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方法文章

全基因组范围转录因子-DNA 结合相互作用分析：一种针对Candida albicans的全面CUT&RUN方法与数据分析流程

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DOI：

10.3791/63655

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2022年4月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Merced, 2Quantitative and Systems Biology Graduate Program, University of California, Merced, 3Department of Applied Mathematics, University of California, Merced, 4Health Sciences Research Institute, University of California, Merced

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种在人类真菌病原体Candida albicans中应用靶点切割释放核酸酶技术（CUT&RUN）的实验方法及数据分析流程。

摘要

调控性转录因子控制着许多重要的生物学过程，包括细胞分化、对环境扰动和应激的响应以及宿主-病原体相互作用。确定调控性转录因子在全基因组范围内与DNA的结合情况，对于理解转录因子在这些复杂生物学过程中的功能至关重要。靶位点切割与核酸酶释放技术（Cleavage under targets and release using nuclease, CUT&RUN）是一种用于全基因组定位的现代方法 体内 一种有吸引力的蛋白质-DNA 结合相互作用研究方法，可作为传统且广泛应用的染色质免疫沉淀联合测序（ChIP-seq）方法的替代方案。CUT&RUN 具有适用于高通量实验设计的优势，相较于 ChIP-seq，其动态范围显著更宽，且每个样本的测序成本更低。此处，一项全面的 CUT&适用于人类真菌病原体中转录因子-DNA结合相互作用的全基因组分析的RUN实验方案及配套数据分析流程 白色念珠菌 描述了该详细方案，包括从转录因子编码基因的表位标签标记到测序文库制备所需的全部实验步骤；此外，还包括用于CUT的定制化计算分析流程&RUN 数据分析

引言

Candida albicans 是一种具有重要临床意义的多形性人类真菌病原体，可表现为多种不同的生长模式，例如浮游（自由漂浮）生长模式，以及由胞外基质保护、细胞紧密黏附形成的群落结构，即生物膜生长模式1,2,3。与其它发育和细胞过程类似，生物膜的形成是 C. albicans 的一项重要毒力特征，已知该过程在转录水平上受到调控性转录因子（TFs）的控制，这些转录因子以序列特异性方式与DNA结合4。近年来，染色质调控因子和组蛋白修饰酶也被发现通过调控DNA的可及性，在 C. albicans 的生物膜形成5 和形态发生6 过程中发挥重要作用。为了深入理解这一重要真菌病原体复杂的生物学特性，建立有效的方法以确定特定转录因子在不同发育和细胞过程中全基因组范围内的定位具有重要意义。

染色质免疫沉淀结合测序（ChIP-seq）是一种广泛用于研究白色念珠菌（C. albicans）中蛋白质-DNA 相互作用的方法5,6，已基本取代了更为传统的染色质免疫沉淀结合微阵列（ChIP-chip）9 方法。然而，ChIP-seq 和 ChIP-chip 方法均需要大量的起始细胞10，这在研究特定样本和生长模式（例如从患者或感染动物模型中收集的生物膜）中的转录因子时可能构成限制因素。此外，染色质免疫沉淀（ChIP）实验通常在整个基因组范围内产生显著的背景信号，因此需要目标物具有较高程度的富集，才能有效区分真实信号与背景噪音。尽管目前 ChIP-chip 方法已基本过时，但 ChIP-seq 所需的测序深度使得该实验对许多研究人员而言成本过高，特别是对于那些需要研究多个转录因子和/或染色质相关蛋白的研究者。

靶位点切割和核酸酶释放技术（CUT&RUN）是染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）的一种有吸引力的替代方法。该技术由Henikoff实验室于2017年开发，旨在克服ChIP-seq以及内源性染色质切割后测序（ChEC-seq11,12）的局限性，后者是另一种用于在全基因组水平上鉴定蛋白质-DNA相互作用的方法，同时实现高分辨率的转录因子（TFs）和染色质相关蛋白的全基因组定位13。CUT&RUN依赖于在透化的细胞核内利用锚定的微球菌核酸酶对染色质进行靶向消化，随后对消化产生的DNA片段进行测序9,10。由于DNA片段仅在目标蛋白结合的基因组位点特异性产生，而不是像ChIP实验中那样通过全基因组范围的随机片段化产生，因此CUT&RUN方法显著降低了背景信号，从而与ChIP-seq相比仅需1/10th 的测序深度即可达到同等分析效果11,13,14。这些改进最终显著降低了测序成本，并减少了每个样本所需起始材料的细胞总数。

本文介绍了一种稳健的CUT&RUN实验方案，已针对从白色念珠菌（C. albicans）生物膜和浮游培养物中分离的细胞进行全基因组转录因子（TF）定位分析进行了优化和调整。同时提供了一套完整的数据分析流程，可用于处理和分析测序所得数据，且对使用者的编程或生物信息学背景要求极低。简而言之，该方案包括转录因子编码基因的表位标签标记、生物膜及浮游细胞的收集、完整且可渗透化细胞核的分离、与针对目标蛋白或表位标签蛋白的特异性一抗孵育、将嵌合的A/G-微球菌核酸酶（pAG-MNase）融合蛋白锚定至一抗、染色质消化后基因组DNA的回收，以及用于测序的基因组DNA文库制备。

实验性的CUT&RUN方案之后，采用一个专门构建的数据分析流程，该流程接收FASTQ格式的原始DNA测序读段，并执行所有必要的处理步骤，以提供由目标转录因子（通过特异性一抗靶向）显著富集的结合位点的完整列表。需要注意的是，所述文库构建方案的多个步骤已针对转录因子（而非核小体）的CUT&RUN分析进行了专门调整和优化。尽管本文中展示的数据是使用商业CUT&RUN试剂盒的转录因子特异性改良版本生成的，但这些方案也已通过独立采购的组分（即pAG-MNase酶和磁性DNA纯化珠）以及实验室自制的缓冲液得到验证，后者可显著降低实验成本。完整的实验操作与数据分析方案将在下文以逐步说明的形式详细描述。所有试剂与关键设备，以及缓冲液和培养基配方，分别列于材料表和补充文件1中。

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方案

1. 白色念珠菌（C. albicans）菌株的表位标签标记

  1. 上传目标基因及其上下游各 1 kb 的侧翼序列，从 白色念珠菌 基因组数据库到引物设计工具（参见 材料表）。通过突出显示终止密码子上游和下游各50 bp的区域来设计向导RNA（gRNA），然后点击 gRNA 选择 右侧的工具。选择 设计与分析指南. 使用 Ca22（白色念珠菌 SC5314 二倍体基因组 Assembly 22 和 NGG（SpCas9，3'端）原间隔序列邻近基序（PAM）作为向导参数，然后点击 完成. 图1 描述了对表位进行标记的工作流程 C. albicans 目的基因与增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的融合
    1. 在下一页确认 gRNA 设计的靶向区域，然后点击绿色按钮。按 gRNA 排序 靶向评分.
      注意：引物设计工具会计算靶上和脱靶评分，以量化gRNA的特异性。理想的向导RNA应具有较高的靶上评分 >60，脱靶评分为约33，并覆盖终止密码子。这可在实现高gRNA特异性的同时，在GFP整合后消除gRNA的靶向作用。脱靶评分为约50的gRNA提示存在等位基因变异；因此，该gRNA仅能识别其中一个等位基因。
    2. 在20 bp的gRNA靶序列的5'端和3'端分别添加序列（5'-CGTAAACTATTTTTAATTTG-3'）和（5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'），生成一条60 bp的引物/寡核苷酸。或者，将20 bp序列复制到Nguyen等人提供的gRNA计算器中。15订购60 bp的定制gRNA寡核苷酸。
    3. 扩增 "通用A片段" 使用100 mM AHO1096（5'-GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC-3'）和100 mM AHO1098（5'-CAAATTAAAAATAGTTTACGCAAG-3'）以及 "独特B片段" 使用步骤1.1.2中的定制60 bp gRNA寡核苷酸（100 mM）以及100 mM AHO1097（5'-CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACCG-3'），分别以pADH110（质粒库编号# 90982）和pADH139（质粒库编号# 90987）作为模板DNA。采用以下提供的PCR反应体系和循环条件进行扩增。 表1.
      注意：pADH139 仅适用于携带异源的菌株 Candida maltosa LEU2 标记。如果使用含有单拷贝的菌株 C. albicans LEU2 基因，用 pADH119（质粒库编号# 90985）替换 pADH139。
    4. 通过检测确认扩增成功 5 µL 在1%琼脂糖凝胶上进行PCR产物检测，观察大小约为1 kb的A和B片段扩增产物。
    5. 混合 1 µL A片段和B片段分别进行PCR反应，并使用所提供的PCR反应和循环条件将它们连接起来 表2 以生成全长的C片段。
    6. 添加 0.5 µL 100 mM AHO1237（5'-AGGTGATGCTGAAGCTATTGAAG-3'）的 0.5 µL 100 mM AHO1453（5'-ATTTTAGTAACAGCTTCGACAATCG-3'）加入每份PCR反应体系中，用移液器充分混匀，并完成所列的循环条件 表3.
      注意：若使用 pADH119 替代 pADH139，需将 AHO1453 替换为 AHO1238（5'-TGTATTTTGTTTTAAAATTTTAGTGACTGTTTC-3'）。
    7. 通过检测确认C片段的正确拼接和扩增 5 µL 在1%琼脂糖凝胶上进行PCR产物检测，观察约2 kb的扩增片段。将C片段储存于-20 °C 直至准备使用为止。
      注意：如果拼接和扩增结果出现多个非特异性条带或弥散现象，应对A片段和B片段进行PCR纯化，并从步骤1.1.5开始重复实验。
  2. 添加完整的CTG优化的单体eGFP及其连接序列（RIPLING）16 (pCE1，质粒库编号#174434) 的引物设计工具，在目标基因的终止密码子上游立即位置进行设计，构建C端翻译融合。使用该构建体设计用于从pCE1扩增供体DNA（dDNA）的寡核苷酸。
    1. 设计一条与接头序列具有18-22 bp同源性的正向寡核苷酸 >与开放阅读框（ORF）3'端具有50 bp同源性。
      注意：18-22 bp 的同源序列可使扩增的退火温度介于 55 °C 和 58 °C如果全长寡核苷酸形成引物二聚体，请相应调整其与接头序列/GFP 或基因组的同源性。
    2. 设计一条反向寡核苷酸，其3'端与GFP的3'端具有18-22 bp的同源性，并 >与待标记ORF下游非编码序列同源的50 bp。
    3. 订购这些寡核苷酸，并使用提供的降落PCR循环条件扩增dDNA 表 4.
  3. 设计两组用于菌落PCR（cPCR）的寡核苷酸引物，以通过扩增侧翼整合位点来确认GFP的整合。首先，使用引物设计工具选择正向dDNA寡核苷酸，并点击 引物 右侧的按钮。
    1. 点击 设计引物 | 向导 | Tm 参数 并确认算法已设置为 SantaLucia 1998. 点击 选择使用 输入在1.2.1中设计的正向寡核苷酸的坐标作为目标序列。
    2. 将引物最适温度设置为 55 °C 并将最大扩增子大小设置为 900 bp，然后点击 设计引物 右上角的按钮
    3. 选择罚分最低的寡核苷酸对，并确认引物能够扩增5'整合位点区域。确保前向cPCR引物位于前向dDNA引物序列的上游，且反向cPCR引物完全位于eGFP标签或连接序列内部。
    4. 重复步骤1.3-1.3.3，使用反向dDNA寡核苷酸以生成第二组cPCR寡核苷酸，用于扩增3'整合位点区域。确保正向cPCR引物完全位于eGFP标签或连接序列内，反向cPCR引物位于反向dDNA引物序列的下游。
    5. 订购以下寡核苷酸。
  4. 用限制性内切酶分别消化 2,500 ng 含有 Cas9 的 pADH140 质粒（质粒文库编号 #90988），用于每个需进行 GFP 标记的基因。每种酶切反应的总体积设定为 15 µL；根据 pADH140 质粒浓度相应调整水的体积。采用指定的消化条件 表 5. 将消化后的质粒储存于 -20 °C 直至准备使用为止。
    注意：如果用含有单拷贝的菌株进行转化 C. albicans LEU2 基因，而非异源的 C. maltosa LEU2 标记，用 pADH137（质粒库编号 #90986）替代 pADH140。
  5. 变性 12 µL 每种将进行GFP标记的基因使用10 mg/mL鲑鱼精子DNA 99 °C 10分钟，然后迅速冷却至≤4 °C. 储存于 -20 °C 直至准备使用为止。
  6. 划线接种 C. albicans LEU2 半合子诺尔斯苏糖霉素敏感菌株接种至酵母胰蛋白胨葡萄糖（YPD）平板，于 30 °C 两天。
  7. 挑选单菌落并转移至4 mL液体YPD培养基中，于30°C培养12–16小时 30 °C 以250 rpm振荡培养。
  8. 测量 600 nm 处的光密度（OD600使用一次性比色皿（1 mL，光程1 cm）在分光光度计中测量过夜（12–16 h）培养物的光密度（OD600）。
  9. 将过夜培养物稀释至锥形瓶中，使OD600 YPD 中 OD 值为 0.1。每反应计 5 mL，并额外准备 5 mL 用于检测 OD600 稍后。
    注意：培养物体积取决于转化反应的数量。
  10. 在摇床培养箱中孵育稀释的过夜培养物 30 °C 以250 rpm振荡培养，直至达到OD600 0.5–0.8
  11. 在 4,000 离心 × g 室温孵育5分钟；移除并弃去上清液。
  12. 用带滤芯的枪头通过轻柔吹打，将细胞沉淀重悬于1 mL无菌水中，转移至无菌的1.5 mL离心管中。
  13. 通过在 4,000 × g 离心收集细胞沉淀 × g 室温孵育1分钟；移除并弃去上清液。加入1 mL无菌水重悬，重复洗涤一次，共洗涤两次。
  14. 将沉淀重悬于1/100体积的溶液中th 步骤1.10中所用体积的。例如，若使用了15 mL，则将沉淀重悬于 150 µL 无菌水。
  15. 在每个转化反应的单独离心管中混合 50 µL C片段的 50 µL dDNA，2,500 ng 经限制性内切酶消化的 pADH140，以及 10 µL 变性鲑鱼精子DNA
  16. 添加 50 µL 来自步骤 1.14 的细胞悬液，并用移液器混匀。
  17. 制备平板混合液的储备液（补充文件 1) 用于 n + 1 次转化。
  18. 向细胞/DNA混合物中加入1 mL培养基混合液，颠倒混匀5次。
    注意：倒置时轻敲管底，以去除残留液体。
  19. 将混合物置于培养箱中，在 30 °C 过夜（12–16 小时），不振荡。
  20. 将细胞在42 °C下热激15分钟 44 °C 在水浴中。
  21. 将1.5 mL微量离心管在5,000 × g下离心 × g 室温孵育 2 分钟。
  22. 使用无菌吸头通过真空抽吸去除PLATE混合液，注意避免扰动细胞沉淀。
  23. 将细胞沉淀重悬于 1 mL YPD 中，4,000 ×g 离心收集沉淀 × g 室温下孵育1分钟，移除并弃去上清液。重复洗涤一次，将细胞沉淀重悬于1 mL YPD培养基中，并将悬液转移至含有额外1 mL YPD培养基（终体积为2 mL）的10 mL圆底一次性培养管中。恢复细胞于 30 °C 以250 rpm振荡培养5小时。
  24. 将离心管在 4,000 × g 室温孵育5分钟；移除并弃去上清液。
  25. 将细胞沉淀重悬于 100 µL 无菌水，并涂布于补充有YPD的平板上 200 µg/mL nourseothricin (NAT200)。在 30 °C 2-3天。
  26. 分装 100 µL 将20 mM NaOH加入96孔PCR板的各孔中，每孔对应NAT200平板上生长的一个单菌落。使用无菌牙签或移液器吸头挑取单个转化菌落，将其点种至新的NAT200平板上，同时将剩余细胞悬浮于含20 mM NaOH的孔中。对剩余菌落重复上述操作，以制备用于cPCR反应的细胞裂解液作为DNA模板。
  27. 密封 PCR 板，在 10 分钟内孵育 10 分钟 99 °C 在带有加热盖的热循环仪中。
  28. 使用步骤 1.3–1.3.5 中设计的寡核苷酸建立两个 cPCR 反应。根据需要增加反应数量。按照步骤 1.26 制备的细胞裂解液，采用相应的循环条件和 PCR 反应体系进行 PCR 反应 表6. 运行 10-20 µL 在1%琼脂糖凝胶上对每个孔的产物进行电泳。筛选出两组cPCR引物均显示GFP dDNA正确整合的菌落。
  29. 在缺乏亮氨酸的合成完全（SC）培养基上重新划线分离含有GFP的菌落。于30 °C培养箱中孵育2–3天。 30 °C 孵育箱中孵育 2-3 天。挑取单菌落并划线接种于 YPD 培养基以及添加了 400 μg/mL nourseothricin (NAT400) 平板。筛选在 NAT400 平板上培养 24 小时后无法生长的菌落，这些菌落即为成功丢失 CRISPR 组分的菌落。
  30. 使用YPD划线平板上的细胞重复步骤1.25–1.28，以确认GFP标签仍保留。若出现正确条带，则接种至4 mL YPD培养基中，按照步骤1.7所述过夜培养（12–16 h）。
  31. 将新构建的GFP标签菌株的过夜培养物与经滤膜除菌的50%甘油按1:1比例在无菌冻存管中混合。于-80°C保存。80 °C 根据需要重新划线接种至YPD平板。
    ​注意：建议通过荧光显微镜观察标签化转录因子的核定位，并在适当的表型分析中确认其具有野生型表型，以验证GFP标签菌株的正确性。

2. 生物膜培养物的样品制备

  1. 划线接种 C. albicans GFP标记的菌株接种至YPD琼脂平板，于 30 °C 培养2-3天。用无菌牙签挑取琼脂平板上的单个菌落，接种于4 mL YPD液体培养基中，30 °C下振荡培养 30 °C 振荡培养过夜（12–16 小时）。测定 OD600 过夜培养物的
    注意：建议每个样本为 CUT 使用三个生物学重复&RUN 实验
  2. 将过夜培养物接种至无菌的12孔未处理细胞培养板中，使终末OD600 0.5（相当于2 × 107 个/mL）置于 2 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 培养基中。在 37 °C 在微孔板振荡培养箱中以250 rpm振荡培养。
    注意：建议每种菌株使用一块12孔细胞培养板，其中一孔不接种作为仅含培养基的污染对照。本方案已成功应用于低至1/10的样本量th 一个12孔细胞培养板的单孔（或低至500万个细胞）。使用更多的细胞可增加总DNA产量，通常能够获得高质量的测序文库。
  3. 使用连接至真空抽滤装置的无菌移液吸头，通过抽吸去除未贴壁的细胞。用 2 mL 无菌 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤贴壁细胞一次。向孔中加入 2 mL 新鲜 RPMI-1640 培养基，并于 24 h 在 37 °C 以250 rpm振荡。
    注意：在不同菌株和/或不同条件的孔之间更换移液器吸头。吸取液体时，切勿用吸头刮擦孔底。
  4. 在24小时孵育结束后，将每个接种孔中的液体和生物膜材料收集并合并至一个无菌的50 mL锥形管中。若同时处理多个菌株或不同生长条件，可根据需要独立重复此步骤，分别收集并合并成多个样本池。
    ​注意：使用带滤芯的移液枪头刮擦每个孔的底部和边缘，以去除仍附着在表面的细胞。用移液枪吹打混匀生物膜。
  5. 4,000 × g 离心收集样品 × g 室温孵育 5 分钟。尽可能倾去上清液，注意尽量减少对沉淀物的扰动。将沉淀物在液氮中速冻，并于 -80 °C 收集后立即进行或直接进入步骤4（细胞核分离）。

3. 浮游培养物的样品制备

  1. 将绿色荧光蛋白（GFP）标记的白色念珠菌（C. albicans）菌株划线接种于YPD琼脂平板上，在30 °C培养2-3天。从平板上挑取单个孤立菌落，接种至4 mL YPD液体培养基中，在30 °C条件下振荡培养过夜（12-16 h）。测定过夜培养物的OD600 值。
  2. 将过夜培养物以OD600为0.1的起始浓度接种于50 mL RPMI-1640液体培养基中，在30 °C、225 rpm振荡条件下培养2-5小时，直至OD600 达到0.5至0.8之间。
    注意：细胞在收获前应至少经历两次倍增。浮游培养所用条件可根据需要进行调整。
  3. 在室温下以4,000 × g离心5分钟收集菌体沉淀，尽可能倾去上清液，注意避免扰动沉淀。用液氮速冻沉淀，并在收集后立即于-80 °C保存，或直接进入步骤4（细胞核分离）。

4. 细胞核的分离

注意：实验当天需新鲜配制Ficoll缓冲液，并向Resuspension缓冲液分装液中加入2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂，同时向SPC缓冲液分装液中加入蛋白酶抑制剂（参见补充文件1）。重悬沉淀时，应使用200 µL或1 mL移液器吸头轻柔吹打，以避免损伤细胞或细胞核。在开始细胞核分离前，打开恒温金属浴并预热至30 °C。本实验后续使用的所有移液器吸头和离心管均应为经认证的无DNA/RNA以及无DNase/RNase污染的产品，且建议在所有后续移液步骤中使用带滤芯的吸头。

  1. 将沉淀重悬于1 mL室温重悬缓冲液中，转移至无菌1.5 mL微量离心管中。在2,000 ×g下离心沉淀 × g 室温下 在台式离心机中离心2分钟，弃去上清液。
    注意：使用以下任一方法去除上清液 200 µL 或1 mL移液器吸头，注意尽量减少对沉淀物的扰动。
  2. 将沉淀重悬于 200 µL 室温重悬缓冲液。从重悬的沉淀中，转移一份 5 µL 分装至新的PCR管中，并于 4 °C 供后续使用。
    注意：此等分试样将在后续的质量控制步骤中用作对照，以评估分离的细胞核的质量。
  3. 2,000 × g 离心收集菌体 × g 2分钟，用移液器吸除并弃去上清液。使用相同溶液重复洗涤步骤两次 200 µL 重悬缓冲液
  4. 2,000 × g 离心 × g 室温孵育 2 分钟，移除上清液。加入 300 µL 重悬缓冲液的量及 10 µL 溶菌酶溶液（50 mg/mL，参见 材料表）。在30分钟内孵育 30 °C 在加热块中。
    注意：或者，可使用加热至 30 °C 也可使用水浴锅代替加热模块。此处使用的原生质球化条件已优化，对酵母细胞和菌丝细胞均有效。 C. albicans建议在将本方案应用于球状体化时优化相关条件 C. albicans 细胞具有影响细胞壁完整性或其他细胞形态的突变。在此30分钟孵育步骤期间，用户可选择提前完成步骤5（刀豆球蛋白A磁珠活化）以节省时间。
    1. 关键步骤：30 分钟孵育后，转移一个 5 µL 分装至新的PCR管中。向其中加入 5 µL 分离细胞核的 5 µL 完整细胞的等分试样，储存于 4 °C 从步骤 4.2 开始，添加 1 µL 荧光增白剂Calcofluor white（一种荧光细胞壁染料）和 1 µL SYTO 13（一种核酸染料）的孵育。在 30 °C 在黑暗中孵育30分钟。
    2. 使用荧光显微镜观察分离的细胞核的完整性和纯度。选择显示明显染色且完整的细胞核（使用488-509 nm激发滤光片）的样本，并确保钙荧白染料未对细胞壁产生染色（使用390-420 nm激发滤光片）。在完整细胞对照中，应观察到钙荧白染料对细胞壁的明显染色（使用390-420 nm激发滤光片）以及完整细胞核的染色（使用488-509 nm激发滤光片）。
  5. 2,000 × g 离心 × g 在 4 °C 5 分钟后去除上清液。将沉淀重悬于 500 µL 使用1 mL滤芯吸头，将冰冷的重悬缓冲液轻轻吹打5次，重悬沉淀。在2,000 ×g下离心 × g 在 4 °C 5分钟，使用1 mL移液器移除上清液。用1 mL新配制的冰冻Ficoll缓冲液重悬沉淀。
    注意：从此步骤开始，将样品和缓冲液置于冰上。
  6. 将样品在5,000 × g下离心 × g 在 4 °C 10 分钟，去除上清液。将沉淀重悬于 500 µL 冰冷的SPC缓冲液
    注意：从此步骤开始，需极其轻柔地操作细胞核，以避免对其造成损伤。
  7. 将样品在5,000 × g下离心 × g 在 4 °C 10 分钟，尽可能去除上清液，注意不要扰动沉淀。将含有沉淀细胞核的离心管置于冰上，进行第 5 步。如果第 5 步已在 4.4 步骤中提前完成，则直接进行第 6 步，或将沉淀在液氮中速冻后于 -80 °C 采集后立即进行。

5. 刀豆蛋白A珠活化

注意：这是关键步骤。从这一步开始，用户可以选择使用市售的 CUT&RUN 试剂盒继续实验，或者单独采购关键组分并自行配制缓冲液。如果使用商业试剂盒，除非另有说明，以下使用的所有缓冲液和试剂均包含在试剂盒中。单独采购试剂的各个目录号也列在材料表中。使用前将所有缓冲液置于冰上预冷。完成第5步后，建议立即进入第6步。避免对分离的细胞核进行多次冻融，因为这会增加DNA损伤，可能导致结果质量不佳。

  1. 使用移液器轻轻重悬刀豆蛋白A（ConA）磁珠。将每份待处理样品的22 µL ConA磁珠悬液转移至一个1.5 mL微量离心管中。将管子置于磁力架上，直至磁珠悬液澄清；用移液器吸除并弃去上清液。
    注意：例如，若总共需进行10个样品的CUT&RUN实验，则将220 µL ConA磁珠悬液转移至一个1.5 mL微量离心管中。
  2. 将含有ConA磁珠的管子从磁力架上取下，立即加入200 µL预冷的磁珠活化缓冲液，并使用移液器轻轻混匀。将管子放回磁力架，直至磁珠悬液澄清；用移液器吸除并弃去上清液。重复此步骤，共洗涤两次。
  3. 按每份待处理的细胞核样品计，用22 µL预冷的磁珠活化缓冲液重悬磁珠。将磁珠置于冰上保存，直至后续使用。
    ​注意：后续步骤的通量取决于可用的磁力架数量及其容纳能力。对于大多数使用者而言，使用两个16孔磁力架处理32个样品是可管理的操作规模。然而，经验更丰富的使用者或配备自动化液体处理系统时，可实现更高的通量。

6. 将细胞核结合至活化珠

注意：使用前将所有缓冲液置于冰上预冷。所有添加蛋白酶抑制剂的缓冲液均需在实验当天新鲜配制。建议在后续步骤中使用0.2 mL条形管。

  1. 将第4步中获得的沉淀细胞核重悬于100 µL预冷的SPC缓冲液中，并转移至新的8联管（0.2 mL）中。向每个样品中加入20 µL活化磁珠，轻轻吹打混匀。室温下孵育10分钟，不进行震荡。
  2. 将管子置于磁力架上，直至悬液变澄清，然后用移液器吸除并弃去上清液。从磁力架上取下管子，向每个样品中加入200 µL预冷的洗涤缓冲液。通过轻轻吹打上下混合5次，使磁珠重悬。将每个样品中的100 µL等分试样转移至新的8联管（0.2 mL）中。
    1. 关键步骤：将每个CUT&RUN样品分为两个独立的等分试样。其中一个等分试样用于阴性对照抗体（如IgG阴性对照抗体），另一个则用于针对目标蛋白的特异性抗体（如抗GFP抗体）。
      注意：计算分析流程需要这两个样品，以准确识别特异性富集的目标转录因子信号。此外，也可使用抗GFP抗体对未标记的菌株进行额外对照实验。该对照实验的结果与在GFP标记菌株中使用IgG抗体的结果相当。因此，为简化操作，建议在所有实验中均采用标准的IgG对照。

7. 一抗结合

注意：pAG-MNase 融合蛋白可有效结合兔、山羊、驴、豚鼠和小鼠的 IgG 抗体17。通常，大多数商用的经 ChIP-seq 认证的抗体均适用于 CUT&RUN 实验。一抗的使用量取决于抗体的效率，若该抗体此前未在 ChIP 或 CUT&RUN 实验中测试过，则可能需要进行抗体梯度稀释（如终浓度为 1:50、1:100、1:200 和 1:400）以优化条件。所有缓冲液在使用前需置于冰上预冷。用于抗体结合步骤的所有缓冲液均应在实验当天新鲜配制。

  1. 将离心管置于磁力架上，等待悬液完全澄清后，用移液器吸除并弃去上清液。加入 50 µL 抗体缓冲液，通过移液轻轻混匀。
  2. 加入 3 µL 抗 GFP 多克隆抗体（若使用未经验证的抗体，则加入 0.5 µg）。在 4 °C 下于旋转混合仪上孵育 2 小时。
    注意：一些 CUT&RUN 方案报道，在加入 pAG-MNase 前添加二抗可提高产量14；然而，本研究中该额外步骤未观察到显著改善，因此未纳入本方案。
  3. 在室温下以 100 × g 短暂离心 5 秒，将离心管置于磁力架上，待悬液澄清后，用移液器吸除并弃去上清液。在含有磁珠的离心管仍处于磁力架上的同时，直接向磁珠中加入 200 µL 冰冷的细胞通透缓冲液。用移液器吸除并弃去上清液。用冰冷的细胞通透缓冲液重复洗涤一次，共洗涤两次。
  4. 向每根离心管中加入 50 µL 冰冷的细胞通透缓冲液，并通过移液轻轻混匀。
    ​注意：此时磁珠常出现聚集现象，但可通过使用 200 µL 移液器轻轻混匀而轻易分散。

8. pAG-MNase 与抗体的结合

  1. 向每个样品中加入 2.5 µL 的 pAG-Mnase（20 倍浓缩液），并通过移液轻轻混匀。将样品以约 45° 角略微倾斜放置于 4 °C 的摇床上。开启摇床，孵育 1 小时。
  2. 在室温下以 100 × g 短暂离心条形管 5 秒，将管子置于磁力架上，待悬液澄清后，用移液器吸除并弃去上清液。
    ​注意：此步骤至关重要。若在此步骤后仍有残留抗体带入管盖或管壁，将显著增加背景信号。
  3. 当含有磁珠的管子仍置于磁力架上时，加入 200 µL 冰冷的细胞通透缓冲液，待悬液澄清后，用移液器吸除并弃去上清液。用细胞通透缓冲液重复此步骤，共洗涤两次。
  4. 向样品中加入 100 µL 冰冷的细胞通透缓冲液，并轻轻吹打 5 次。

9. 靶向染色质消化与释放

  1. 将含有样品的离心管置于湿冰浴中孵育5分钟。使用多通道移液器向每个样品中加入3 µL的100 mM CaCl2。轻轻吹打混匀5次，立即将离心管放回湿冰浴中，并孵育30分钟。
  2. 向每个样品中加入66 µL终止缓冲液，并轻轻涡旋混匀。将样品在37 °C干浴中孵育10分钟。
    注意：建议在终止缓冲液中每份样品加入1.5 pg异源性E. coli spike-in DNA。每100万至1000万条比对的实验序列中加入1.5 pg E. coli spike-in DNA可产生1,000–10,000条比对的spike-in序列14。spike-in DNA用于校准测序深度，在系列样品比较中尤为重要。强烈建议添加E. coli spike-in，但并非必需。商用CUT&RUN试剂盒包含E. coli spike-in DNA，也可单独购买。
  3. 将离心管置于磁力架上，将160 µL上清液转移至1.5 mL微量离心管中。另取80 µL样品转移至新的2 mL微量离心管中，如需备用样品则储存于-20 °C。剩余80 µL样品继续进行步骤10。

10. 收集的DNA样本的纯化

注意：使用前将DNA纯化磁珠在室温下孵育30分钟。将100%异丙醇预冷于冰上。混合样品时，用移液器上下吹打10次。

  1. 涡旋DNA纯化磁珠以混匀磁珠悬液。向每个样本中加入50 µL（约0.6倍样本体积）重悬的磁珠。用移液器吹打混匀，并在室温下于旋转仪上孵育5分钟。
    注意：DNA纯化磁珠与样本的体积比至关重要。相对于样本使用0.6倍体积的DNA纯化磁珠溶液，可使磁珠结合从破损细胞核中释放出的大片段DNA。CUT&RUN富集的DNA片段远小于这些大片段，因此在此步骤中保留在上清液中。
  2. 将管子置于磁力架上，转移含有DNA的上清液130 µL至0.2 mL 8联管中。向样本中再加入30 µL DNA纯化磁珠（总体积为160 µL）。
  3. 加入170 µL（约1倍样本体积）预冷的100%异丙醇，用移液器上下吹打10次充分混匀，然后在冰上孵育10分钟。
    注意：此步骤必须使用预冷的100%异丙醇，以确保DNA纯化磁珠能高效捕获CUT&RUN富集的小片段DNA。
  4. 将管子置于磁力架上，待磁珠沉降后，小心用移液器吸除并弃去上清液。
  5. 保持管子在磁力架上，向管内加入200 µL新鲜配制的室温80%乙醇，在室温下孵育30秒。小心用移液器吸除并弃去上清液。重复此步骤，共进行两次80%乙醇洗涤。
  6. 短暂离心（100 × g），然后将管子放回磁力架，待磁珠沉降后，用移液器吸除残留乙醇。在磁力架上打开管盖，将磁珠室温晾干5分钟。
    注意：干燥时间不得超过5分钟，否则会显著降低最终DNA得率。
  7. 将管子从磁力架上取下，通过加入17 µL pH 8.0的0.1x Tris-EDTA（TE）缓冲液洗脱DNA。充分混匀后，在室温下孵育5分钟。
  8. 将管子置于磁力架上，待磁珠沉降后，小心转移15 µL上清液至无菌0.2 mL PCR管中。
  9. 按照制造商说明书，使用荧光计测定所收集DNA的浓度。
    注意：通常所收集DNA的浓度约为1 ng/µL。有时DNA浓度过低，无法通过荧光计准确测定，但这并不表示实验失败。无论所收集DNA的浓度如何，均应继续进行文库构建。
  10. 继续进行第11步，或在-20 °C保存样本直至使用。

11. 测序文库制备

注意：以下步骤使用一种市售的文库制备试剂盒。在使用连接主混合液（Ligation Master Mix）进行操作时，应尽量减少触碰离心管，并始终将其置于冰上。

  1. 使用 pH 8 的 0.1x TE 将 CUT&RUN DNA 总体积补至 50 µL。按每份样本 3 µL 末端修复酶混合液和 7 µL 末端修复反应缓冲液配制主混合液。向 CUT&RUN DNA 中加入 10 µL 主混合液，通过上下吹打 5 次充分混匀。
  2. 在 100 × g 条件下短暂离心，使管壁液体全部沉至管底。将试管放入热循环仪中，加热盖温度设为 ≥75 °C，运行 表 7 中的循环条件。
    注意：根据步骤 10 收集的起始输入 DNA 浓度，参照 表 8 进行所需的接头稀释。
  3. 每份样本加入 2.5 µL 接头，通过上下吹打 10 次充分混匀。
    注意：必须在加入连接主混合液之前将接头加入样本并充分混匀。
  4. 配制主混合液：每份样本取 30 µL 连接主混合液和 1 µL 连接增强剂。向样本中加入 31 µL 主混合液，通过上下吹打 10 次充分混匀。
  5. 在加热盖关闭的热循环仪中，于 20 °C 孵育 15 分钟。
    注意：样本必须保持在冰上，并仅在热循环仪达到 20 °C 后才转移至其中。
  6. 在 100 × g 条件下短暂离心，使管壁液体全部沉至管底，加入 3 µL 尿嘧啶切除酶，将试管置于热循环仪中，在加热盖温度设为 ≥47 °C 的条件下于 37 °C 孵育 15 分钟。
    注意：此为安全暂停点；可将样本储存于 -20 °C 或直接进入步骤 11.7。若直接进入步骤 11.7，请在使用前将 DNA 纯化磁珠于室温孵育 30 分钟。
  7. 向步骤 11.6 的接头连接反应体系中加入 154.4 µL（约 1.6 倍样本体积）DNA 纯化磁珠。吹打混匀后，于室温孵育 5 分钟。
  8. 将试管置于磁力架上，待悬液澄清后，小心用移液器吸除并弃去上清液。
  9. 向试管中加入 200 µL 新鲜配制的室温 80% 乙醇，室温孵育 30 秒。小心用移液器吸除并弃去上清液，重复此步骤共进行两次 80% 乙醇洗涤。
  10. 在 100 × g 条件下短暂离心。将试管放回磁力架，用移液器吸除残留乙醇。在磁力架上敞口放置，室温晾干磁珠 5 分钟。
    注意：干燥时间不得超过 5 分钟，否则会显著降低最终 DNA 产量。
  11. 将试管从磁力架上取下，加入 17 µL pH 8 的 0.1x TE，充分混匀后于室温孵育 5 分钟，使 DNA 从磁珠上洗脱。
  12. 将试管置于磁力架上，待悬液澄清后，小心将 15 µL 上清液转移至新的无菌 0.2 mL PCR 管中。
  13. 按每份样本 25 µL DNA 聚合酶主混合液和 5 µL 通用正向文库扩增引物（10 µM）配制主混合液。
    注意：额外多配一份主混合液以补偿移液损耗。
  14. 向 15 µL 接头连接后的 DNA 样本中加入 30 µL 主混合液。每份样本再加入 5 µL 反向唯一索引文库扩增引物（10 µM），使最终总体积达到 50 µL。通过上下吹打 10 次充分混匀。运行 表 9 中的 PCR 循环条件。
    注意：使用前将 DNA 纯化磁珠于室温孵育 30 分钟。
  15. 涡旋振荡 DNA 纯化磁珠使其重悬。向 PCR 扩增后的 DNA 样本中加入 35 µL（约 0.7 倍样本体积）重悬磁珠。混匀后于室温在旋转混合仪上孵育 5 分钟。
  16. 将试管置于磁力架上，待悬液澄清后，小心将含 DNA 的上清液转移至新的 0.2 mL 8 孔 PCR 条形管中。
  17. 向样本中加入 119 µL（约 1.4 倍样本体积）磁珠，通过上下吹打 5 次混匀。于室温在旋转混合仪上孵育 5 分钟。
  18. 将试管置于磁力架上，待悬液澄清后，小心用移液器吸除并弃去上清液。
  19. 向试管中加入 200 µL 新鲜配制的室温 80% 乙醇，室温孵育 30 秒。小心用移液器吸除并弃去上清液；重复此步骤共进行两次 80% 乙醇洗涤。
  20. 在 100 × g 条件下短暂离心。将试管放回磁力架，用移液器吸除残留乙醇。在磁力架上敞口放置，室温晾干磁珠 5 分钟。
    注意：干燥时间不得超过 5 分钟，否则会显著降低最终 DNA 产量。
  21. 将试管从磁力架上取下，加入 14 µL pH 8 的 0.1x TE，充分混匀后于室温孵育 5 分钟，使 DNA 从磁珠上洗脱。
  22. 将试管置于磁力架上，待悬液澄清后，小心将 13 µL 上清液转移至新的无菌 0.2 mL PCR 管中。
  23. 新鲜配制 1x Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液，将预制成的商用 10% 丙烯酰胺 TBE 凝胶插入已充满 1x TBE 的凝胶电泳装置中。
  24. 在第一孔中加入 2 µL 低分子量 DNA 标准品。将 3 µL 6x 上样染料与 13 µL 来自步骤 11.22 的样本混合。小心将 15 µL 混合液加入凝胶的每一孔中。在 70 V 条件下电泳 90 分钟。
    注意：建议在每份样本之间留出一个空孔，以降低样本交叉污染的风险。经验丰富的用户在避免交叉污染的前提下，可考虑使用所有孔位，尤其是在处理大量样本时。
  25. 从电泳槽中取出凝胶模具。按照制造商说明打开模具，小心将凝胶从模具中取出，并放入含有 100 mL 1x TBE 的凝胶托盘中。
    注意：取出凝胶时务必轻柔，避免撕裂，因其较薄且脆弱。操作凝胶时，手套和凝胶本身必须预先用 1x TBE 润湿。凝胶托盘应略大于凝胶尺寸（每边约大 0.5 英寸）。96 孔 PCR 管储存盒附带的塑料盖可作为标准小型凝胶的便捷托盘。
  26. 向托盘中加入 10 µL 核酸凝胶染料，轻轻摇晃。用铝箔覆盖以避光，室温静置孵育 10 分钟。
  27. 用 100 mL 去离子水冲洗凝胶两次。使用琥珀色滤光片覆盖，在蓝光照射下成像（图 2）。
    注意：成功的文库在 100 至 500 bp 之间呈现弥散条带。同时会出现一条明显的约 125 bp 的接头二聚体条带。接头二聚体的存在并不代表文库质量差。在低丰度转录因子的 CUT&RUN 实验中，由于起始材料量较少，此类接头二聚体不可避免。切勿使用紫外光，因其会损伤 DNA。
  28. 如 图 2 所示，对每份文库，切取凝胶中略高于约 125 bp 显著接头二聚体条带（确保不接触该条带）且低于 400 bp 标准品标记的区域。
    注意：必须避免切到约 125 bp 的接头二聚体条带。即使微量的接头二聚体会显著降低文库质量。
  29. 使用 22 G 针头在 0.65 mL 管底部刺孔，并将刺孔管放入无菌 2 mL 微量离心管中。将凝胶切片转移至 2 mL 微量离心管内的刺孔管中。
  30. 将含有 0.65 mL 刺孔管及样本的 2 mL 微量离心管在室温下以 10,000 × g 离心 2 分钟，使凝胶悬液收集至 2 mL 微量离心管中。
    注意：此时刺孔管应为空，可丢弃。若刺孔管内仍有残留凝胶，将其重新放入 2 mL 微量离心管中，再次于室温以 10,000 × g 离心 2 分钟。
  31. 向 2 mL 微量离心管中的凝胶悬液加入 300 µL 冰冷的凝胶洗脱缓冲液，在旋转混合仪上室温混匀至少 3 小时或过夜（12–16 小时）。
  32. 将全部液体和凝胶悬液转移至 0.22 µm 滤柱中。室温下以 10,000 × g 离心 1 分钟；收集体积应约为 300 µL。
  33. 加入 450 µL（约 1.5 倍样本体积）DNA 纯化磁珠，于旋转混合仪上室温孵育 5 分钟，然后将样本置于磁力架上直至悬液澄清。
    注意：使用前将 DNA 纯化磁珠于室温孵育 30 分钟。
  34. 吸除并弃去 500 µL 上清液，注意不要扰动磁珠。
  35. 将样本从磁力架上取下，通过上下吹打 5 次混匀磁珠。将 200 µL 样本转移至新的 PCR 条形管中。
  36. 将条形管置于磁力架上，待悬液澄清后，小心用移液器吸除并弃去上清液。
  37. 向试管中加入 200 µL 新鲜配制的室温 80% 乙醇，室温孵育 30 秒。小心用移液器吸除并弃去上清液；重复此步骤共进行两次 80% 乙醇洗涤。
  38. 在 100 × g 条件下短暂离心。将试管放回磁力架，用移液器吸除残留乙醇。在磁力架上敞口放置，室温晾干磁珠最多 5 分钟。
    注意：干燥时间不得超过 5 分钟，否则会显著降低最终 DNA 产量。
  39. 将试管从磁力架上取下，加入 17 µL pH 8 的 0.1x TE，充分混匀后于室温孵育 5 分钟，使 DNA 从磁珠上洗脱。
  40. 将试管置于磁力架上，待悬液澄清后，小心将 15 µL 上清液转移至新的无菌 0.2 mL PCR 管中。
  41. 使用荧光计测定最终文库浓度；使用此最终文库进行测序。
    ​注意：最多可将 48 个文库混合，在单个测序通道中使用可提供至少 3 亿条 40 bp 或更长双端读长的测序平台进行测序。

12. CUT&RUN 测序分析

注意：本节介绍用于分析 CUT&RUN 测序数据的计算流程。该流程从搭建计算用虚拟环境开始，逐步指导用户在其本地计算机上执行相应命令。本流程适用于所有计算资源，包括本地计算机、虚拟云服务器以及高性能计算集群。本文中所有 CUT&RUN 数据均可在 NCBI GEO 数据库中获取，登录号为 GSE193803。

  1. 从 https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis 下载 CUT&RUN 分析的源代码。
    注意：该工作流程在 macOS 或 Linux 操作系统上运行效果最佳。Windows 用户可使用 GitBash 运行该工作流程（参见材料表）。
    1. 通过点击 GitHub 页面上的绿色 Code 按钮 | Download ZIP 选项，直接下载代码。将文件夹解压至本地计算机的适当位置。
  2. 安装 Conda 环境（参见材料表），并仅需运行一次。
    注意：该工作流程使用 Conda 命令行工具环境来安装所有必需的软件和工具。
  3. Conda 安装完成后（仅需运行一次），使用随附的 补充文件 2 中提供的以下命令创建虚拟环境：
    conda create --name <env> --file Supplementary_File_2.txt
  4. 每次执行该工作流程时，使用以下命令激活虚拟环境：
    conda activate <env>
  5. 将输入的原始 FASTQ 文件整理到一个文件夹中，理想情况下每个 CUT&RUN 实验对应一个独立文件夹。

13. 生成用于比对的基因组文件

  1. 生成用于比对的基因组文件（每个基因组文件仅需运行一次）。创建一个文件夹以保存所有 C. albicans 基因组文件，例如：
    mkdir ca_genome_files

14. 下载 C. albicans 基因组组装版本 21

  1. 使用 wget 或 curl 工具从 Candida 基因组数据库下载 C. albicans 基因组组装版本 21（见材料表）18。
    ​注意：本文使用 C. albicans 组装版本 21，以便将 CUT&RUN 结果与先前发表的 ChIP-chip 结果进行比较，后者比对至组装版本 21。用户可下载其他组装版本，并运行类似命令以生成满足其比对需求的相关基因组文件。

15. 生成 Bowtie 2 索引数据库（数据库名称：ca21）

  1. 使用以下命令：
    bowtie2-build C_albicans_SC5314_A21_current_chromosomes.fasta.gz ca21
    ​bowtie2-inspect -s ca21

16. 运行 CUT&RUN 分析流程

  1. 阅读帮助部分，以熟悉该分析流程的参数。
    ​bash cut_n_run_pipeline.sh -h

17. 使用相关参数执行 cut_n_run_pipeline.sh 文件

  1. 运行脚本：
    bash cut_n_run_pipeline.sh /path/to/input/folder 4 y y y y y > /path/to/output.log 2>&1
    注意：代码第19-36行中相关参数的详细说明见GitHub页面 https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis/blob/main/cut_n_run_pipeline.sh

18. 整理输出文件

  1. 使用 BedTools merge 功能合并位于 /path/to/input/folder/peakcalling/macs2 中由 MACS2 调用的所有重复样本的显著峰19.
    cat /path/to/input/folder/peakcalling/macs2/all_replicate_files | sort -k1,1 -k2,2n | mergeBed -c 4,5,6,7,8,9 -o last,mean,first,mean,mean,mean > /path/to/merged_output.bed
    注意：有关评估重复样本中重叠峰的附加信息和最佳实践，请参阅 Landt 等人。20 和 Boyd 等人21.

19. 使用 BedTools subtract 功能去除与基因组黑名单区域匹配的条目

  1. 使用以下命令：subtractBed -a /path/to/merged_output.bed -b /path/to/Supplementary_File_3.bed -A > /path/to/merged_output_no_blocklist_hits.bed
    注意：C. albicans 基因组中的黑名单区域以 .bed 文件形式提供，详见补充文件3。该列表主要包含高度重复的序列元件和端粒重复序列、着丝粒等区域，这些区域在 C. albicans CUT&RUN、ChIP-seq 和 ChIP-chip 数据集中通常会产生假阳性结果。因此，建议去除黑名单区域。然而，对于某些特定的蛋白靶点，排除这些位点可能不恰当或不符合研究目的。用户可根据需要跳过此步骤，以保留这些黑名单区域内的信号，或自行定义黑名单区域。

20. 使用 UCSC bigWigMerge 功能合并来自重复样本的 BigWig 文件22

  1. 使用以下内容： bigWigMerge /path/to/input/folder/bigwig/all_final_bw_files /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file
  2. 使用 UCSC 的 bedGraphToBigWig 功能将 bigWigMerge 生成的 BedGraph 输出转换为 BigWig 格式。
    bedGraphToBigWig /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bdg_file /path/to/input/folder/bigwig/ all_final_bw_file

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结果

本研究对 CUT&RUN 实验方案进行了改进和优化，以用于分析 C. albicans 生物膜及浮游培养物中特定转录因子（TF）的全基因组定位（实验流程概览见图2）。同时提供了一套完整的数据分析流程，便于用户对 CUT&RUN 测序数据进行分析，且无需具备深厚的编程或生物信息学背景（数据分析流程概览见图3）。与 ChIP-chip 和 ChIP-seq 方法不同，CUT&RUN 实验使用完整且已通透化的细胞核进行，所需起始细胞数量显著减少，且无需甲醛交联。从 C. albicans 原生质体中分离完整细胞核是本方案中的关键步骤。由于需使用溶菌酶消化 C. albicans 细胞壁以实现高效的原生质体制备，而酶解反应条件需根据不同细胞类型进行优化，因此该步骤具有挑战性。为确保 CUT&RUN 实验成功并获得高质量的测序结果，本方案包含早期质量控制环节，并通过标准荧光显微镜观察验证完整细胞核的存在。

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讨论

本方案提供了一套全面的实验与计算流程，用于在C. albicans中进行全基因组范围的调控性转录因子（TF）定位。该方案设计为任何具备标准微生物学和分子生物学训练背景的研究人员均可轻松上手。通过利用CUT&RUN检测技术的高动态范围和低样本输入需求，并针对C. albicans生物膜和浮游培养中转录因子- DNA 结合相互作用的定位进行了优化，本方案为传统的ChIP-seq方法提供了一种强大且低成本的替代方案。与ChIP-seq相比，CUT&RUN具有显著更高的灵敏度，测序读段中映射到结合峰的比例更高，更适用于高通量分析，所需起始细胞数量大幅减少，无需使用有毒的交联试剂，且每样本仅需十分之一的测序读段即可获得高质量结果13,14,17,23,24。为进一步降低本方...

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披露

Clarissa J. Nobile 是 BioSynesis, Inc. 的联合创始人，这是一家致力于开发生物膜感染诊断方法和治疗手段的公司。

致谢

感谢Nobile实验室和Hernday实验室所有过去和现任成员对本文稿提供的反馈意见。 本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所（NIGMS）资助，项目编号为R35GM124594，并由Kamangar家族为C.J.N.设立的捐赠讲席提供支持。此外，本研究还获得NIH下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）资助，项目编号为R15AI137975（授予A.D.H.）。C.L.E. 受到NIH下属的国家牙科与颅面研究所（NIDCR）博士后奖学金F31DE028488的支持。本文内容由作者全权负责，不代表资助方的观点。资助方在研究设计、数据收集、分析或解释、文稿撰写，以及决定发表研究成果等方面均未参与。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 μm 滤膜Millipore SigmaSLGPM33RS
0.65 mL 低吸附管VWR490003-190
1 M CaCl2Fisher Scientific50-152-341
1 M PIPESFisher ScientificAAJ61224AK
12 孔未处理细胞培养板Corning351143
2-巯基乙醇Sigma-Aldrich60-24-2
2% 皂苷（Digitonin）Fisher ScientificCHR103MI
50 mL 圆锥形离心管VWR89039-658
5x Phusion HF 缓冲液Fisher ScientificF530S为 Phusion 高保真 DNA 聚合酶产品组分；文中称为 "DNA 聚合酶缓冲液"
琼脂CriterionC5001
Agencourt AMPure XP 磁珠Beckman CoulterA63880
Agilent BioanalyzerAgilentG2939BA文中称为 "毛细管电泳仪"；依用户而定
带盖 PCR 反应条排，Simport ScientificVWR89133-910
蛋白胨（Bacto peptone）BD Biosciences211677
Benchling 引物设计工具Benchlinghttps://www.benchling.com/molecular-biology/；文中称为 "引物设计工具"
甜菜碱（Betaine）Fisher ScientificAAJ77507AB
Calcofluor White 染色剂Sigma-Aldrich18909-100ML-F
Candida 基因组数据库http://www.candidagenome.org/
刀豆蛋白 A（ConA）偶联的顺磁性微珠Polysciences 86057-3
Conda 软件https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
curl 工具http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
CUTANA ChIC/CUT&RUN 试剂盒Epicypher14-1048文中称为 "CUT&RUN 试剂盒"
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物（10 mM）New England BiolabsN0447S
右旋葡萄糖（D-葡萄糖）Fisher ScientificD163
Difco D-甘露醇 BD Biosciences217020
一次性比色皿Fisher Scientific14-955-127
一次性移液管Fisher Scientific13-711-20
DNA 凝胶上样染料（6x）Fisher ScientificR0611
DreamTaq Green DNA 聚合酶Fisher ScientificEP0713文中称为 "cPCR DNA 聚合酶"
DreamTaq Green DNA 聚合酶缓冲液Fisher ScientificEP0713为 DreamTaq Green DNA 聚合酶组分；文中称为 "cPCR DNA 聚合酶缓冲液"
E. coli 内参 DNAEpicypher18-1401
ELMI 微孔板孵育器ELMITRMS-04文中称为 "微孔板孵育器"
末端修复酶混合物为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分
末端修复反应缓冲液为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分
200 证明乙醇VWR89125-170
FastDigest MssIFisher ScientificFD1344文中称为 "限制性内切酶"
FastDigest MssI 缓冲液Fisher ScientificFD1344为 FastDigest MssI 试剂盒组分；文中称为 "限制性内切酶缓冲液"
Ficoll 400Fisher BioReagentsBP525-25
荧光显微镜依用户而定
凝胶电泳装置依用户而定
GeneRuler 低分子量 DNA 标准物Fisher ScientificFERSM1192
GitBash 工作流程https://gitforwindows.org/
GitHub 源代码https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis
HEPES-KOH pH 7.5Boston BioProductsBBH-75-K
高速离心机依用户而定
异丙醇Sigma-AldrichPX1830-4
镜头纸VWR52846-001
连接增强剂为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分
二水合乙酸锂MP Biomedicals215525683
Living Colors 全长 GFP 多克隆抗体Takara632592依用户而定
MACS2https://pypi.org/project/MACS2/
磁力分离架，适用于 0.2 mL 管Epicypher10-0008
磁力分离架，适用于 1.5 mL 管Fisher ScientificMR02
MgCl2Sigma-AldrichM8266
1.5 mL 微量离心管Fisher Scientific05-408-129
微孔板和比色皿分光光度计BioTekEPOCH2TC文中称为 "分光光度计"；依用户而定
MochiViewhttp://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads
MOPSSigma-AldrichM3183
NaClVWR470302-522
NaOHFisher ScientificS318-500
NCBI GEOhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
NEBNext Illumina 适配子为 NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1）组分；文中称为 "适配子"
NEBNext Illumina Index X 引物为 NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1）组分；文中称为 "反向唯一索引文库扩增引物"
NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1）New England BiolabsE7335S
NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒New England BiolabsE7645S文中称为 "文库制备试剂盒"
NEBNext Illumina 通用 PCR 引物为 NEBNext Illumina 多重寡核苷酸（Index Primers Set 1）组分；文中称为 "通用正向文库扩增引物"
诺尔斯霉素硫酸盐（NAT）GoldbioN-500-2
Novex TBE 凝胶，10%，15 孔Fisher ScientificEC62755BOX
旋转混合器VWR82007-202
营养肉汤CriterionC6471
pADH110Addgene90982文中称为 "质粒库 ID# 90982"
pADH119Addgene90985文中称为 "质粒库 ID# 90985"
pADH137Addgene90986文中称为 "质粒库 ID# 90986"
pADH139Addgene90987文中称为 "质粒库 ID# 90987"
pADH140Addgene90988文中称为 "质粒库 ID# 90988"
pAG-MNaseEpicypher15-1016 或 15-111650 次或 250 次反应
pCE1Addgene174434文中称为 "质粒库 ID# 174434"
带透明盖的培养皿Fisher ScientificFB0875712
Phusion 高保真 DNA 聚合酶Fisher ScientificF530S文中称为 "DNA 聚合酶"
聚乙二醇（PEG）3350VWR10791-816
磷酸二氢钾Fisher ScientificP285-500
Qubit 1x dsDNA HS 检测试剂盒InvitrogenQ33230
Qubit 荧光计Life TechnologiesQ33216文中称为 "荧光计"；依用户而定
兔 IgG 阴性对照抗体Epicypher13-0042
核糖核酸酶 A（RNase A）Sigma-Aldrich10109169001
Roche Complete 蛋白酶抑制剂（无 EDTA）片剂Sigma-Aldrich5056489001
RPMI-1640Sigma-AldrichR6504
摇床孵育器EppendorfM12820004依用户而定
山梨醇Sigma-AldrichS1876-500G
Spin-X 离心过滤管Fisher Scientific07-200-385
无菌接种环VWR30002-094
SYBR Gold 核酸凝胶染色剂Fisher ScientificS11494
SYTO 13 核酸染色剂Fisher ScientificS7575文中称为 "核酸凝胶染色剂"
PCR 仪依用户而定
ThermoMixer CEppendorf5382000023
三羟甲基氨基甲烷（Tris）Sigma-Aldrich252859-100G
Ultra II 连接预混液为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分；文中称为 "连接预混液"
Ultra II Q5 预混液为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分；文中称为 "高保真 DNA 聚合酶预混液"
UltraPure 鲑鱼精子 DNA 溶液Invitrogen15632011
USER 酶为 NEBNext Ultra II DNA 文库制备试剂盒组分；文中称为 "尿嘧啶切除酶"
涡旋混合器VWR10153-834
wget 工具http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_
chromosomes.fasta.gz
酵母提取物CriterionC7341
Zymolyase 100T（溶壁酶，酵母裂解酶）Fisher ScientificNC0439194

参考文献

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CUT And Run转录因子结合蛋白质-DNA相互作用表位标签文库构建荧光显微镜生物膜形成
全基因组范围转录因子-DNA 结合相互作用分析：一种针对Candida albicans的全面CUT&RUN方法与数据分析流程
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