剪切力的集合力谱

Summary

集合力谱（EFS）是一种强大的技术，用于在生物物理和生物传感领域对一组集成的生物分子结构进行机械展开和实时传感。

Abstract

基于荧光和机械化学原理的单分子技术在生物传感中提供了卓越的灵敏度。然而，由于缺乏高通量能力，这些技术在生物物理学中的应用受到限制。集合力谱（EFS）通过将单个分子的机械化学研究转换为分子集合的机械化学研究，在研究大量分子结构方面表现出高通量。在该协议中，DNA二级结构（i-motifs）在均质机尖端的转子和定子之间的剪切流中以高达77796 / s的剪切速率展开。证明了流速和分子大小对i基序所经历的剪切力的影响。EFS技术还揭示了DNA i基序和配体之间的结合亲和力。此外，我们已经展示了一种可以通过剪切力驱动的点击化学反应（即机械点击化学）。这些结果确立了利用剪切力控制分子结构构象的有效性。

Introduction

在单分子力谱¹（SMFS）中，单个分子结构的机械性能已经通过原子力显微镜，光学镊子和磁性镊^子2，^3，4等精密仪器进行了研究。受力产生/检测装置中分子的相同方向性要求或磁镊和微型离心力显微镜（MCF^）中的小视场的限制5，⁶，⁷，^8，使用SMFS只能同时研究有限数量的分子。SMFS的低通量阻碍了其在分子识别领域的广泛应用，这需要大量分子的参与。

剪切流提供了一种潜在的解决方案，可以将力施加到大量分子^上9。在通道内的液体流动中，越靠近通道表面，流速越慢¹⁰.这种流速梯度会导致平行于边界表面的剪切应力。当分子被放置在该剪切流中时，分子重新定向，使其长轴与流动方向对齐，因为剪切力施加到长轴¹¹上。由于这种重新定向，所有相同类型（手柄的大小和长度）的分子预计将在经历相同剪切力的同时沿同一方向对齐。

这项工作描述了一种协议，使用这种剪切流对大量分子结构施加剪切力，如DNA i-motif所示。在该协议中，在均质器尖端的转子和定子之间产生剪切流。本研究发现，折叠的DNAi基序结构可以通过9724-97245 s⁻¹的剪切速率展开。此外， 在L2H2-4OTD配体和i基序之间发现了36 μM的解离常数.该值与通过凝胶移位测定^法12测量的31μM的值一致。此外，目前的技术用于展开i基序，其可以暴露螯合铜（I）以催化点击反应。因此，该协议允许人们在合理的时间（短于30分钟）内使用低成本仪器展开大量i-motif结构。鉴于剪切力技术大大提高了力谱的通量，我们将这种技术称为集成力谱（EFS）。该协议旨在提供实验指南，以促进这种基于剪切力的EFS的应用。

Protocol

注意:本协议中使用的所有缓冲液和化学试剂都列在 表材料中。

1.剪切力显微镜的制备

注意:剪切力显微镜包含两部分，反应单元（均质器）和检测单元（荧光显微镜）。目镜的放大倍率为10倍，物镜（空气）的放大倍率为4倍。

1. 将均质器和显微镜组装在安装台上。戴上护目镜并打开荧光显微镜，然后调整均质器以确保适当波长的激发光束（此处使用488nm）穿过均质器分散尖端的中心。
2. 准备一个高5厘米，横截面为1.5^厘米2 x 1.5厘米² 的平底反应室。为了减少背景，请确保所选的腔室材料不会发出荧光，例如玻璃（某些塑料具有荧光）。
3. 选择合适的均质机分散尖端，以提供所需的剪切力。
   注意:剪切速率取决于转子和定子在固定转速^{下的距离 11} ，根据以下公式:
   
   其中μ是水在20°C时的动态粘度;D是定子的内径;d是转子的外径，V是剪切速度（rpm/s）。
4. 将反应室夹在荧光显微镜的样品台上，然后调整反应室以保持均质器的分散尖端（图1）。确保分散尖端略高于（~1毫米）反应室的底面。
5. 一起调整均质器和腔室的垂直位置，以确保显微镜的焦点在分散尖端的表面上。然后，调整分散头的水平位置，以确保在转子和定子之间设置检测区域（视场）（图1）。
6. 根据实验中使用的荧光染料打开荧光通道。
7. 在高速剪切实验之前，使用去离子（DI）水以低剪切速度（例如，2，000 rpm）测试剪切，以确保分散尖端可以在不接触反应室的情况下正常工作。

2. 展开有配体和不带配体的 i 基序

1. 如Hu等人¹¹中所述，制备人端粒i基序DNA（材料表），分别在其两端用染料和淬灭剂标记。
   注:包含序列的 i-motif:5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA。
2. 在pH 5.5或pH 7.4的30 mM MES缓冲液中将DNA稀释至5μM。向DNA溶液中加入配体L2H2-4OTD，该配体是根据Abraham Punnoose等人¹³合成的，浓度范围为0-60μM。 轻轻混合溶液10分钟，在没有光的情况下折叠i-motif结构。
3. 使用荧光显微镜检查并最小化充满去离子去离子水的反应室的背景荧光强度，而无需剪切。最小化背景荧光的一种简单方法是用去离子水清洗反应室。背景荧光值需要在以后的数据分析中减去。
   注意:从此步骤开始，应避免杂散光。
4. 使用软件设置CCD相机的参数。推荐参数如下:曝光时间= 0.5 s，CCD感光度= 1600，记录时间= 20分钟。
5. 使用长移液管，将DNA溶液加入空且干净的反应室中。用黑匣子盖住反应室。然后，启动均质机以9，724 s⁻¹ 至97，245 ^s-1 （使用与均质机关联的软件选择）的选定剪切速率进行剪切20分钟，同时打开CCD相机以记录数据。
6. 实验结束后，取出腔室并用去离子水清洗。

3. 剪切力驱动的点击反应

1. 在去离子水中制备i-motif DNA。将 10 μM i-motif DNA 在 300 μL 30 mM Tris 缓冲液 （pH 7.4） 中孵育 10 μM i-motif DNA，补充有 150 μM CuCl 和 300 μM 抗坏血酸 10 分钟以折叠 i-motif 结构（所有浓度均为溶液中的最终浓度）。
   注意:CuCl是点击反应的催化剂。抗坏血酸将防止铜（I）氧化。
2. 用超滤装置以14，300× g的离心力超滤液。每次过滤后，用补充有300μM抗坏血酸的30mM Tris缓冲液（pH 7.4）将溶液补充至~500μL。
3. 重复过滤3次。
4. 收集残留溶液，并通过添加补充有 300 μM 抗坏血酸的 30 mM Tris （pH 7.4） 以及 20 μM Calfluor 488 叠氮化物、20 μM HPG 和 10 μM TBTA 来制备 300 μL 的最终体积。添加试剂后，将溶液移至暗室。
   注意:此步骤后应避免光线。
5. 在剪切实验之前，使用显微镜检查并最小化充满去离子水的反应室的背景荧光强度。最小化背景荧光的一种简单方法是用去离子水清洗反应室。
6. 用长移液管将DNA溶液加入空的反应室中，然后在打开CCD相机的情况下以63，209 s⁻¹ 的剪切速率启动均质器剪切20分钟。
7. 实验结束后，取出腔室并用去离子水清洗。

Results

图 1 概述了 EFS 中集成分子的机械展开和实时传感。在图1B中，观察到i-motif DNA的荧光强度随着pH 5.5 MES缓冲液中9，724 s−1至97，245 s⁻¹的剪切速率而增加。作为对照，当在pH 7.4 MES缓冲液中以63，209 s⁻¹的速率剪切相同的i-motif DNA时，荧光强度没有增加。这是因为 i 基序在 pH 7.4¹⁴ 时不会折叠。在前面的工作中，我们发现剪切速率越高，i-motif¹¹的展开越多。基于光学镊子¹¹中i基序的展开，我们校准了剪切力与剪切速率的关系，如图1C所示，其中描述了在77，796 s−1的剪切速率下，可以对FRET对标记的i基序施加高达⁴¹...

Discussion

本手稿中描述的方案允许实时研究通过剪切力展开一组生物分子结构的集合。这里给出的结果强调了DNA i基序结构可以通过剪切力展开。配体结合的i基序的展开和剪切力驱动的点击反应是该集合力谱方法的概念验证应用。

图1 显示了仪器设置。均质机发生器尖端和反应室不得相互接触，这对于允许转子和定子之间的稳定剪切流而不会形成气泡至关重要。对于商用均质机尖端，最好选择带有气孔的吸头，以减少气泡形成。此外，反应室的尺寸不应太大，因为大室需要更多的样品溶液。相反，需要一定高度的剪切室来覆盖均质机尖端的主体。为了减少系统误差，建议在设置中保持相同的对齐方式，以进行所有相关实验。重要的是要指出DNA保持完整性，正如剪切后的凝胶电泳所证明的那样¹¹。

从图1B可以看出，饱和荧光随着剪切速率范围从9724 s⁻¹到97245 ^s-1而增加。绘制平台...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3K MWCO Amicon	Millipore Sigma	ufc900324
抗坏血酸	VWR	VWRC0143-100G
Calfluor 488 叠氮化物	点击化学工具	1369-1
CuCl	热
分散针		PT-DA07/2EC-B101
DNA寡核苷酸	IDT
染料	IDT	/ 5Cy5/
荧光显微镜	日本日本	尼康TE2000-U
均质器	瑞士	PT 3100D
HPG	圣克鲁斯生物技术	cs-295271
KCl	VWR	VWRC26760.295
制造执行系统	VWR	VWRCE169-500G
淬火机	IDT	/3IAbRQSp/
TBTA	东京化学工业	T2993
Tris	VWR	VWRCE133-100G