荧光标记葡萄糖的细胞外耗竭与葡萄糖摄取相关，可用于离体器官和细胞培养中葡萄糖摄取的高通量筛选。
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本文内容
摘要
摘要
糖尿病在全球范围内的持续流行增加了人们对影响葡萄糖摄取的环境、营养、内分泌、遗传和表观遗传因素的识别需求。体外检测细胞对荧光标记葡萄糖（FD-葡萄糖）的摄取，或体内成像葡萄糖消耗组织，通常采用细胞内荧光测定这一广泛使用的方法。该检测方法用于评估在特定时间点的葡萄糖摄取情况。细胞内分析的前提是，FD-葡萄糖的代谢速度慢于内源性葡萄糖，后者参与分解代谢、合成代谢反应及信号传导过程。然而，动态的葡萄糖代谢也会改变葡萄糖的摄取机制，因此需要针对不同因素进行葡萄糖摄取的动力学测定。本文介绍了一种测量细胞和组织离体条件下胞外FD-葡萄糖消耗的方法，并验证了其与细胞内FD-葡萄糖摄取的相关性。胞外葡萄糖消耗方法可能适用于高通量的动力学和剂量依赖性研究，以及识别具有血糖调节活性的化合物及其组织特异性效应。
引言
随着多种依赖葡萄糖代谢的疾病呈流行性增长，对葡萄糖摄取进行测量的需求也日益增加。退行性代谢性疾病、神经与认知障碍1、炎症2和感染性疾病3、癌症4,5以及衰老6等疾病的潜在机制均依赖于葡萄糖代谢以获取能量及其储存、合成代谢过程、蛋白质和基因修饰、信号传导、基因调控以及核酸的合成与复制7,8,9。糖尿病（DM）直接与葡萄糖摄取调节功能障碍相关。DM 是一组慢性疾病谱系，包括1型、2型和3型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年发病型成人糖尿病以及其他由环境和/或遗传因素引起的糖尿病类型。2016年，世界卫生组织（WHO）首次发布的《全球糖尿病报告》显示，患有最常见类型DM的成年人数量自1980年以来几乎增长了近四倍，达到4.22亿人10，且过去几十年来DM患者人数呈指数级上升。仅在2019年，估计有150万人的死亡直接归因于DM10。这一显著增长主要归因于2型DM....
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方案
动物实验已获得俄亥俄州立大学（OSU，方案编号 2007A0262-R4）机构动物护理与使用委员会的批准。
注意：所有操作必须在II级生物安全柜中进行，且风机应保持开启，灯光关闭。
1. 材料准备
注意：所有材料均列于材料表中。
- 在 II 级生物安全柜中，根据表 1配制培养基 1、离心用培养基 2，以及荧光标记的 2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖（2-NBDG 或 FD-葡萄糖）的储存液和工作液。实验过程中需避光操作，可通过关闭生物安全柜内所有光源来保护 FD-葡萄糖免受光照。
- 使用即用型细胞培养试剂：胰蛋白酶-EDTA、磷酸盐缓冲液（PBS）以及无葡萄糖且无酚红的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（下文简称无葡萄糖 DMEM）。
- 使用 20 mL 放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液。
注意：在以下部分中，将在有或无胰岛素刺激的 3T3-L1 成纤维细胞中，比较不同剂量 FD-葡萄糖的胞外耗竭与胞内摄取情况（图 2）。
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结果
在3T3-L1前脂肪细胞中，检测了不同浓度FD-葡萄糖在有或无胰岛素刺激条件下细胞内摄取及细胞外葡萄糖消耗的情况（图 2）。图 2A 显示，细胞内FD-葡萄糖的摄取呈剂量依赖性增加，且在胰岛素存在时显著增强。相同细胞中细胞外FD-葡萄糖水平的相应降低如 图 2B 所示，经胰岛素刺激后，细胞外FD-葡萄糖水平显著低于未加胰岛素的样本。在有或无胰岛素的样本中，细胞内FD-葡萄糖的摄取与细胞外FD-葡萄糖的消耗呈剂量依赖性的相关关系（图 2C）。因此，细胞外FD-葡萄糖的消耗可与细胞内FD-葡萄糖摄取以相当的准确性（R2 = 0.99，P < 0.001）反映葡萄糖摄取的变化。
接下来，建立了一种实验体系，用于验证在经典及实验性葡萄糖摄取诱导剂刺激下，不同组织中细胞外FD-葡萄糖摄取在动力学研究中的应用
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讨论
在细胞培养中，细胞外FD-葡萄糖消耗量与标准化的细胞内葡萄糖摄取量的直接比较显示出高度相关性，提示细胞外FD-葡萄糖消耗可作为评估葡萄糖摄取的替代指标。细胞外FD-葡萄糖的检测可使用较宽范围的FD-葡萄糖浓度，其中0.5–2.5 μg FD-葡萄糖/mL似乎为最佳范围。与细胞内FD-葡萄糖摄取不同，细胞外FD-葡萄糖检测无需对细胞数量或蛋白浓度进行归一化处理。 细胞外FD-葡萄糖检测的预期局限性在于，活性氧诱导剂以及组织外植体中微量血液可能淬灭荧光信号，从而影响检测结果。其他影响荧光的环境因素（如光照）也应予以考虑。在使用多个组织外植体时，较长的操作时间可能损害组织活力及葡萄糖代谢，这可能是另一项限制因素。切除的组织需保持较小的尺寸范围（50–300 mg），以确保葡萄糖能够渗透至组织内部。由多名操作者同时处理组织可缩短操作时间。尽管我们未直接测量组织外植体内部的葡萄糖摄取，但既往在培养组织外植体中的累积观察表明，这些组织可在含葡萄糖的培养基中存活长达17天，但其功能会逐渐丧失33。本实验方案中，外植体的短时间孵育可实现对相对功能正常组织中葡萄糖代谢的监测。在具有复杂细胞结构的组.......
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披露
作者无任何问题需要披露，且不存在利益冲突。
致谢
本项目得到了Ralph和Marian Falk医学研究催化剂奖以及Kathleen Kelly奖的支持。其他支持包括美国国家研究资源中心（UL1RR025755）和美国国家癌症研究所P30CA16058（OSUCCC）以及美国国立卫生研究院（NIH）医学研究路线图计划。本内容仅由作者负责，不代表国家研究资源中心或美国国立卫生研究院的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3T3-L1 小鼠成纤维细胞 | ATCC | CL-173 | 细胞系 |
| 96 孔板 | Falcon | 353227 | 塑料器皿 |
| B6.V-Lepob/J 雄性小鼠 | Jackson Laboratory | 货号 000632 | 小鼠 |
| BioTek Synergy H1 模块化多功能微孔板读板仪 (Fisher Scientific, US) | Fisher Scientific, US | B-SHT | 设备 |
| 牛血清 | Gibco/ThermoFisher | 161790-060 | 细胞培养 |
| 小牛血清 | Gibco/ThermoFisher | 26010-066 | 细胞培养 |
| 细胞培养箱 | Forma | Series II Water Jacket | 设备 |
| 饲料（小鼠/大鼠饲料，辐照处理） | Envigo | Teklad LM-485 | 饲料 |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma LifeScience | D2650-100mL | 试剂 |
| 杜氏改良伊格尔培养基 (DMEM) | Gibco/ThermoFisher | 11965-092 | 细胞培养 |
| 乙醇 | Sigma Aldrich | E7023-500mL | 试剂 |
| 荧光标记 2-脱氧-2-[(7-硝基-2,1,3-苯并噁二唑-4-基)氨基]-D-葡萄糖 | Sigma | 72987-1MG | 检测 |
| 无葡萄糖且无酚红的 DMEM 培养基 | Gibco/ThermoFisher | A14430-01 | 细胞培养 |
| 人胰岛素 10 mg/mL | MilliporeSigma, 货号 91077C | 货号 91077C | 试剂 |
| 异氟烷，5% | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | 麻醉剂 |
| 青霉素/链霉素 (P/S) | Gibco/ThermoFisher | 15140-122 | 细胞培养 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | DA537-500 mL | 细胞培养 |
| Pierce 二辛可宁酸 (BCA) 蛋白检测试剂盒 | ThermoFisher | 货号 N23225 | 检测 |
| 放射免疫沉淀分析裂解缓冲液 | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | 检测 |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%) | Gibco/ThermoFisher | 25300-054 | 细胞培养 |
参考文献
- Kyrtata, N., Emsley, H. C. A., Sparasci, O., Parkes, L. M., Dickie, B. R. A systematic review of glucose transport alterations in Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 15, 568(2021).
- Garcia-Carbonell, R., et al.
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重印与许可
