性和保持微环境结构完整性的过程。尽管已经进行了大量和单细胞胶质瘤分析，但这些蛋白质组学数据的空间分层相对缺乏。了解内在肿瘤、侵袭边缘和微环境之间致瘤因子和免疫细胞群的空间分布差异，为肿瘤增殖和增殖的机制提供了有价值的见解。数字空间剖析 （DSP） 代表了一种强大的技术，可以为这些重要的多层分析奠定基础。

DSP是一种有效定量组织标本中用户指定空间区域内蛋白质表达的方法。DSP是研究区分区域内和跨区分区域多种蛋白质差异表达的理想选择，可实现多层次的定量和定性分析。DSP协议是系统且用户友好的，允许对蛋白质组学数据进行定制的空间分析。在该实验中，组织微阵列由存档的胶质母细胞瘤核心活检构建。接下来，选择一组抗体，靶向样品中感兴趣的蛋白质。然后将预偶联到紫外光切割DNA寡核苷酸的抗体与组织样品一起孵育过夜。在抗体的荧光显微镜可视化下，用样品定义用于定量蛋白质表达的感兴趣区域（ROI）。然后将紫外线照射到每个ROI，切割DNA寡核苷酸。微吸寡核苷酸在每个ROI内计数，在空间基础上量化相应的蛋白质。

引言

弥漫性浸润性胶质瘤是成人中最常见的恶性脑肿瘤类型，并且总是致命的。神经胶质瘤细胞在大脑中广泛迁移的倾向是一个主要的治疗挑战。它们的传播机制包括定向迁移和不受控制的入侵。浸润性胶质瘤细胞已被证明沿白质束¹ 表现出嗜性和迁移性，最近的研究表明这些束脱髓鞘是一种活跃的促肿瘤特征²。侵袭由上皮到间充质转化介导，其中胶质瘤细胞通过减少编码细胞外基质蛋白和细胞粘附分子的基因的表达来获得间充质特性，放大迁移并促进通过肿瘤微环境的繁殖³，^4，5。

在分子水平上，已经证明了几种赋予细胞稳定性并与免疫原性成分界面的蛋白质的破坏⁶。已知浸润性胶质瘤会抑制具有抗凋亡（例如PTEN^）特性的蛋白质7。它们还过表达促进逃避宿主免疫反应的蛋白质（例如，PD1/PDL1）⁸。这些复杂途径的失调增强了致瘤性并增加了恶性潜力。

在侵袭性胶质瘤样本中，目的是评估对细胞生长、存活和增殖以及侵袭性和非侵入性成分之间的微环境结构完整性至关重要的蛋白质的差异表达。此外，我们试图研究具有活性免疫原性作用的蛋白质的差异调节，从而深入了解受损的宿主免疫防御可能增强胶质瘤的增殖和侵袭潜力的机制。鉴于最近广泛的研究表明，恶性肿瘤中的免疫标志物和失调的驱动因素如何成为免疫治疗的靶标，这一点尤其重要。在参与免疫监视和反应性的众多蛋白质中确定可行的治疗靶点需要一种高度灵敏和全面的方法。

鉴于可以研究的候选蛋白质种类繁多，我们寻求一种类似于免疫组织化学但具有增强数据处理效率的方法。在癌症生物学领域，DSP已成为一项强大的技术，与蛋白质组学分析和定量的替代工具相比具有重要优势。DSP的特点是其高通量多重检测能力，允许同时研究样品中的几种不同蛋白质，这标志着与免疫组织化学（IHC^）等标准但低重技术的重要区别9^，10。DSP的多重功能不会影响其作为定量和分析工具的保真度，正如比较DSP与IHC的研究所证明的那样。例如，当用于非小细胞肺癌标本的蛋白质组学定量时，DSP已被证明具有与IHC¹¹相似的结果。此外，DSP还提供可定制的区域规范，用户可以在其中手动定义要执行蛋白质组学分析的区域。这比全断面多重方法^10，12具有优势。因此，在单轮处理中，DSP通过调查多个感兴趣区域的多个蛋白质靶标来提供多层分析。

DSP在几种不同的病理环境中都有应用。DSP在肿瘤学分析中特别有利，因为空间变化可以与细胞转化和差异蛋白表达相关。例如，DSP已被用于将乳腺癌的蛋白质组学特征与邻近的肿瘤微环境进行比较。这对于了解该肿瘤的自然史及其进展以及对治疗的潜在反应具有重要意义¹³。说明DSP多功能性的其他背景包括前列腺癌中蛋白质多样性的空间定量¹⁴，免疫细胞标志物表达与头颈部鳞状细胞癌疾病进展的关联¹⁵，以及蛋白质表达的上皮 - 间充质梯度的证明，以区分转移性和原发性透明细胞卵巢癌¹⁶.通过实施DSP，我们表征了可能影响胶质瘤肿瘤发生和侵袭的蛋白质的空间地形。

方案

下面概述的协议遵循达特茅斯 - 希区柯克人类研究伦理委员会的指导方针。从本研究中包括组织样本的患者获得知情同意。有关此协议中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 部分。

1. 载玻片准备¹⁷

1. 从人成人型弥漫性浸润性胶质瘤中检索或制备福尔马林固定的石蜡包埋组织。
   注意:在该实验中，使用了来自三名胶质母细胞瘤患者的石蜡包埋活检块。
2. 创建组织微阵列 （TMA） 模块。从每个活检中取出几个2毫米的核心，并将它们放在一个TMA块中（图1，顶部）。从 TMA 块上切割 4 μm 的部分并安装到载玻片上。将每张载玻片放在载玻片支架垫圈内。将载玻片在60°C孵育30分钟。

2. 半自动IHC系统准备和软件配置（用于载玻片的加载和运行）¹⁷

1. 设置试剂。单击试剂设置按钮。单击"设置"选项卡中的"添加"。
   1. 通过在"名称"字段中键入洗涤缓冲区的名称来注册洗涤缓冲区。在"类型"字段中选择"辅助"。点击保存。
   2. 通过重复与上述相同的步骤（根据适用情况进行修改，例如，在"名称"字段中）但在"类型"字段中选择一抗来注册封闭溶液。在默认染色方案和默认HIER方案的下拉框中选择所需的方案。如果需要，请选择默认酶方案选项（此框在当前方案中留空）。点击保存。
2. 注册检测系统，由条形码试剂容器托盘组成。扫描条形码。
   1. 开始在 "添加研究 试剂系统"窗口中输入试剂系统详细信息。键入检测系统 的名称 。
   2. 键入到期日期。突出显示试剂图表的第一行并扫描新的 30 mL 试剂容器的条形码，此时条形码将填充第 1 行。
   3. 将容器放在 检测系统的位置 1。在 试剂 列的下拉框中选择洗涤缓冲液的名称，然后单击 添加。重复这些步骤以在后续行中添加任何其他试剂，包括封闭溶液。
3. 设置 IHC 的蛋白质方案。 单击 协议设置。突出显示与所需协议对应的行，然后单击 复制。输入 名称 并在 编辑协议属性 窗口中填写任何其他相关字段。
   1. 选中"显示洗涤步骤"框。确认每种试剂的Inc（分钟）和DispenseType字段正确（封闭溶液为10分钟，洗涤缓冲液为0分钟，每种分配类型为150 μL）。 点击保存。
4. 准备研究。用 洗涤缓冲液填充位置 1 的容器。每张载玻片填充 150 μL 和 5 mL 死体积;打开盖子。对位置 2 中的容器重复这些步骤，该容器应填充封闭 溶液。该容器每张载玻片应有 150 μL 和 350 μL 死体积。
   1. 将试剂容器托盘装载到机器上。允许系统执行容器识别和体积确认措施。单击幻灯片设置|添加研究。输入研究 ID 和研究名称，然后在分液体积 | 下选择 150 μL"制备方案"下拉列表中所需的方案（建议烘烤和脱蜡）。突出显示研究并单击添加幻灯片。
   2. 在组织类型下选择测试组织|在分配体积|下选择 150 μL 染色模式下拉框中的单个和常规。选择一个过程（当前研究的IHC）|标记字段下拉框中的阻止解决方案名称|"实验方案"选项卡的染色字段中的IHC DSP方案|*烘烤和脱蜡制备|*HIER 20分钟，ER1用于HIER。将"酶"字段留空。
   3. 对每张幻灯片重复此过程。完成后单击" 关闭 "，然后单击 "打印标签"。检查 当前研究尚未打印的所有载玻片标签 ，然后单击 打印。将标签粘贴到幻灯片的顶部。
5. 加载并运行幻灯片。将载玻片装载到载玻片托盘上，确保样品和标签朝上。将 封面磁贴 放在幻灯片上，确保幻灯片底部有选项卡。将载玻片托盘装载到仪器上。
   1. 按下 LED 按钮降低托盘，让仪器开始扫描和识别载玻片。单击"开始 "按钮开始 实验。
6. 完成实验。当 LED 按钮呈绿色闪烁时，按下 它 ，表示运行完成。从仪器上取下托盘，然后小心地从每张幻灯片上提起盖板。将载玻片放入1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，去除多余的缓冲液，并用疏水笔勾勒出每个组织切片的轮廓以形成疏水屏障。

3. 抗体孵育和细胞核染色¹⁷

1. 选择一组抗体来定位感兴趣的抗原（本实验中使用的抗体参见 表1 ）。
   注意:每种抗体已经与具有唯一标识它的UV光裂解片段（PC-寡核苷酸）的DNA寡核苷酸偶联（索引寡核苷酸， 图2）。
2. 通过在每张载玻片中加入 8 μL 每种抗体（按 1:40 稀释）制备有效的抗体-PC-寡核苷酸溶液。使用封闭试剂作为稀释剂，使每张载玻片的最终体积达到200 μL。在4°C孵育过夜（图3，步骤1）。
   注意:在此步骤中，形态标记物，生物染料或荧光标记的抗体也可以添加到溶液中。
3. 第二天，将载玻片放入Coplin罐中，在1x TBS-T中洗涤3 x 10分钟。在室温下在4%多聚甲醛中后固定30分钟，然后在1x TBS-T中后固定2 x 5分钟。
4. 加入SYTO13核染色剂（在1x TBS中以1:10稀释）在室温下15分钟。用 1x TBS-T 清洗 2 次，然后将载玻片存放在 1x TBS-T 中。

4. DSP 仪器上的荧光可视化、ROI 识别和紫外光切割¹⁷

1. 将鼠标悬停在控制中心的 数据收集 上后，选择 新建/继续运行。
2. 将载玻片放入载玻片支架中，标签朝向用户。降低滑动托盘夹，确保组织在细长的窗口中可见。 加入 6 mL 缓冲液 S。
3. 按照 控制中心中的提示操作。使用 X 和 Y 滑块 在不同轴之间缩放，以描绘要扫描的区域。选择 扫描。允许扫描继续进行，直到整个定义的目标区域成像完毕。
4. 生成 20 倍图像。自动或手动定义ROI（图3，步骤2）。要遵循此协议，请为每个组织核心选择三个相同大小的圆形ROI（直径为250μm）（图4，底部）。
   注意:ROI 的大小和形状是可定制的。可以在每个部分中选择多个ROI。在此实验中，循环 ROI 是手动定义的。
5. 通过单击退出 扫描工作区 按钮批准投资回报率。等待紫外线将寡核苷酸从抗体中切割出来。
6. 清洁仪器过程完成后，选择"新建数据收集"以继续处理当前载玻片或孔板。否则，请选择移除载玻片和微孔板。
7. 双击控制中心右下角的铭牌图标区域打开"定版板"窗口。如果混合 （Hyb） 代码包批号 （#） 已知，请输入编号并单击更新（在此步骤中可选）。点击完成。
8. 按照提示拆下载玻片支架和收集板。将载玻片存储在 TBS-T 中。如果载玻片长时间不使用，请用水性介质和盖玻片覆盖它们。

5. 蛋白质读数¹⁷

1. 使用渗透密封，在顶部打开的热循环仪中以65°C干燥吸液。加入 7 μL 焦碳酸二乙酯处理的水并混合。在室温下孵育10分钟，然后快速旋转。
2. 从 表2 中选择适当的探针R和探针U方程，以指导探针/缓冲液混合物的创建。基于本实验中杂交所需的Hyb代码的数量，应用公式（1）如下。快速混合并旋转。
   # 海布代码 探针 R 工作池探针 U 工作池杂交缓冲液 n = _______ （n × 8 μL） = _____ μL + （n × 8 μL） = ______ μL + （n × 80 μL） = _____ μL （1）
3. 将 84 μL 探针/缓冲液混合物添加到要使用的每个 Hyb 代码包中。轻拂以混合并向下旋转。在新鲜的 96 孔杂交板中，将 8 μL 每种 Hyb 代码预混液添加到指定行的所有 12 孔中。
4. 将 7 μL 从 DSP 收集板转移到杂交板中的相应孔中。轻轻混合。热封并进行快速旋转。然后，在67°C孵育过夜。 在冰上冷却盘子并进行快速旋转。
5. 将每个孔中的hyb产品汇集到条带管中，轻轻地将每个孔输送5次以混合。盖上带管并向下旋转。将任何剩余的未掺水的hyb产品冷冻在-80°C。 将试管装入分析系统。
6. 将 CDF 文件保存到 USB 驱动器上，然后将数据从 DSP 仪器传输到数字分析仪。通过执行以下步骤完成设置。
   1. 将耗材和混合样品装载到制备站上。在屏幕上，按 开始处理。选择 "高灵敏度"，然后选择" 下一步"。按 全选键 查看含样品|孔数 完成|接下来是 电子邮件通知 |开始。
   2. 制备站完成后，密封小柱并转移到数字分析仪。按 开始计数，选择 载物台位置，按 加载现有 CDF 文件并选择先前上传的文件。按完成 ，再次选择舞台位置，按 完成|开始 运行程序。
7. 将报告器计数转换文件的压缩文件从分析系统保存到 USB 驱动器，然后将驱动器插入 DSP 计算机。在 DSP 控制中心中，将鼠标悬停在 数据收集上，然后单击 上传计数。选择相关的压缩文件。

6. 数据分析¹⁷

1. 单击DSP控制中心中的记录。要查看队列中的扫描，请选择将所选扫描添加到队列|我的分析队列。将鼠标悬停在控制中心的数据分析选项上后，选择从队列中新建算例。
2. 从任务栏选项中选择 QC。继续使用默认值或根据需要进行调整。选择"运行 QC"并查看"结果网格"。单击"运行QC"以继续并创建一个新数据集，将值标准化为阳性杂交对照。
3. 将新标记导入到 XLSX 文件中。在"扫描"窗格中选择"管理批注"，然后下载模板、插入标记并导入文件。
4. 可选:运行 QC 后，使用其他工具栏选项进一步调整数据。使用 可视化效果 窗格中的工具绘制转换后的数据。
5. 导航参数的灰色下拉框以组成 可视化效果 窗格中的每个图。在绘图中选择一个特定区域以在 "扫描 "窗格中可视化相应的高亮显示段，然后单击鼠标右键以生成标记或组。在 "数据集摘要"中，查看归 一化、 缩放和其他选项中的绘图，以便进行分析和显示。
6. 通过选择要保存的图标来 保存可视化效果;查看已保存在 "摘要"下的可视化效果。选择" 导出 （.svg） "按钮以.svg格式导出可视化效果。通过单击 导出 （.xlsx） 按钮导出可视化所基于的数据。通过将光标悬停在第二个窗格中的数据集名称上并单击导出图标， 导出 特定数据集中包含的所有数据。

结果

图4 显示了对胶质母细胞瘤样本进行的DSP实验的代表性结果。展示了一个热图，说明了使用DSP软件直观地捕获数据的方法之一。行代表蛋白质靶标，每列对应于一个感兴趣区域。蓝色到红色的颜色范围分别表示低到高表达。行内颜色的变异性反映了区域蛋白质的异质性，并表明可能与差异蛋白质表达的空间关联。例如，在本实验中，S100和CD56普遍较高，因为它们是神经标记。

变异性最大的标志物包括B7-H3、Ki-67、CD44和纤连蛋白。这些标志物分别与肿瘤增殖、迁移和转移有重要关联。因此，在恶性核心、恶性侵袭和非恶性组织样本之间表现出区域差异是合理的。数值数据表示也是可能的;可以以表格形式导出包含ROI中每个蛋白质标记物的表达值的文件，以进行数学和统计分析。该表达值由DSP提供的数字计数功能产生，该功能可量化每个ROI内的微量吸出PC寡核苷酸（图1 和 图2）。

讨论

鉴于可能影响胶质瘤侵袭性的蛋白质的多样性，以及其中一些蛋白质仍未被发现的概念，高通量蛋白质定量方法是一种理想的技术方法。此外，鉴于肿瘤样品中的空间数据通常与差异表达相关¹⁸，将空间分析纳入蛋白质定量方法可以实现更有效的分析。

DSP的高通量方法还使其能够用于类似霰弹枪的方法，这是发现疾病和治疗反应的潜在新型生物标志物的理想选择。在两项黑色素瘤研究中，DSP用于评估伊匹木单抗和纳武利尤单抗联合治疗与纳武利尤单抗单药治疗¹⁹ 的反应，以及伊匹木单抗和纳武利尤单抗的新辅助联合治疗与标准辅助治疗²⁰的反应。在这两项研究中，治疗后各种蛋白质靶标的DSP分析显示出关键免疫标志物的差异相对表达，表明治疗反应的潜在生物标志物的作用。

DSP还有助于确定复杂的分子水平过程的最终病理意义。例如，侵袭性胶质瘤的一个显着特征是它们倾向于直接通过细胞外基质（ECM）迁移，并且它们的迁移路径通常由血管和白质束引导...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BOND Research 检测系统	Leica Biosystems，Wetzlar，德国	DS9455	开放式检测系统，在试剂盘中装有开放容器
BOND Wash	Leica Biosystems，Wetzlar，德国	AR950 用于	洗涤固定组织的 10X 浓缩缓冲溶液
缓冲液 W	NanoString，华盛顿州西雅图	联系公司	封闭试剂
Cy3 偶联试剂盒	英国剑桥 Abcam	AB188287	Cy3 荧光抗体偶联试剂盒
GeoMx 数字空间分析器 （DSP）	NanoString，华盛顿州西雅图	联系公司	和 RNA 靶标成像和表征系统
GeoMx DSP 仪器 BufferKit	NanoString，华盛顿州西雅图	100471	GeoMX DSP 缓冲液试剂盒（包括用于样品处理和制备的缓冲液）
GeoMx Hyb 代码 Pack_Protein	NanoString，华盛顿州西雅图	121300401	运行 GeoMX DSP 实验的对照
GeoMx 免疫细胞检测组合 （Imm Cell Pro_Hs）	NanoString，华盛顿州西雅图	121300101	人类免疫细胞和免疫肿瘤靶标靶标的蛋白质模块
GeoMx 泛肿瘤检测组合 （Pan-Tumor_Hs）	NanoString，华盛顿州西雅图	121300105	蛋白质模块，具有多种人类肿瘤类型和上皮-间质转化标志物的靶标
GeoMx 蛋白质载玻片制备 FFPE	NanoString，华盛顿州西雅图	121300308	用于 GeoMX DSP 蛋白质分析的样品制备试剂
LEICA Bond RX	Leica Biosystems，Wetzlar，德国	联系公司	全自动 IHC 染色机
主试剂盒--12 次反应	NanoString，华盛顿州西雅图	100052	用于 nCounter 分析系统的材料和试剂
nCounter 分析系统 NanoString	，西雅图，华盛顿	州 联系公司	用于多重靶标表达定量的自动化系统（与 GeoMx DSP 一起使用）
TMA Master II	3DHistech Ltd.，匈牙利		组织微阵列块