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方法文章

细胞和组织离体外环境中葡萄糖摄取的间接检测方法：细胞外葡萄糖耗竭法 Ex Vivo

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DOI：

10.3791/63681

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2022年4月6日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Human Sciences, The Ohio State University

本文内容

摘要

荧光标记葡萄糖的细胞外耗竭与葡萄糖摄取相关，可用于离体器官和细胞培养中葡萄糖摄取的高通量筛选。

摘要

糖尿病在全球范围内的持续流行增加了人们对影响葡萄糖摄取的环境、营养、内分泌、遗传和表观遗传因素的识别需求。体外检测细胞对荧光标记葡萄糖（FD-葡萄糖）的摄取，或体内成像葡萄糖消耗组织，通常采用细胞内荧光测定这一广泛使用的方法。该检测方法用于评估在特定时间点的葡萄糖摄取情况。细胞内分析的前提是，FD-葡萄糖的代谢速度慢于内源性葡萄糖，后者参与分解代谢、合成代谢反应及信号传导过程。然而，动态的葡萄糖代谢也会改变葡萄糖的摄取机制，因此需要针对不同因素进行葡萄糖摄取的动力学测定。本文介绍了一种测量细胞和组织离体条件下胞外FD-葡萄糖消耗的方法，并验证了其与细胞内FD-葡萄糖摄取的相关性。胞外葡萄糖消耗方法可能适用于高通量的动力学和剂量依赖性研究，以及识别具有血糖调节活性的化合物及其组织特异性效应。

引言

随着多种依赖葡萄糖代谢的疾病呈流行性增长，对葡萄糖摄取进行测量的需求也日益增加。退行性代谢性疾病、神经与认知障碍1、炎症2和感染性疾病3、癌症4,5以及衰老6等疾病的潜在机制均依赖于葡萄糖代谢以获取能量及其储存、合成代谢过程、蛋白质和基因修饰、信号传导、基因调控以及核酸的合成与复制7,8,9。糖尿病（DM）直接与葡萄糖摄取调节功能障碍相关。DM 是一组慢性疾病谱系，包括1型、2型和3型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年发病型成人糖尿病以及其他由环境和/或遗传因素引起的糖尿病类型。2016年，世界卫生组织（WHO）首次发布的《全球糖尿病报告》显示，患有最常见类型DM的成年人数量自1980年以来几乎增长了近四倍，达到4.22亿人10，且过去几十年来DM患者人数呈指数级上升。仅在2019年，估计有150万人的死亡直接归因于DM10。这一显著增长主要归因于2型DM的增加及其驱动因素，包括超重和肥胖10。COVID-19大流行揭示出DM患者的死亡率较普通人群高出一倍，提示葡萄糖代谢在免疫防御中具有深远但尚未充分理解的作用3。预防、早期诊断和治疗DM、肥胖症及其他相关疾病，需要优化对不同组织葡萄糖摄取的测量方法，并识别影响葡萄糖摄取的环境11、营养12、内分泌13、遗传14和表观遗传15因素。

在研究中，细胞内和/或组织对葡萄糖的摄取通常通过荧光标记的葡萄糖（FD-葡萄糖）在体外in vitro16,17,18 和体内 in vivo19 进行测定。相较于使用放射性标记葡萄糖20、分析型质谱分析21、代谢组学22、核磁共振技术23 以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描（PET/CT）5,24 等更为精确的方法，FD-葡萄糖已成为更受青睐的技术。与FD-葡萄糖摄取不同，需要更多生物样本的分析方法可能涉及多步骤的样品制备、昂贵的仪器设备以及复杂的数据分析过程。在细胞培养中对FD-葡萄糖摄取进行有效且低成本的检测已被用于概念验证实验，但可能需要通过其他方法进一步验证。

FD-葡萄糖用于葡萄糖摄取研究的基础在于其相较于内源性葡萄糖代谢速率较低25。然而，内源性葡萄糖和FD-葡萄糖均会在所有细胞区室之间动态分布，参与合成代谢、分解代谢及信号传导过程。FD-葡萄糖的区室化分布及其随时间变化的代谢过程25会干扰荧光检测结果，成为该方法在高通量筛选、动力学分析、三维细胞培养、共培养以及组织外植体实验中应用的主要限制因素。本文提供的数据表明，FD-葡萄糖在细胞外的消耗量与其细胞内摄取量之间存在高度相关性，提示可通过检测细胞外FD-葡萄糖的减少来间接反映细胞内葡萄糖的摄取情况。该细胞外葡萄糖消耗的检测方法已被用于验证经胰岛素及一种实验性药物处理的小鼠在不同组织间葡萄糖摄取的差异，从而证明了该方法的可行性18。

本方案描述了在3T3-L1细胞中进行FD-葡萄糖摄取的胞内和胞外（图1）测定。方案第1-7节介绍了细胞培养与生长48小时；细胞饥饿、刺激及胞外基础水平测定；以及刺激后胞外FD-葡萄糖、胞内FD-葡萄糖和蛋白的测定。方案第8节描述了在存在或不存在胰岛素及 氨基酸化合物2（AAC2，其他文献中已有描述）的条件下，对从ob/ob小鼠分离的组织进行FD-葡萄糖胞外摄取的ex vivo测定18。

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方案

动物实验已获得俄亥俄州立大学（OSU，方案编号 2007A0262-R4）机构动物护理与使用委员会的批准。

注意：所有操作必须在II级生物安全柜中进行，且风机应保持开启，灯光关闭。

1. 材料准备

注意：所有材料均列于材料表中。

  1. 在 II 级生物安全柜中，根据表 1配制培养基 1、离心用培养基 2，以及荧光标记的 2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖（2-NBDG 或 FD-葡萄糖）的储存液和工作液。实验过程中需避光操作，可通过关闭生物安全柜内所有光源来保护 FD-葡萄糖免受光照。
  2. 使用即用型细胞培养试剂：胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS）以及无葡萄糖且无酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（下文简称无葡萄糖 DMEM）。
  3. 使用 20 mL 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液。
    ​注意：在以下部分中，将在有或无胰岛素刺激的 3T3-L1 成纤维细胞中，比较不同剂量 FD-葡萄糖的胞外耗竭与胞内摄取情况（图 2）。

2. 3T3-L1 细胞培养与维持

  1. 将3T3-L1小鼠成纤维细胞以每20 mL培养基1中稀释1 × 106个细胞的密度接种于两块96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，并在加样过程中通过混匀确保悬液均匀。将细胞置于37 °C培养箱（5% CO2、95%湿度）中培养48小时，期间不更换培养基，直至细胞融合度达到约70%–80%。
  2. 继续在相同培养基中培养细胞，使其保持融合状态并进行饥饿处理，培养时间为48小时。根据所需的饥饿分解代谢状态，可将培养时间调整为24–72小时。

3. 3T3-L1 细胞的饥饿处理

  1. 从96孔板的细胞中倾去培养基，用无菌纸巾吸去残留液体。
  2. 每孔加入100 μL PBS清洗一次，再用无菌纸巾吸去残留液体。
  3. 每孔加入100 μL无葡萄糖DMEM培养基，孵育40分钟。根据细胞类型、刺激条件和所需的饥饿程度调整孵育时间。
    ​注意：孵育时间可能需要根据季节进行优化。

4. 不同浓度荧光素标记葡萄糖溶液的制备

注意：图2中的实验检测了在有胰岛素刺激和无胰岛素刺激条件下的细胞外和细胞间介质。

  1. 每种刺激条件使用八个重复（即一个96孔板中的一整行）。因此，每种刺激条件需准备1 mL溶液（具体见表2及下文说明）。
  2. 使用一个96孔板设置八种不含胰岛素的刺激条件：分别含2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL的FD-葡萄糖，以及0 μg/mL（不含FD-葡萄糖的对照）。
  3. 使用另一个96孔板设置八种含胰岛素（终浓度为10 μg/mL）的刺激条件：分别含2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL的FD-葡萄糖，以及0 μg/mL（不含FD-葡萄糖的对照）。
  4. 为配制刺激条件，取1 μL的5 mg/mL FD-葡萄糖工作液（见表1），加入999 μL无葡萄糖DMEM培养基中，得到1 mL工作储备液（1:1000稀释，终浓度为5 μg/mL）。
    1. 使用该工作储备液，在生物安全柜避光条件下，立即在2 mL离心管中依次进行1:2000、1:5000、1:10,000、1:25,000、1:50,000和1:100,000稀释，以获得终浓度分别为2.5 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.2 μg/mL、0.1 μg/mL和0.05 μg/mL的FD-葡萄糖溶液（见表2）。
  5. 重复步骤4.4，并向上述各条件中分别加入1 μL胰岛素（10 mg/mL，终浓度）。
    ​注意：这些样品中胰岛素的终浓度为10 μg/mL = 1.7 nmol/mL。为确保充分混匀，应在加入其他溶液前先将胰岛素加入各离心管中。

5. 处理饥饿处理的3T3-L1细胞

  1. 孵育40分钟后，从96孔板的每个孔中倾倒出无葡萄糖的DMEM，并用无菌纸巾吸去残留液体。
  2. 将上述不同处理条件的溶液分别取100 μL（每孔）加入到两块96孔板中某一列的各孔中，同一处理条件的溶液分别取100 μL（每孔）加入到同一行的各孔中（共八个重复）。标记使用胰岛素和未使用胰岛素的培养板。对照孔中仅加入无葡萄糖的DMEM（n = 8）。
  3. 将培养板置于细胞培养箱中避光孵育40分钟（37 °C，5% CO2，95%湿度）。

6. 刺激后3T3-L1细胞的细胞外和细胞间测量

  1. 细胞刺激40分钟后，将两块培养板中的刺激液转移至新的96孔板中，保持相同的实验布局。
  2. 将原有含细胞的刺激96孔板中残留的溶液倾弃于无菌纸巾上。
  3. 可选步骤：用PBS洗涤细胞。移除PBS后，将残留液体倾弃于无菌纸巾上。
  4. 向每个孔中加入100 μL RIPA裂解缓冲液。可选步骤：向RIPA缓冲液中添加蛋白酶抑制剂以保护蛋白质。将含有RIPA缓冲液的培养板置于摇床上孵育30分钟。
  5. 使用酶标仪（材料表），分别在激发（Ex）485 nm和发射（Em）535 nm波长下检测荧光，首先测定含有胞外FD-葡萄糖的培养基，然后在30分钟孵育结束后测定RIPA裂解细胞的培养板（见步骤6.4）。

7. 基于蛋白质的细胞内葡萄糖摄取归一化

注意：细胞内FD-葡萄糖的摄取量取决于细胞数量。细胞裂解液中的蛋白水平与细胞数量成正比，因此可将每个孔中的细胞内FD-葡萄糖水平归一化至该孔中的细胞数量。

  1. 根据制造商说明书进行BCA蛋白测定（参见材料表）。定量每个含有RIPA裂解细胞的孔中的蛋白浓度。
  2. 使用10 μL RIPA匀浆液，在96孔板中每个样本设三个复孔，以提高蛋白浓度测定的准确性。
  3. 基于与样品在同一96孔板上分析的蛋白标准品（0、10、20、30、40、50和60 μg/mL蛋白）定量蛋白浓度。
  4. 在562 nm处测定吸光度，并根据蛋白标准品所得线性回归公式计算每个样本的蛋白浓度。
  5. 通过每个孔的荧光值/蛋白浓度对细胞内FD-葡萄糖水平进行归一化处理。细胞外FD-葡萄糖消耗量无需归一化。
  6. 可选：使用对照样本的平均基线值进行额外归一化处理（设为100%）。

8. 离体 器官中细胞外FD葡萄糖消耗量的测定

  1. 在器官解剖前，对小鼠进行促进葡萄糖代谢的化合物预处理，步骤如下。
  2. 使用9周龄的雄性Lepob小鼠（n = 11）。实验前所有小鼠均饲喂常规饲料。
  3. 将小鼠随机分为三组，进行腹腔内（i.p.）注射。
    1. 对照组Lepob小鼠注射0.1 mL无菌PBS（n = 4）。
    2. 胰岛素处理组Lepob小鼠注射含每克体重12 IU人胰岛素的无菌PBS 0.1 mL（n = 3）。
    3. AAC2处理组Lepob小鼠注射含每克体重0.1 nmol AAC2的无菌PBS 0.1 mL（n = 4）。
  4. 注射15分钟后，通过吸入5%异氟烷麻醉小鼠，并对麻醉动物进行心脏穿刺取血以放血处死26。
  5. 解剖每只小鼠的内脏附睾白色脂肪组织（200 mg）、肝脏（200 mg）和全脑。组织操作应在II级生物安全柜中进行。
  6. 在II级生物安全柜中避光条件下，用无葡萄糖DMEM配制FD-葡萄糖（0.29 mM）工作液。
  7. 使用酶标仪在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测定FD-葡萄糖工作液（0.29 mM）的荧光强度。
  8. 将收获的组织/器官置于含PBS的6孔板中孵育1分钟。每种组织或器官应在独立孔中处理。
  9. 1分钟后，将每种组织置于无菌纸巾上以吸除PBS。随后将组织/器官转移至另一6孔板中，每孔含4,000 µL无葡萄糖DMEM，孵育2分钟。
  10. 2分钟后，取出组织并转移至新的6孔板中，每孔含0.29 mM FD-葡萄糖工作溶液1 mL。将含有组织的6孔板置于37 °C、5% CO2和95%湿度条件下孵育。
  11. 在孵育0、10、20、30、40、60、90和120分钟时，从每个孔中收集100 µL FD-葡萄糖工作液，用于分析细胞外FD-葡萄糖消耗的动力学。收集前后均需震荡混匀。
  12. 将100 µL FD-葡萄糖工作液转移至96孔板中，使用酶标仪在激发波长485 nm和发射波长535 nm下测定荧光强度。
  13. 将各时间点的荧光值相对于0分钟（设为100%）进行归一化处理，以表示每只动物各器官的数据（图3）。

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结果

在3T3-L1前脂肪细胞中，检测了不同浓度FD-葡萄糖在有或无胰岛素刺激条件下细胞内摄取及细胞外葡萄糖消耗的情况（图 2）。图 2A 显示，细胞内FD-葡萄糖的摄取呈剂量依赖性增加，且在胰岛素存在时显著增强。相同细胞中细胞外FD-葡萄糖水平的相应降低如 图 2B 所示，经胰岛素刺激后，细胞外FD-葡萄糖水平显著低于未加胰岛素的样本。在有或无胰岛素的样本中，细胞内FD-葡萄糖的摄取与细胞外FD-葡萄糖的消耗呈剂量依赖性的相关关系（图 2C）。因此，细胞外FD-葡萄糖的消耗可与细胞内FD-葡萄糖摄取以相当的准确性（R2 = 0.99，P < 0.001）反映葡萄糖摄取的变化。

接下来，建立了一种实验体系，用于验证在经典及实验性葡萄糖摄取诱导剂刺激下，不同组织中细胞外FD-葡萄糖摄取在动力学研究中的应用

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讨论

在细胞培养中，细胞外FD-葡萄糖消耗量与标准化的细胞内葡萄糖摄取量的直接比较显示出高度相关性，提示细胞外FD-葡萄糖消耗可作为评估葡萄糖摄取的替代指标。细胞外FD-葡萄糖的检测可使用较宽范围的FD-葡萄糖浓度，其中0.5–2.5 μg FD-葡萄糖/mL似乎为最佳范围。与细胞内FD-葡萄糖摄取不同，细胞外FD-葡萄糖检测无需对细胞数量或蛋白浓度进行归一化处理。 细胞外FD-葡萄糖检测的预期局限性在于，活性氧诱导剂以及组织外植体中微量血液可能淬灭荧光信号，从而影响检测结果。其他影响荧光的环境因素（如光照）也应予以考虑。在使用多个组织外植体时，较长的操作时间可能损害组织活力及葡萄糖代谢，这可能是另一项限制因素。切除的组织需保持较小的尺寸范围（50–300 mg），以确保葡萄糖能够渗透至组织内部。由多名操作者同时处理组织可缩短操作时间。尽管我们未直接测量组织外植体内部的葡萄糖摄取，但既往在培养组织外植体中的累积观察表明，这些组织可在含葡萄糖的培养基中存活长达17天，但其功能会逐渐丧失33。本实验方案中，外植体的短时间孵育可实现对相对功能正常组织中葡萄糖代谢的监测。在具有复杂细胞结构的组...

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披露

作者无任何问题需要披露，且不存在利益冲突。

致谢

本项目得到了Ralph和Marian Falk医学研究催化剂奖以及Kathleen Kelly奖的支持。其他支持包括美国国家研究资源中心（UL1RR025755）和美国国家癌症研究所P30CA16058（OSUCCC）以及美国国立卫生研究院（NIH）医学研究路线图计划。本内容仅由作者负责，不代表国家研究资源中心或美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3T3-L1 小鼠成纤维细胞ATCCCL-173细胞系
96 孔板Falcon353227塑料器皿
B6.V-Lepob/J 雄性小鼠Jackson Laboratory货号 000632小鼠
BioTek Synergy H1 模块化多功能微孔板读板仪 (Fisher Scientific, US)Fisher Scientific, US B-SHT设备
牛血清Gibco/ThermoFisher161790-060细胞培养
小牛血清Gibco/ThermoFisher26010-066细胞培养
细胞培养箱FormaSeries II Water Jacket设备
饲料（小鼠/大鼠饲料，辐照处理）EnvigoTeklad LM-485饲料
二甲基亚砜 (DMSO)Sigma LifeScienceD2650-100mL试剂
杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM)Gibco/ThermoFisher 11965-092细胞培养
乙醇Sigma AldrichE7023-500mL试剂
荧光标记 2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖Sigma72987-1MG检测
无葡萄糖且无酚红的 DMEM 培养基Gibco/ThermoFisherA14430-01细胞培养
人胰岛素 10 mg/mLMilliporeSigma, 货号 91077C货号 91077C试剂
异氟烷，5%Henry ScheinNDC 11695-6776-2麻醉剂
青霉素/链霉素 (P/S)Gibco/ThermoFisher15140-122细胞培养
磷酸盐缓冲液Sigma-AldrichDA537-500 mL细胞培养
Pierce 二辛可宁酸 (BCA) 蛋白检测试剂盒ThermoFisher货号 N23225检测
放射免疫沉淀分析裂解缓冲液Santa Cruz Biotechnologysc-24948检测
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)Gibco/ThermoFisher 25300-054细胞培养

参考文献

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