本方案描述了一种在人类真菌病原体Candida albicans中应用靶点切割释放核酸酶技术（CUT&RUN）的实验方法及数据分析流程。
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方法文章
全基因组范围转录因子-DNA 结合相互作用分析：一种针对Candida albicans的全面CUT&RUN方法与数据分析流程
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
调控性转录因子控制着许多重要的生物学过程，包括细胞分化、对环境扰动和应激的响应以及宿主-病原体相互作用。确定调控性转录因子在全基因组范围内与DNA的结合情况，对于理解转录因子在这些复杂生物学过程中的功能至关重要。靶位点切割与核酸酶释放技术（Cleavage under targets and release using nuclease, CUT&RUN）是一种用于全基因组定位的现代方法 体内 一种有吸引力的蛋白质-DNA 结合相互作用研究方法，可作为传统且广泛应用的染色质免疫沉淀联合测序（ChIP-seq）方法的替代方案。CUT&RUN 具有适用于高通量实验设计的优势，相较于 ChIP-seq，其动态范围显著更宽，且每个样本的测序成本更低。此处，一项全面的 CUT&适用于人类真菌病原体中转录因子-DNA结合相互作用的全基因组分析的RUN实验方案及配套数据分析流程 白色念珠菌 描述了该详细方案，包括从转录因子编码基因的表位标签标记到测序文库制备所需的全部实验步骤；此外，还包括用于CUT的定制化计算分析流程&RUN 数据分析
引言
Candida albicans 是一种具有重要临床意义的多形性人类真菌病原体，可表现为多种不同的生长模式，例如浮游（自由漂浮）生长模式，以及由胞外基质保护、细胞紧密黏附形成的群落结构，即生物膜生长模式1,2,3。与其它发育和细胞过程类似，生物膜的形成是 C. albicans 的一项重要毒力特征，已知该过程在转录水平上受到调控性转录因子（TFs）的控制，这些转录因子以序列特异性方式与DNA结合4。近年来，染色质调控因子和组蛋白修饰酶也被发现通过调控DNA的可及性，在 C. albicans 的生物膜形成5 和形态发生6 过程中发挥重要作用。为了深入理解这一重要真菌病原体复杂的生物学特性，建立有效的方法以确定特定转录因子在不同发育和细胞过程中全基因组范围内的定位具有重要意义。
染色质免疫沉淀结合测序（ChIP-seq）是一种广泛用于研究白色念珠菌（C. albicans）中蛋白质-DNA 相互作用的方法5,
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方案
1. 白色念珠菌（C. albicans）菌株的表位标签标记
- 上传目标基因及其上下游各 1 kb 的侧翼序列，从 白色念珠菌 基因组数据库到引物设计工具（参见 材料表）。通过突出显示终止密码子上游和下游各50 bp的区域来设计向导RNA（gRNA），然后点击 gRNA 选择 右侧的工具。选择 设计与分析指南. 使用 Ca22（白色念珠菌 SC5314 二倍体基因组 Assembly 22 和 NGG（SpCas9，3'端）原间隔序列邻近基序（PAM）作为向导参数，然后点击 完成. 图1 描述了对表位进行标记的工作流程 C. albicans 目的基因与增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的融合
- 在下一页确认 gRNA 设计的靶向区域，然后点击绿色按钮。按 gRNA 排序 靶向评分.
注意：引物设计工具会计算靶上和脱靶评分，以量化gRNA的特异性。理想的向导RNA应具有较高的靶上评分 >60，脱靶评分为约33，并覆盖终止密码子。这可在实现高gRNA特异性的同时，在GFP整合后消除gRNA的靶向作用。脱靶评分为约50的gRNA提示....
- 在下一页确认 gRNA 设计的靶向区域，然后点击绿色按钮。按 gRNA 排序 靶向评分.
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结果
本研究对 CUT&RUN 实验方案进行了改进和优化，以用于分析 C. albicans 生物膜及浮游培养物中特定转录因子（TF）的全基因组定位（实验流程概览见图2）。同时提供了一套完整的数据分析流程，便于用户对 CUT&RUN 测序数据进行分析，且无需具备深厚的编程或生物信息学背景（数据分析流程概览见图3）。与 ChIP-chip 和 ChIP-seq 方法不同，CUT&RUN 实验使用完整且已通透化的细胞核进行，所需起始细胞数量显著减少，且无需甲醛交联。从 C. albicans 原生质体中分离完整细胞核是本方案中的关键步骤。由于需使用溶菌酶消化 C. albicans 细胞壁以实现高效的原生质体制备，而酶解反应条件需根据不同细胞类型进行优化，因此该步骤具有挑战性。为确保 CUT&RUN 实验成功并获得高质量的测序结果，本方案包含早期质量控制环节，并通过标准荧光显微镜观察验证完整细胞核的存在。
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讨论
本方案提供了一套全面的实验与计算流程，用于在C. albicans中进行全基因组范围的调控性转录因子（TF）定位。该方案设计为任何具备标准微生物学和分子生物学训练背景的研究人员均可轻松上手。通过利用CUT&RUN检测技术的高动态范围和低样本输入需求，并针对C. albicans生物膜和浮游培养中转录因子- DNA 结合相互作用的定位进行了优化，本方案为传统的ChIP-seq方法提供了一种强大且低成本的替代方案。与ChIP-seq相比，CUT&RUN具有显著更高的灵敏度，测序读段中映射到结合峰的比例更高，更适用于高通量分析，所需起始细胞数量大幅减少，无需使用有毒的交联试剂，且每样本仅需十分之一的测序读段即可获得高质量结果13,14,17,23,24。为进一步降低本方.......
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披露
Clarissa J. Nobile 是 BioSynesis, Inc. 的联合创始人，这是一家致力于开发生物膜感染诊断方法和治疗手段的公司。
致谢
感谢Nobile实验室和Hernday实验室所有过去和现任成员对本文稿提供的反馈意见。 本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助，项目编号为R35GM124594，并由Kamangar家族为C.J.N.设立的捐赠讲席提供支持。此外，本研究还获得NIH下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，项目编号为R15AI137975（授予A.D.H.）。C.L.E. 受到NIH下属的国家牙科与颅面研究所（NIDCR）博士后奖学金F31DE028488的支持。本文内容由作者全权负责，不代表资助方的观点。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、文稿撰写，以及决定发表研究成果等方面均未参与。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.22 μm 滤膜 | Millipore Sigma | SLGPM33RS | |
| 0.65 mL 低吸附管 | VWR | 490003-190 | |
| 1 M CaCl2 | Fisher Scientific | 50-152-341 | |
| 1 M PIPES | Fisher Scientific | AAJ61224AK | |
| 12 孔未处理细胞培养板 | Corning | 351143 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | 60-24-2 | |
| 2% 皂苷（Digitonin） | Fisher Scientific | CHR103MI | |
| 50 mL 圆锥形离心管 | VWR | 89039-658 | |
| 5x Phusion HF 缓冲液 | Fisher Scientific | F530S | 为 Phusion 高保真 DNA 聚合酶产品组分；文中称为 "DNA 聚合酶缓冲液" |
| 琼脂 | Criterion | C5001 | |
| Agencourt AMPure XP 磁珠 | Beckman Coulter | A63880 | |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | 文中称为 "毛细管电泳仪"；依用户而定 |
| 带盖 PCR 反应条排，Simport Scientific | VWR | 89133-910 | |
| 蛋白胨（Bacto peptone） | BD Biosciences | 211677 | |
| Benchling 引物设计工具 | Benchling | https://www.benchling.com/molecular-biology/；文中称为 "引物设计工具" | |
| 甜菜碱（Betaine） | Fisher Scientific | AAJ77507AB | |
| Calcofluor White 染色剂 | Sigma-Aldrich | 18909-100ML-F | |
| Candida 基因组数据库 | http://www.candidagenome.org/ | ||
| 刀豆蛋白 A（ConA）偶联的顺磁性微珠 | Polysciences | 86057-3 | |
| Conda 软件 | https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html | ||
| curl 工具 | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz | ||
| CUTANA ChIC/CUT&RUN 试剂盒 | Epicypher | 14-1048 | 文中称为 "CUT&RUN 试剂盒" |
| 脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物（10 mM） | New England Biolabs | N0447S | |
| 右旋葡萄糖（D-葡萄糖） | Fisher Scientific | D163 | |
| Difco D-甘露醇 | BD Biosciences | 217020 | |
| 一次性比色皿 | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| 一次性移液管 | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| DNA 凝胶上样染料（6x） | Fisher Scientific | R0611 | |
| DreamTaq Green DNA 聚合酶 | Fisher Scientific | EP0713 | 文中称为 "cPCR DNA 聚合酶" |
| DreamTaq Green DNA 聚合酶缓冲液 | Fisher Scientific | EP0713 | 为 DreamTaq Green DNA 聚合酶组分；文中称为 "cPCR DNA 聚合酶缓冲液" |
| E. coli 内参 DNA | Epicypher | 18-1401 | |
| ELMI 微孔板孵育器 | ELMI | TRMS-04 | 文中称为 "微孔板孵育器" |
| 末端修复酶混合物 | 为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分 | ||
| 末端修复反应缓冲液 | 为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分 | ||
| 200 证明乙醇 | VWR | 89125-170 | |
| FastDigest MssI | Fisher Scientific | FD1344 | 文中称为 "限制性内切酶" |
| FastDigest MssI 缓冲液 | Fisher Scientific | FD1344 | 为 FastDigest MssI 试剂盒组分；文中称为 "限制性内切酶缓冲液" |
| Ficoll 400 | Fisher BioReagents | BP525-25 | |
| 荧光显微镜 | 依用户而定 | ||
| 凝胶电泳装置 | 依用户而定 | ||
| GeneRuler 低分子量 DNA 标准物 | Fisher Scientific | FERSM1192 | |
| GitBash 工作流程 | https://gitforwindows.org/ | ||
| GitHub 源代码 | https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis | ||
| HEPES-KOH pH 7.5 | Boston BioProducts | BBH-75-K | |
| 高速离心机 | 依用户而定 | ||
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | PX1830-4 | |
| 镜头纸 | VWR | 52846-001 | |
| 连接增强剂 | 为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分 | ||
| 二水合乙酸锂 | MP Biomedicals | 215525683 | |
| Living Colors 全长 GFP 多克隆抗体 | Takara | 632592 | 依用户而定 |
| MACS2 | https://pypi.org/project/MACS2/ | ||
| 磁力分离架，适用于 0.2 mL 管 | Epicypher | 10-0008 | |
| 磁力分离架，适用于 1.5 mL 管 | Fisher Scientific | MR02 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 微孔板和比色皿分光光度计 | BioTek | EPOCH2TC | 文中称为 "分光光度计"；依用户而定 |
| MochiView | http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads | ||
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| NaCl | VWR | 470302-522 | |
| NaOH | Fisher Scientific | S318-500 | |
| NCBI GEO | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ | ||
| NEBNext Illumina 适配子 | 为 NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1）组分；文中称为 "适配子" | ||
| NEBNext Illumina Index X 引物 | 为 NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1）组分；文中称为 "反向唯一索引文库扩增引物" | ||
| NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1） | New England Biolabs | E7335S | |
| NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒 | New England Biolabs | E7645S | 文中称为 "文库制备试剂盒" |
| NEBNext Illumina 通用 PCR 引物 | 为 NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1）组分；文中称为 "通用正向文库扩增引物" | ||
| 诺尔斯霉素硫酸盐（NAT） | Goldbio | N-500-2 | |
| Novex TBE 凝胶，10%，15 孔 | Fisher Scientific | EC62755BOX | |
| 旋转混合器 | VWR | 82007-202 | |
| 营养肉汤 | Criterion | C6471 | |
| pADH110 | Addgene | 90982 | 文中称为 "质粒库 ID# 90982" |
| pADH119 | Addgene | 90985 | 文中称为 "质粒库 ID# 90985" |
| pADH137 | Addgene | 90986 | 文中称为 "质粒库 ID# 90986" |
| pADH139 | Addgene | 90987 | 文中称为 "质粒库 ID# 90987" |
| pADH140 | Addgene | 90988 | 文中称为 "质粒库 ID# 90988" |
| pAG-MNase | Epicypher | 15-1016 或 15-1116 | 50 次或 250 次反应 |
| pCE1 | Addgene | 174434 | 文中称为 "质粒库 ID# 174434" |
| 带透明盖的培养皿 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Phusion 高保真 DNA 聚合酶 | Fisher Scientific | F530S | 文中称为 "DNA 聚合酶" |
| 聚乙二醇（PEG）3350 | VWR | 10791-816 | |
| 磷酸二氢钾 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Qubit 1x dsDNA HS 检测试剂盒 | Invitrogen | Q33230 | |
| Qubit 荧光计 | Life Technologies | Q33216 | 文中称为 "荧光计"；依用户而定 |
| 兔 IgG 阴性对照抗体 | Epicypher | 13-0042 | |
| 核糖核酸酶 A（RNase A） | Sigma-Aldrich | 10109169001 | |
| Roche Complete 蛋白酶抑制剂（无 EDTA）片剂 | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| 摇床孵育器 | Eppendorf | M12820004 | 依用户而定 |
| 山梨醇 | Sigma-Aldrich | S1876-500G | |
| Spin-X 离心过滤管 | Fisher Scientific | 07-200-385 | |
| 无菌接种环 | VWR | 30002-094 | |
| SYBR Gold 核酸凝胶染色剂 | Fisher Scientific | S11494 | |
| SYTO 13 核酸染色剂 | Fisher Scientific | S7575 | 文中称为 "核酸凝胶染色剂" |
| PCR 仪 | 依用户而定 | ||
| ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| 三羟甲基氨基甲烷（Tris） | Sigma-Aldrich | 252859-100G | |
| Ultra II 连接预混液 | 为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分；文中称为 "连接预混液" | ||
| Ultra II Q5 预混液 | 为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分；文中称为 "高保真 DNA 聚合酶预混液" | ||
| UltraPure 鲑鱼精子 DNA 溶液 | Invitrogen | 15632011 | |
| USER 酶 | 为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分；文中称为 "尿嘧啶切除酶" | ||
| 涡旋混合器 | VWR | 10153-834 | |
| wget 工具 | http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ chromosomes.fasta.gz | ||
| 酵母提取物 | Criterion | C7341 | |
| Zymolyase 100T（溶壁酶，酵母裂解酶） | Fisher Scientific | NC0439194 |
参考文献
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
- Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. Development and regula....
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