本文介绍了一种对由血管紧张素II输注诱导高血压的小鼠进行肾交感神经消融（RDN）的实验方案。该方法可重复、操作便捷，可用于研究RDN对高血压及心脏肥厚的调控机制。
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方法文章
经血管内去肾交感神经术改善血管紧张素II输注诱导的高血压
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
近年来，大量临床试验证实了肾交感神经消融术（RDN）对血压的益处。然而，RDN在高血压调控中的机制仍不明确。因此，建立一种更简便的小鼠RDN模型显得尤为重要。本研究中，将装有血管紧张素II的渗透微型泵植入14周龄的C57BL/6小鼠体内。微型渗透泵植入一周后，采用苯酚对小鼠双侧肾动脉实施改良的RDN手术。以年龄和性别匹配、注射生理盐水的小鼠作为假手术对照组。在基线期及之后每星期测量血压，持续21天。随后采集肾动脉、腹主动脉和心脏组织，进行H&E染色和Masson染色的组织学检查。本研究建立了一种简单、实用、可重复且标准化的RDN小鼠模型，该模型能够控制高血压并减轻心脏肥厚。该技术可在不损伤肾动脉的前提下消融外周肾交感神经。与以往模型相比，改良的RDN方法更有利于高血压病理生物学和病理生理学的研究。
引言
高血压是全球主要的慢性心血管疾病。未控制的高血压可损害靶器官，导致心力衰竭、中风和慢性肾脏疾病1,2,3。在中国，高血压的患病率从1991年到2007年间从20%上升至31%。随着高血压诊断标准近期修订为130/80 mmHg，中国高血压成人患者人数可能翻倍4。高血压可通过药物控制，但约有20%的患者即使接受至少三种降压药物（包括一种利尿剂）治疗且剂量已达最大耐受剂量，仍无法控制血压，可能导致难治性高血压的发生5。
肾动脉去神经术（RDN）已被证明是治疗高血压的一种潜在方法。2009年，Krum 及其同事首次报道了使用 RDN 治疗难治性高血压的研究，发现经皮肾动脉消融可有效使患者血压持续降低6。然而，Symplicity 高血压 3（HTN-3）试验的失败阻碍了 RDN 的应用7，使 RDN 成为一种有争议的治疗方法。尽管如此，RDN 的前景尚未被排除。近期的临床试验，包括 RADIANCE-HTN SOLO、SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED 以及 SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal，已证实了 RDN 对高血压的疗效8,9,10,11,12。因此，需要开展更深入的机制研究，以探索 RDN 的作用效果。
本研究的总体目的是展示如何改进小鼠肾去神经术（RDN），以实现更简便且更稳定的手术操作。已有大量实验研究了多种RDN方法，例如血管内冷冻消融、体外超声以及在不同动物模型中局部应用化学物质或神经毒素13,14,15,16,17。利用苯酚进行化学消融所建立的RDN模型是一种成熟的实验模型，可用于研究交感神经激活在高血压发病机制中的作用。该模型通过使用棉签将10%苯酚/乙醇溶液作用于肾交感神经，造成其化学腐蚀而建立18。一方面，传统的RDN可能抑制肾交感神经活性，从而减少肾素分泌和钠重吸收，并增加肾血流量；另一方面，它还能抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统19。因此，RDN对高血压具有有益作用。然而，采用化学消融建立的RDN模型缺乏明确的消融标准和消融时间，其实验操作细节尚不清晰，且目前尚无相关技术报告。在本报告中，我们描述了一种在血管紧张素II（Ang II）诱导的C57BL/6小鼠高血压模型中，使用称量纸进行苯酚消融以建立RDN模型的手术方案。我们采用含苯酚的称量纸包裹肾动脉，并统一消融时间，有助于建立更具可重复性和可靠性的RDN模型。该实验模型旨在评估RDN对高血压的影响。
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方案
所有动物实验操作均符合《实验动物护理和使用指南》（NIH出版物第85-23号，2011年修订版）的相关伦理要求，并经复旦大学附属华山医院动物研究委员会批准。将14周龄雄性C57BL/6小鼠（28-30 g）随机分为四组：假手术组（Sham组）、假手术+Ang II组（Sham+Ang II组）、肾去神经术组（RDN组）、肾去神经术+Ang II组（RDN+Ang II组），每组n = 6。所有动物均饲养于温度控制在24 ± 1 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的特定封闭无病原环境中，可自由获取标准啮齿类动物饲料和饮水。
1. 手术区域的准备
- 使用70%乙醇对操作台进行消毒。将加热垫温度调节至37 °C。
- 确保所有手术器械在手术前已在121 °C下灭菌30分钟，或采用其他方法进行灭菌。本操作需要显微手术剪、两个精细直镊、两个精细弯镊、止血钳、无菌纱布和称量纸。
2. 血管紧张素II诱导的高血压
- 在麻醉诱导前，立即给予 C57BL/6 小鼠美洛昔康（0.5 mg/kg，皮下注射）。随后，按照先前所述方法通过戊巴比妥钠注射进行麻醉20,21。如有需要，也可使用异氟烷。通过夹趾反射阴性确认麻醉深度。
- 使用剃毛器去除背部毛发。在麻醉期间，将兽用眼膏涂抹于眼睛以防止干燥。
- 将动物置于手术台上，呈背侧卧位。用聚维酮碘擦拭剃毛区域，随后用70%乙醇擦拭三次。
- 使用无菌手术刀片，在耳后肩胛骨前方沿垂直于尾部方向做1 cm切口。
- 使用无菌止血钳在皮下皮肤下制作一个皮下隧道，形成用于植入泵的囊袋22。轻柔地将装有血管紧张素II（1,000 ng/kg/min）的渗透泵插入囊袋中。确保留有足够的自由空间，以便缝合伤口时无需牵拉皮肤。
- 使用间断的6-0薇乔缝线缝合肌肉，并使用间断的4-0尼龙缝线缝合皮肤。用聚维酮碘擦拭伤口部位。对照组动物进行相同手术，但植入等体积的生理盐水。
- 将所有手术器械放入灭菌器中处理10秒，并在每次手术之间更换无菌手套。密切监测所有小鼠，直至其完全恢复。
- 在术后第一周内每天至少两次密切观察小鼠伤口愈合情况，之后每天一次，观察内容包括红肿、肿胀和感染。若小鼠在血管紧张素II输注期间死亡，应立即进行解剖。
- 在血管紧张素II输注前（基线）及之后每周，采用尾套体积描记法23在清醒小鼠中测量血压。确保血压测量实验在安静环境中进行，温度为22 ± 2 °C，且小鼠在实验开始前已在该环境中适应1小时。在基线血压测量前，至少连续5天对小鼠进行适应性训练23,24。
3. 双侧肾去神经支配
- 在血管紧张素II（Ang II）灌注1周后，选择血压（BP）≥140/90 mmHg或收缩压/舒张压升高25%的小鼠。
- 手术前记录动物体重，并选择体重不低于24 g的小鼠进行肾去神经手术。
- 使用戊巴比妥钠麻醉小鼠，并通过脚趾夹捏反射阴性确认麻醉深度。
- 使用剃毛器去除腹部毛发。操作时应仔细彻底，以避免任何手术污染。
- 将小鼠仰卧位固定于手术台上，四肢用胶带固定。先用聚维酮碘消毒腹部皮肤，再用70%乙醇擦拭三次。
- 使用手术刀片沿腹中线做一条长约2 cm的腹正中切口。用浸有37 °C生理盐水的纱布将肠管轻轻推开，暴露左侧肾动脉。使用弯头镊子仔细且钝性分离肾动脉周围的脂肪组织。（图1A-C）。
- 使用无菌锋利剪刀将称量纸剪成与肾动脉大小相同的矩形。作为参考，可按照图1C中虚线所示尺寸进行裁剪。
注意：此步骤是手术中的关键环节，建议一次性多准备几片相同形状的称量纸，以保持一致性。 - 将称量纸浸入10%苯酚/乙醇溶液中至少30秒。将其覆盖于左侧肾动脉表面并包裹血管，保持2分钟（图1D）。使用纱布保护周围组织，防止称量纸接触周围肾脏和肠管。
注意：苯酚溶液在塑料管中稳定，但在玻璃小瓶中不稳定。因此，每次实验前必须新鲜配制18。 - 对右侧肾动脉执行相同操作。假手术组使用浸有生理盐水的称量纸进行处理。
- 将肌肉复位，并使用6-0 Vicryl缝线间断缝合腹膜。随后使用4-0尼龙缝线间断缝合皮肤。密切监测所有小鼠，直至其完全恢复。
4. 术后护理
- 在切口处涂抹聚维酮碘，并将动物置于加热的电热毯上以恢复并进行术后监测。
- 每天监测小鼠两次，评估是否存在红肿、疼痛或腹部感染。在肾去神经支配（RDN）手术前约1小时和术后24小时，为所有小鼠皮下注射美洛昔康（0.5 mg/kg）。
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结果
统计学
所有数据均以均值 ± 标准差表示。对于包含三个或更多条件的实验，采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行 Bonferroni 事后检验以比较各组之间差异。将 p 值小于或等于 0.05 视为具有统计学显著性。所有统计分析均使用商业软件完成。
肾去神经术后 Ang II 引起的血压升高受到抑制
在 Ang II 输注后 1 周，观察到收缩压（SBP）显著升高。与假手术 + Ang II 组相比，肾去神经术 + Ang II 组在术后 21 天的 SBP 显著降低（143.50 ± 5.43 vs 196.67 ± 14.26 mmHg，p < 0.01）。术后 2 周时，假手术组与肾去神经术组之间无显著差异（113.33 ± 9.35 vs 113.17 ± 8.47 mmHg，p > 0.05）（图 2）。
肾去神经术（RDN）效果及肾动脉损伤的...
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讨论
自SYMPLICITY HTN-3试验得出阴性结果以来，肾去神经支配术（RDN）是否能够降低血压一直存在争议7,25。然而，已有多个临床试验和动物实验表明，RDN对高血压患者及动物具有积极且有效的作用9,10,11,12,13,14,15,16,17。在动物实验中，苯酚被用于破坏肾神经，但既往研究中关于消融的具体细节尚不明确...
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披露
作者声明不存在任何利益冲突，无论是经济上的还是其他方面的。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81770420）、上海市科学技术委员会（20140900600）、上海老年医学临床重点实验室（13dz2260700）、上海市市级临床重点专科（shslczdzk02801）以及复旦大学附属华山医院老年冠心病中心的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 血管紧张素 II | Sangon Biotech | CAS:4474-91-3 | 用于构建高血压动物模型 |
| 酪氨酸羟化酶抗体 | Abcam | ab137869 | 用于评估肾神经中酪氨酸羟化酶（TH）的表达水平 |
| 血压分析系统 | Visitech Systems | BP-2000 | 用于测量小鼠血压 |
| 微型渗透压泵 | DURECT Corporation | CA 95014 | 用于装载血管紧张素 II |
| 去甲肾上腺素 ELISA 试剂盒 | Abcam | ab287789 | 用于测定肾脏去甲肾上腺素水平 |
| 苯酚 | Sangon Biotech | CAS:108-95-2 | 用于损毁肾交感神经 |
| 称量纸 | Sangon Biotech | F512112 | 将称量纸浸入苯酚后用于损毁肾神经；https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. |
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