集成力谱技术（EFS）是一种在生物物理和生物传感领域中用于机械解折叠及实时检测一组生物分子结构的可靠技术。
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摘要
摘要
基于荧光和力化学原理的单分子技术在生物传感中具有优异的灵敏度。然而，由于缺乏高通量能力，这些技术在生物物理学中的应用受到限制。集合力谱技术（EFS）通过将单个分子的力化学研究转化为分子集合体的研究，已在大规模分子结构分析中展现出高通量优势。在本实验方案中，DNA二级结构（i-型基序）在匀浆探头转子与定子之间的剪切流中展开，剪切速率高达77796/s。实验展示了流速和分子尺寸对i-型基序所受剪切力的影响。该EFS技术还揭示了DNA i-型基序与配体之间的结合亲和力。此外，我们演示了一种可由剪切力触发的点击化学反应（即力化学驱动的点击化学）。这些结果证实了利用剪切力调控分子结构构象的有效性。
引言
在单分子力谱技术1（SMFS）中，研究人员利用原子力显微镜、光镊和磁镊等精密仪器研究单个分子结构的力学特性2,3,4。由于力产生/检测装置中分子取向需保持一致，或受限于磁镊和微型离心力显微镜（MCF）的视场较小5,6,7,8，SMFS 通常只能同时检测有限数量的分子。SMFS 通量较低，限制了其在分子识别领域的广泛应用，而该领域往往需要大量分子参与。
剪切流为对大量分子施加作用力提供了一种潜在的解决方案9。在通道内的液体流动中，越靠近通道表面，流速越慢10。这种流速梯度会产生平行于边界表面的剪切应力。当一个分子处于这种剪切流中时，它会重新取向，使其长轴与流动方向一致，因为剪切力作用于分子的长轴上11。由于这种重新取向，所有相同类型（手柄尺寸和长度相同）的分子预期将在经历相同剪切力的同时沿同一方向排列。
本研究描述了一种利用剪切流对大量分子结构施加剪切力的实验方案，以DNA i-型基序（i-motif）为例进行说明。在该方案中，剪切流由均质器探头的转子与定子之间产生。本研究发现，折叠态的DNA i-型基序结构可在9724–97245 s−1的剪切速率下发生解折叠。此外，L2H2-4OTD配体与i-型基序之间的解离常数为36 µM，该数值与凝胶迁移实验测得的31 µM结果一致12。进一步地，当前技术可用于解折叠i-型基序，从而暴露螯合的一价铜离子，以催化点击化学反应。因此，该方案使得研究者能够使用低成本仪器在合理时间内（短于30分钟）解折叠大量i-型基序结构。鉴于剪切力技术显著提高了力谱分析的通量，我们将该技术命名为集合力谱法（ensemble force spectroscopy, EFS）。本方案旨在提供实验操作指南，以促进基于剪切力的EFS技术的应用。
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方案
注意：本方案中使用的所有缓冲液和化学试剂均列于材料表中。
1. 剪切力显微镜的准备
注意：剪切力显微镜包含两个部分，即反应单元（匀浆器）和检测单元（荧光显微镜）。目镜的放大倍数为10倍，物镜（空气）的放大倍数为4倍。
- 将匀浆器和显微镜组装在安装台上。佩戴护目镜并打开荧光显微镜，然后调节匀浆器，确保适当波长的激发光束（此处使用488 nm）穿过匀浆器分散头的中心。
- 准备一个高度为5 cm、横截面为1.5 cm2 × 1.5 cm2的平底反应室。为降低背景信号，应确保所选反应室材料无荧光性，例如玻璃（某些塑料具有荧光性）。
- 选择合适的匀浆器分散头，以提供所需的剪切力。
注意：根据以下公式，在固定转速下，剪切速率取决于转子与定子之间的距离11：
其中 µ 为20 °C时水的动力黏度；D 为定子内径；d 为转子外径，V 为剪切速度（rpm/s）。 - 将反应室夹持在荧光显微镜的样品台上，然后调整反应室位置以固定匀浆器的分散头（图1）。确保分散头略高于反应室底部表面（约1 mm）。
- 同时调节匀浆器和反应室的垂直位置，使显微镜的焦平面位于分散头表面。然后调节分散头的水平位置，确保检测区域（视野）位于转子与定子之间（图1）。
- 根据实验中使用的荧光染料，开启相应的荧光通道。
- 在高速剪切实验前，使用去离子水（DI水）以较低剪切速度（例如2,000 rpm）进行剪切测试，确保分散头能正常工作且不接触反应室。
2. 在有无配体条件下展开i-型基序
- 按照 Hu 等人11所述方法，在去离子水中配制一端标记荧光染料、另一端标记淬灭剂的人类端粒 i-小沟 DNA（材料表）。
注意：含 i-小沟结构的序列：5'-TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA CCC TAA。 - 将 DNA 稀释至 30 mM MES 缓冲液中，终浓度为 5 µM，缓冲液 pH 为 5.5 或 7.4。向 DNA 溶液中加入配体 L2H2-4OTD（其合成方法见 Abraham Punnoose 等人13），终浓度范围为 0–60 µM。避光条件下轻轻混匀，孵育 10 分钟，使 i-小沟结构形成。
- 使用荧光显微镜（不施加剪切力）检测并尽量降低装有去离子水的反应腔室的背景荧光强度。降低背景荧光的一个简便方法是用去离子水清洗反应腔室。后续数据分析中需扣除背景荧光值。
注意：从本步骤开始应避免杂散光干扰。 - 通过软件设置 CCD 相机参数。推荐参数如下：曝光时间 = 0.5 s，CCD 灵敏度 = 1600，记录时间 = 20 min。
- 使用长移液管将 DNA 溶液加入空的、洁净的反应腔室中。用黑色盒子覆盖反应腔室。随后启动均质器，在选定的剪切速率（9,724 s−1 至 97,245 s−1，通过均质器配套软件设定）下进行 20 分钟剪切，同时开启 CCD 相机记录数据。
- 实验结束后，取出腔室并用去离子水清洗。
3. 剪切力驱动的点击反应
- 在去离子水中配制 i-motif DNA。将 10 µM 的 i-motif DNA 加入 300 µL 含 150 µM CuCl 和 300 µM 抗坏血酸的 30 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）中，孵育 10 分钟，以折叠形成 i-motif 结构（所有浓度均为溶液中的终浓度）。
注意：CuCl 是点击反应的催化剂。抗坏血酸可防止铜（I）被氧化。 - 使用超滤装置在 14,300 × g 的离心力下对溶液进行超滤。每次过滤后，用含 300 µM 抗坏血酸的 30 mM Tris 缓冲液（pH 7.4）将溶液体积补至约 500 µL。
- 重复过滤 3 次。
- 收集残留溶液，加入含 300 µM 抗坏血酸的 30 mM Tris 缓冲液（pH 7.4），调节终体积为 300 µL，并加入 20 µM Calfluor 488 叠氮、20 µM HPG 和 10 µM TBTA。添加试剂后立即将溶液转移至暗室。
注意：此步骤之后应避免光照。 - 在剪切实验开始前，使用显微镜检测并尽量降低装有去离子水的反应室的背景荧光强度。降低背景荧光的一个简便方法是用去离子水清洗反应室。
- 用长移液管将 DNA 溶液加入空的反应室中，然后开启 CCD 相机，在剪切速率为 63,209 s−1 的条件下启动匀浆器剪切，持续 20 分钟。
- 实验结束后，取出反应室并用去离子水清洗。
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结果
图1 概述了在EFS中对分子集合进行机械解折叠和实时传感的方法。 图1B，i-motif DNA 的荧光强度随剪切速率在 9,724 s 范围内增加而增强−1 至 97,245 秒−1 在pH 5.5的MES缓冲液中。作为对照，当相同的i-型DNA以63,209 s⁻¹的剪切速率处理时，荧光强度未见增加。−1 在pH 7.4的MES缓冲液中。这是因为在pH 7.4条件下，i-基序结构不会折叠14在之前的研究中，我们发现剪切速率越高，i-折叠结构的展开程度越大11基于光镊中i-模体的解折叠11，我们校准了剪切力与剪切速率的关系，如图所示 图1C，表明在77,796 s⁻¹的剪切速率下，可对FRET标记的i-motif施加高...
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讨论
本论文所述方案可实时研究由剪切力引起的生物分子结构集合的解折叠过程。本文展示的结果强调，DNA i-微小结构可被剪切力解折叠。配体结合的i-微小结构的解折叠以及剪切力驱动的点击反应，是该集合力谱方法的概念验证应用。
图1展示了仪器的设置。匀浆器的转子头与反应室之间不得接触，这是确保转子与定子之间形成稳定剪切流且不产生气泡的关键。对于商用匀浆器转子头，建议选择带有通气孔的型号，以减少气泡的产生。此外，反应室的尺寸不宜过大，因为过大的腔体需要更多的样品溶液。相反，剪切室应具备一定的高度，以完全覆盖匀浆器转子头的主体部分。为减少系统误差，建议在所有相关实验中保持装置的相同对齐方式。需要特别指出的是，DNA在剪切后仍保持完整性，这一点已通过剪切后的凝胶电泳结果得到证实11。
从图1B可见，饱和荧光强度随着剪切速率从9724 s−1增加到97245 ...
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致谢
本研究工作由美国国家科学基金会 [CBET-1904921] 和美国国立卫生研究院 [NIH R01CA236350] 资助，资助对象为 H. M.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| 抗坏血酸 | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 叠氮化物 | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| 分散头 | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA 寡核苷酸 | IDT | ||
| 染料 | IDT | /5Cy5/ | |
| 荧光显微镜 | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| 匀浆器 | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| 淬灭剂 | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
参考文献
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: Optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
- Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6190-6195 (2006).
- Grandbois, M., Beyer, M., Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. How strong is a covalent bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
- Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Croquette, V. Behavior of supercoiled DNA. Biophysical Journal. 74 (4), 2016-2028 (1998).
- Yang, D., Ward, A., Halvorsen, K., Wong, W. P. Multiplexed single-molecule force spectroscopy using a centrifuge. Nature Communications. 7, 11026(2016).
- Su, H., et al. Light-responsive polymer particles as force clamps for the mechanical unfolding of target molecules. Nano Letters. 18 (4), 2630-2636 (2018).
- Kirkness, M. W. H., Forde, N. R. Single-molecule assay for proteolytic susceptibility: Force-induced collagen destabilization. Biophysical Journal. 114 (3), 570-576 (2018).
- Astumian, R. D. Thermodynamics and kinetics of molecular motors. Biophysical Journal. 98 (11), 2401-2409 (2010).
- Bekard, I. B., Asimakis, P., Bertolini, J., Dunstan, D. E. The effects of shear flow on protein structure and function. Biopolymers. 95 (11), 733-745 (2011).
- Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2017).
- Hu, C., Jonchhe, S., Pokhrel, P., Karna, D., Mao, H. Mechanical unfolding of ensemble biomolecular structures by shear force. Chemical Science. 12 (30), 10159-10164 (2021).
- Sedghi Masoud, S., et al. Analysis of interactions between telomeric i-motif DNA and a cyclic tetraoxazole compound. ChemBioChem. 19 (21), 2268-2272 (2018).
- Abraham Punnoose, J., et al. Adaptive and specific recognition of telomeric G-quadruplexes via polyvalency induced unstacking of binding units. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7476-7484 (2017).
- Dhakal, S., et al. Coexistence of an ILPR i-motif and a partially folded structure with comparable mechanical stability revealed at the single-molecule level. Journal of the American Chemical Society. 132 (26), 8991-8997 (2010).
- Hu, C., Tahir, R., Mao, H. Single-molecule mechanochemical sensing. Accounts of Chemical Research. 55 (9), 1214-1225 (2022).
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