我们构建了一个整合了XY-Meta和metaX的非靶向代谢组学工作流程。在本方案中，我们展示了如何使用XY-Meta从开放获取的谱图参考数据库中生成诱饵谱图库，随后进行错误发现率（FDR）控制，并在完成代谢组学谱图鉴定后，利用metaX对代谢物进行定量分析。
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方法文章
基于FDR控制的非靶向代谢组学鉴定与定量一体化工作流程
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
近年来，非靶向代谢组学技术被广泛应用。然而，日益提高的通量和不断增加的样本数量产生了海量的谱图数据，给质谱数据的质量控制带来了巨大挑战。为了减少假阳性结果，必须进行错误发现率（FDR）质量控制。最近，我们开发了一款基于“目标-诱饵”（Target-Decoy）策略、名为 XY-Meta 的软件，用于非靶向代谢组鉴定中的 FDR 控制。在此，我们展示了一个完整的分析流程，将 XY-Meta 与 metaX 集成使用。本实验方案详细说明了如何利用 XY-Meta 从现有参考数据库生成诱饵数据库，并在开放获取数据集上应用目标-诱饵策略对大规模代谢组鉴定结果进行 FDR 控制。在使用 metaX 完成代谢物峰的检测与定量后，进一步开展了差异分析和代谢物注释。为了帮助更多研究人员，我们还开发了一个用户友好的基于云端的分析平台，无需具备生物信息学技能或任何编程语言基础即可完成上述分析。
引言
代谢物在生物过程中发挥着重要作用。代谢物通常是多种过程的调控因子，如能量转移、激素调节、神经递质调控、细胞间通讯以及蛋白质翻译后修饰等1,2,3,4。非靶向代谢组学可对大量代谢物提供全局性的视图5,6。随着质谱和色谱技术的进步，近年来代谢组MS/MS谱图的通量迅速增加7,8,9,10,11。为了从这些海量数据集中鉴定代谢物，已开发出多种注释软件11，例如MZmine12、MS-FINDER13、CFM-ID14、MetFrag
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方案
1. 准备代谢组学数据集以进行分析
注意：本演示中使用的代谢组学数据集不含质控样本，需要提供病例组和对照组的数据。为便于演示，我们使用了 GNPS 数据库中的一个公开数据集27。
- 访问网页 https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp，点击 浏览数据集。
- 在标题列中搜索关键词"msv000084112"。点击数据集编号以查看详细信息，并通过FTP下载该数据集。
- 将原始数据放入文件夹 /msv000084112。
注：该数据集使用C18反相超高效液相色谱（RP-UHPLC）在Q Exactive平台上以正离子模式采集，代表一组尚未明确诊断的代谢性疾病的尿液样本数据，包括33个健康人样本、12个空白样本、2个混合样本和82个患者样本28（补充材料8）。为演示本工作流程，我们随机选取6个健康人样本（NH）作为对照组，以及6个患病样本（NT）作为病例组进行流程操作。
2. 数据格式转换....
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结果
msv000084112 的原始数据通过 msconvert.exe 转换并生成了 mgf 文件（补充材料 S6）。
XY-Meta 在 /database 文件夹下生成了 GNPS-NIST14-MATCHES_Decoy.mgf 文件。该文件是由原始参考谱图库 GNPS-NIST14-MATCHES.mgf 生成的诱饵谱图库。此诱饵谱图库可重复使用。当重复使用该诱饵谱图库时，用户应在 parameter.default 文件中将 decoy_pattern 参数设置为 1，并将 decoyinput 设置为该诱饵谱图库的绝对路径。鉴定结果生成于 /mgf 文件夹下（文件后缀为 .meta），其中包含谱图匹配得分、错误发现率（FDR）、代谢物的 m/z 值、保留时间以及代谢物名称（补充材料 7）。
通过metaX进行的定量分析结果位于/output文件夹中。NH和NT的总体定量分布相似，均值波动较小（图1A
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讨论
对非靶向代谢物的错误发现率（FDR）控制一直是一个重大挑战。本文展示了一套完整的、可实现FDR控制的大规模非靶向代谢组学分析流程（包括定性和定量分析），可有效减少质谱分析中常见的假阳性结果。
为您的研究准备合适的参考谱图库至关重要。成功的、高灵敏度的串联质谱（MS/MS）鉴定不仅依赖于恰当的匹配算法，还需要高质量的参考谱图库。公共谱图库的应用受到以下因素的限制：（1）许多公共谱图库未包含完整的代谢物列表；（2）公共谱图库中的谱图来源于不同的质谱仪器和/或不同的碎裂条件30,31。因此，我们建议您使用标准代谢物，在相同的仪器和相同的碎裂条件下采集谱图，以构建一个"专属"谱图库，并在实际检测过程中保持这些条件一致。此外，在修改参数文件时，前体离子和碎片离子的容差应与仪器参数相匹配。通常情况下，前体离子容差范围应设置在10 ppm至20 ppm之间，碎片离子容差应设置在0.01 Da至0.5 Da之间。对于本数据集，仪器参数未知，但将碎片离子容差设为0.0.......
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致谢
本工作由国家重点研发计划（2018YFC0910200/2017YFA0505001）和广东省重点研发计划资助&D 计划 (2019B020226001)
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GNPS | 开源 | 无 | https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/static/gnps-splash.jsp |
| XY-Meta | 开源 | 无 | https://github.com/DLI-ShenZhen/XY-Meta |
| metaX | 开源 | 无 | https://github.com/wenbostar/metaX |
| ProteoWizard | 免费下载 | 3.0.22116.18c918b-x86_64 | https://proteowizard.sourceforge.io/download.html |
| CHI.Client | 免费下载 | ndp48-x86-x64-allos-enu | http://www.chi-biotech.com/technology.html?ty=ypt |
参考文献
- Misra, B. B., Fahrmann, J. F., Grapov, D. Review of emerging metabolomic tools and resources: 2015-2016. Electrophoresis. 38 (18), 2257-2274 (2017).
- Idle, J. R., Gonzalez, F. J. Metabolomics. Cell Metabolism. 6 (5), 348-351 (2007).
- Fiehn, O. Metabolomics — the link between genotypes and phenotype....
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重印与许可
