从人脐带组织中生成间充质干细胞及其向骨骼肌谱系的分化

摘要

我们描述了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞并将其诱导分化为骨骼肌谱系的实验方案。

摘要

间充质干细胞治疗潜力的探索依赖于其分离的难易程度、分化能力以及来源的可靠性与稳定性。本文介绍了一种从人脐带组织中分离间充质干细胞（uMSCs）的逐步操作流程，包括其免疫表型鉴定及多代培养过程中的扩增方法。该方法无需酶消化，因此uMSCs的存活率较高。此外，通过去除包括脐动脉和脐静脉在内的血管结构，可有效避免内皮来源细胞的污染。流式细胞术分析显示，分离获得的uMSCs为CD45⁻CD34⁻，表明不存在造血谱系来源的细胞。重要的是，这些细胞表达关键的表面标志物CD105、CD90和CD73。在成功建立细胞系后，本文进一步描述了一种高效诱导uMSCs向骨骼肌谱系分化的实验方法。对分化后uMSCs的成肌过程进行详细分析发现，在分化的初始阶段，uMSCs表达成肌前体细胞标志物Pax7，随后表达MyoD和Myf5，最终表达终末分化标志物肌球蛋白重链（MyHC）。

引言

人类脐带被认为含有丰富的间充质干细胞，这些细胞因其强大的增殖和分化能力、免疫调节特性以及生成三个胚层来源细胞的潜能，目前正在被广泛探索用于再生医学治疗¹。脐带组织包含多个区室，如脐带血、脐静脉内皮下层以及华通胶（Wharton's jelly, WJ），而华通胶本身又可分为三个界限不清的区域——血管周围区、血管间区以及羊膜下层或脐带内衬（cord lining, CL）²。尽管间充质干细胞（uMSCs）可从上述各个区域分离获得，并普遍表达关键的间充质干细胞标志物，但目前尚不清楚这些区室是否含有相同的uMSC群体，或在分化潜能方面存在差异³。因此，uMSC的分离方案需要在分离方式和区域定位上更加精确，对分化潜能进行系统而严谨的表征，并最终实现对脐带不同区室来源细胞的比较分析。

在此背景下，少数研究已揭示了脐带不同部位间uMSC增殖潜能和分化潜能的差异。其中，对来自脐带外层（CL）和华通胶（WJ）区域分离的uMSC进行的比较分析显示，CL来源的uMSC具有更高的增殖潜能^3,4。另一项研究发现，在增殖实验中，WJ来源的uMSC表现优于血管周围细胞（HUCPV）⁵。在比较脐带血来源的uMSC与无血管污染的脐带组织来源uMSC时，报道了两种来源细胞在关键MSC标志物表达上的差异，以及脐带组织来源uMSC增殖速率的提高⁶。

在众多研究中，主要探讨了尿源性间充质干细胞（uMSCs）向中胚层谱系组织（如成骨、成脂和成软骨谱系）的分化潜能，但极少有研究提供关于肌源性分化的详细实验方案、后续表征方法，以及不同脐带组织区室间的比较分析。在此背景下，我们建立了一种可靠的肌肉分化方案，并观察到来源于脐带组织的uMSCs在肌源性分化能力方面优于脐带血来源的细胞⁶。本文详细描述了一步一步的操作流程，包括从完整脐带组织（去除与血管系统相关的细胞）中分离uMSCs、细胞鉴定及其向肌源性谱系分化的全过程。

方案

本研究使用脐带组织已获得干细胞研究机构委员会（IC-SCR）、转化健康科学与技术研究所机构伦理委员会（IEC-THSTI）、哈里亚纳邦古鲁格拉姆市民医院机构伦理委员会以及THSTI机构生物安全委员会的批准。人脐带组织样本采集自足月分娩时的新生儿脐带。已从受试者处获得知情书面同意。所有方法均严格按照相关指南和法规进行。

1. 从脐带组织中分离间充质干细胞

1. 在样本送达时，剪取至少 5 cm 的脐带组织，最好靠近胎盘端，并用 70% 乙醇擦拭脐带外表面进行消毒。将脐带组织依次从一个含有磷酸盐缓冲液（PBS）的 50 mL 收集管转移至另一个含有相同溶液的收集管中。在 1 小时内将标有受试者姓名的收集管置于冰上运送至实验室。
   注意：对于较大规模的研究，建议对样本进行条形码标记，以便在整个研究过程中追踪样本。重要的是，所有操作人体组织的人员均应接种完整的乙型肝炎疫苗。
2. 在实验室中，于生物安全二级（BSL-2）操作台内开启紫外灯照射 25 分钟，以对将要使用的已灭菌器械和移液器进行消毒。
3. 将脐带组织从收集管转移至一个 10 cm² 的组织培养处理培养皿中，该培养皿内含有添加了 5 g/L 葡萄糖、50 µg/mL 庆大霉素、2.5 µg/mL 两性霉素 B、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素的 PBS 溶液（示意图见 图 1）。
4. 使用手术刀沿脐带的纵轴垂直切开，得到两个半圆柱形的组织块。由于脐带存在扭转及黏液状表面，可用另一只手握持的镊子将组织固定住。
5. 此时观察脐动脉和脐静脉，并使用手术刀沿单一方向从表面刮除这些血管。再次用 PBS 冲洗脐带组织，以去除所有与组织相关的残留血液。确保刮除操作轻柔，以维持血管周围华通胶（WJ）中细胞的完整性。
6. 将每半个脐带组织切成约 0.5 cm³ 大小的碎片，并将碎片的腔面朝下放置于培养皿中。将培养皿短暂置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中孵育 10 分钟。
7. 孵育后，向含有脐带组织碎片的培养皿中加入 20 mL 培养基，培养基成分为不含 L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷的 MEM α 修改培养基，添加 15% 胎牛血清（未经热灭活）和 50 µg/mL 庆大霉素。沿培养皿壁缓慢加入培养基，避免组织外植块移位。加入过量培养基以补偿组织外植块在孵育过程中吸收的部分。
8. 孵育 3 天后，向培养物中补充新鲜培养基。操作培养皿时应确保培养物免受震动，防止外植块移动。
9. 1 周后，使用无菌镊子逐一取出组织碎片，并使用适当的生物危害袋丢弃。保留原有培养基，并加入 10 mL 新鲜生长培养基。此后每 4 天更换一次生长培养基，直至单个细胞集落达到 70% 汇合度。
   注意：细胞在培养皿中的分布可能不均匀，会出现多个独立增殖的细胞集落，需随时间推移监测其汇合情况。通常在一个月内，一个 10 cm² 培养皿可产生足够数量的细胞，可用于传代至新的培养皿。
10. 使用胰蛋白酶/EDTA 溶液（1× 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA 溶于 Hanks 平衡盐溶液 [HBSS]）消化贴壁细胞。在 25 °C 下以 470 × g 离心 5 分钟，收集细胞悬液，弃上清，将细胞沉淀重悬于生长培养基中。

2. uMSCs 的免疫表型分析与扩增

1. 当贴壁细胞达到50%-60%融合度且充分铺展后，进行免疫表型分析。不要在完全融合的培养物上进行间充质干细胞（MSC）标志物分析，因为这往往会导致关键MSC标志物的下调。
2. 消化后，将细胞悬液以1 × 10⁶ 个细胞/mL的浓度分配至FACS管中（每管1 × 10⁵ 个细胞），并联合使用适当的荧光染料标记抗体（均为1:50稀释）进行染色：未染色对照；CD105 + CD90；CD105 + CD73；CD105；CD90；CD73；CD34 + CD45（共用荧光染料）；每种荧光染料对应的同型对照。在流式细胞仪上至少记录10,000个事件用于后续分析。
   注意：由于各表面标志物分别单独检测，无需对细胞亚群进行设门。
3. 除上述标志物外，还需确认从不同脐带组织样本建立的尿源性间充质干细胞（uMSC）系中阳性与阴性表面标志物的表达情况（表1）。
4. 通过流式细胞术分析标记后的细胞，确定CD105⁺CD90⁺ 和 CD105⁺CD73⁺ 细胞的百分比，并分别分析CD105⁺ 及 CD34⁻CD45⁻ 细胞。

3. uMSCs 向骨骼肌的分化

1. 用 PBS 中含 0.01% 胶原和 20 µg/mL 层粘连蛋白的溶液包被组织培养板，在室温下包被至少 4 小时。
2. 以 10,000 个细胞/cm² 的密度将 uMSCs 接种于生长培养基中。
3. 当细胞融合度达到 70% 时，吸除生长培养基，用 PBS 洗涤细胞 2 次。向 uMSCs 中加入成肌分化培养基（M1），其成分为 DMEM + 5% 马血清 + 0.1 µM 地塞米松 + 50 µM 氢化可的松。为确定成肌分化进程的动力学，每隔一天向培养物中添加一次 M1 培养基。
4. 为确定成肌分化进程的动力学，在接种后第 2 天、第 4–5 天、第 6–7 天以及第 10–14 天分别检测 uMSCs 中 Pax7、MyoD、Myogenin 和 MyHC 的表达情况。

结果

从脐带组织中成功分离uMSCs的关键在于 >95%，远高于全脐带血的低成功率。成功分离出uMSCs后，FACS分析显示所有细胞均为CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD90⁺然而，在比较分析中，从脐带血中分离出的uMSCs表现出异质性群体，其中一部分细胞表达CD34⁺CD45⁺CD105⁺ （约15%）。此外，双阳性CD105⁺CD90⁺ 数量较少（约5%）(补充图 S1）。这导致脐带血来源的uMSCs成肌分化水平降低，因为成肌作用的诱导需要CD105和CD90的共同表达。uMSCs还表达所列的标记物 表1. 若脐带血来源的uMSCs存在污染，则也会出现CD34⁺CD45⁺ 细胞。这会导致成肌分化铺板时出现错误的细胞计数。一种表明 >90%的细胞同时表达CD105和CD90，表明uMSCs尚未定向分化为任何中胚层谱系，仍保...

讨论

关键步骤
本方案中的一个关键步骤是从组织获取到整个扩增期间，在无菌条件下进行组织采集并维持无菌培养。在采集脐带时，必须确保脐带不接触任何非无菌表面，并在将其收集至含有抗生素的 PBS 管之前，用 70% 乙醇对外表面进行擦拭。从脐带采集到组织处理以分离脐带间充质干细胞（uMSC）之间的时间应尽可能缩短。如果需要将组织从采集地点运输至实验室，必须注意将组织保存在含有抗生素的缓冲液中，并置于冰上运输。

方法的改进与故障排除
本实验方案中诱导尿源性间充质干细胞（uMSCs）成肌分化的关键改进在于使用0.01% I型胶原蛋白和20 µg/mL 层粘连蛋白包被培养皿。我们观察到，在M1培养基存在的情况下，当细胞黏附条件得到调控时，uMSCs的成肌分化进程得以增强。是否使用其他更高效但价格较高的基质（如Matrigel）可进一步优化本方案，仍有待验证。不同样本之间的产量差异可能导致某些组织获得的细胞数量较低。在此情况下，建议采集更长的脐带组织，其长度应>5 cm。有少数文献报道使用10 cm长的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Thermo Fisher Scientific	D1306
两性霉素B	Sigma Aldrich	A2411
抗生素溶液 100倍液，内毒素检测合格（每毫升含10,000 U青霉素和10 mg链霉素，溶于0.9%生理盐水）	HiMedia	A001A-50mL
抗GAPDH抗体	Sigma Aldrich	G8795
抗MyHC抗体（My32）	Novus Biologicals	NBP2-50401AF647
抗MyoD抗体（5.8A）	Novus Biologicals	NB100-56511
抗肌细胞生成素抗体（克隆F5D）	Novus Biologicals	NBP2-34616AF594
抗Pax7抗体	DSHB	DSHB-C1-576
APC标记小鼠抗人CD90克隆5E10	BD Biosciences	559869
Ⅰ型胶原蛋白	Merck	C8919
D-(+)葡萄糖	Sigma Aldrich	G7021
地塞米松	SIGMA	D4902
FACSCanto II 或 FACSAria III	BD Biosciences
胎牛血清，经鉴定，来自巴西	GIBCO	10270106	不得进行热灭活
FITC标记小鼠抗人CD106克隆51-10C9	BD Biosciences	551146
FITC标记小鼠抗人CD14克隆M5E2	BD Biosciences	557153
FITC标记小鼠抗人CD31克隆WM59	BD Biosciences	557508
FITC标记小鼠抗人CD34克隆581	BD Biosciences	555821
FITC标记小鼠抗人CD45克隆HI30	BD Biosciences	555482
FITC标记小鼠抗人CD49D克隆9F10	BD Biosciences	560840
FITC标记小鼠抗人CD90克隆5E10	BD Biosciences	555595
FITC标记小鼠抗人HLA-A,B,C克隆G46-2.6	BD Biosciences	557348
FITC标记小鼠抗人IgG克隆G18-145	BD Biosciences	555786
FlowJo软件	BD Biosciences
庆大霉素	Sigma Aldrich	G1264
马血清	HiMedia	RM1239
氢化可的松	Merck	H4001
层粘连蛋白	Merck	L2020
MEM α改良培养基，不含L-谷氨酰胺、核糖核苷和脱氧核糖核苷	Hyclone	SH30568.FS	uMSCs的基础培养基
PE标记小鼠抗人CD105克隆266	BD Biosciences	560839
PE标记小鼠抗人CD44克隆515	BD Biosciences	550989
PE标记小鼠抗人CD49E克隆llA1	BD Biosciences	555617
PE标记小鼠抗人IgG克隆G18-145	BD Biosciences	555787
PE-Cy7标记小鼠抗人CD73克隆AD2	BD Biosciences	561258
磷酸盐缓冲液（PBS），pH=7.4	HiMedia	M1866
胰蛋白酶/EDTA溶液（1×，含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的Hanks平衡盐溶液（HBSS））	HiMedia	TCL049-100mL