高分辨率测量果蝇幼虫的嗅觉驱动行为

摘要

在本视频文章中，我们介绍了一种构建具有稳定且可控几何形状的气味梯度的新方法。我们简要说明了如何利用这些梯度来筛查嗅觉缺陷（完全性与部分性嗅觉丧失），并研究趋化行为中更为细微的特征。

摘要

果蝇幼虫的嗅觉反应传统上是在培养皿中进行研究，其中仅包含一个位于边缘的气味源。在这种行为范式中，实验者通常假设气味分子从源头快速扩散，进而在培养皿内形成稳定的浓度梯度。为了建立感觉输入与行为反应之间的定量关联，有必要对气味刺激条件进行更精确的表征。在本视频文章中，我们描述了一种新方法，可构建具有稳定且可控几何形态的气味梯度。我们简要展示了如何利用这些梯度筛选嗅觉缺陷（完全与部分失嗅），并研究趋化行为中更为细微的特征。 关键词：果蝇幼虫，嗅觉反应，气味梯度，趋化行为，失嗅，感觉输入，行为范式

方案

1. 仪器与试剂

气味稀释：

• 石蜡油（Sigma，CAS号：8012-95-1）
• 尽可能高纯度的、可引诱黑腹果蝇幼虫的气味物质¹。本视频文章中，使用乙酸异戊酯（Sigma，CAS号：123-92-2）对动物进行测试。
• 1.5 ml 带聚四氟乙烯盖的玻璃小瓶（Agilent Technologies）
• 数字电子天平，用于按重量精确配制稀释液

检测区域设置：

• 琼脂糖（Promega）
• 96孔微孔板盖（BD Falcon，目录号：353071）。我们的行为实验区域由三个堆叠的盖子组成。
• 单通道1-20 μl移液器或多通道移液器，用于将气味液滴加样至堆叠盖子的顶部盖子中。在建立多源检测实验时，我们使用Rainin公司的5-50 μl Pipet-Lite多通道移液器。

行为实验用果蝇幼虫的制备：

• 15% (w/w) 蔗糖溶液
• 普通培养皿（BD Falcon），用于清洗和储存幼虫
• 毛刷（4-5 mm 刷毛长度），用于操作和转移幼虫

幼虫运动的记录：

• 带有扁平头部的小型针，用于将幼虫转移至实验区域
• 镊子或画笔，用于记录后移除幼虫
• 配备均匀且不产热光源的照明平台，由Logan Electric公司生产的“Slim Edge”照明板
• 用于包围行为实验区域并控制光照条件的遮光柜
• 用于记录动物运动的视频追踪系统。我们使用的是Noldus（荷兰）公司的Ethovision软件
• CCD摄像机及与Ethovision软件配套购买的帧捕获视频卡（EureCard Piccolo Basic）
• 温度计和湿度记录仪，用于监测行为测试期间的大气环境条件（可选）
• Matlab（The Mathworks）用于自定义数据分析（可选）

2. 行为实验装置

行为实验装置由三个堆叠的96孔板盖组成。底部的孔板盖用于将系统其余部分与光源垫隔离，并减少实验区域内的对流。第二个孔板盖上覆盖有25 ml的3%琼脂糖凝胶，作为幼虫爬行的平台。顶部的孔板盖则用于承载气味液滴，这些液滴依靠表面张力保持悬浮状态。

将气味液滴直接用移液器加入96孔板盖的孔中。可使用单一或多种气味源，以生成具有明确且可验证分布特征的浓度梯度²。为检测幼虫的嗅觉缺失和趋化缺陷，我们建议采用以下两种检测方法。

2.1. 单一气味源实验：在孔#E7中放置一个单一气味液滴（标准96孔板参考系统）。

• 刺激物：10μl 溶于石蜡油中的气味物质
• 初始条件：将一条幼虫置于气味源下方（或其附近区域）
• 基本观察现象：对于具有吸引力的刺激物（例如乙酸异戊酯），野生型幼虫会聚集在气味源下方；而无嗅觉能力的个体或嗅觉功能受损的个体则会迅速离开液滴区域
• 单次实验持续时间：3 分钟。记录特定个体的运动轨迹，直至实验时间结束，或该个体一旦接触培养皿壁即终止记录
• 行为量化可能采用的指标：个体在以气味源为中心的小型圆形区域中停留的时间百分比；与气味源的平均距离；与气味源距离随时间的变化过程等

该检测方法可有效检测突变型幼虫的基本嗅觉缺失。也可用于可靠地确定特定气味的检测阈值²。

2.2. 多气味源实验

在顶盖的孔中放置多个气味液滴。在本视频文章中，我们在中央行E建立浓度梯度。总共在孔#E2、#E4、#E6、#E8、#E10和#E12中加入六个液滴（采用标准96孔板编号系统）。与培养皿和单一气味源实验相比，多气味源实验能够对在实验区域长度和宽度方向上形成的梯度几何形状进行定性控制。该实验方法已被用于表征果蝇幼虫趋化性²的感知机制。

• 刺激：将10μl气味液滴沿一行交替地置于各孔中。这种排列方式会在选定的行中心形成一个浓度梯度。为了在实验区域宽度方向上建立均匀的梯度，可使用多个气味源加载若干行。
• 初始条件：将单个幼虫放置于#E3和#E4孔之间的气味源下方。
• 基本表型：嗅觉缺失的幼虫从起点开始随机游走。对于具有吸引力的刺激物（例如乙酸异戊酯），具备嗅觉能力的个体将沿气味浓度升高的方向移动。动物沿气味轨迹上行的准确性与其感知和处理气味刺激的能力相关。迂回曲折的运动路径通常由感觉缺陷引起。当动物到达试验中最高浓度位置后，会停留在该区域附近。
• 单次试验持续时间：最长3分钟（更长的追踪时间容易引入噪声，因为幼虫会逐渐失去兴趣并最终离开梯度区域）。对于本视频文章中所示的梯度，对单个幼虫的运动记录持续至其到达最高浓度源附近（#E12孔）为止。一旦动物进入目标区域或接触实验区域的任一壁面，即停止记录。
• 行为量化可能采用的指标：动物停留在气味源直线区域下方的时间百分比（蓝色矩形区域）；相对于局部气味梯度方向的平均行进方向；综合趋化性评分，用于衡量动物沿气味源直线移动的整体趋势²。

3. 梯度曲线验证

在对幼虫进行特定梯度测试之前，确定该梯度随时间的稳定性至关重要。基于此，实验人员可确定每次试验的合适持续时间，以及在同一实验区域内可依次追踪的幼虫数量。为检测梯度的稳定性，我们开发了一种基于红外光谱法²的方法。该方法超出本实验方案的范围，此处不再详述。

4. 实验准备方案

4.1. 琼脂糖平板和气味稀释液的制备：

1. 1. 将25 ml的3%琼脂糖倒入96孔板盖的平坦顶部；让琼脂糖冷却并凝固（约30分钟）。
   
   重要提示：在倾倒琼脂糖之前，确保96孔板盖放置在平坦的表面上，因为凝固后的琼脂糖凝胶若存在倾斜可能会影响幼虫的行为。倾倒凝胶时，应去除表面形成的任何气泡。
   
   
2. 2. 使用电子天平将气味物质用石蜡油稀释至所需浓度，以准确称量每次稀释中石蜡油和气味物质的用量。

注意事项：当使用低气味浓度时，建议基于连续稀释制备一系列原液浓度。例如，从 1.0 M 溶液开始，进行 1:2 稀释得到 0.5 M 溶液。通过反复进行此操作，可获得符合几何级数的稀释系列：1.0 M、0.5 M、0.25 M、0.12 M、0.06 M、0.03 M、0.015 M。

重要提示：由于许多有机气味物质会与塑料发生反应，气味稀释液必须储存在带有聚四氟乙烯（Teflon）盖的玻璃小瓶中。理想情况下，应在每次实验前新鲜配制气味溶液，以减少不同实验间实际气味浓度的波动。使用高挥发性化学品时尤其如此。

4.2. 幼虫制备：

1. 1. 用蒸馏水配制15%蔗糖溶液。
   
   注意事项：15%蔗糖溶液的密度高于幼虫，可使幼虫浮至溶液表面。然而，未溶解的果蝇食物碎块密度大于该溶液，会迅速沉入底部。因此，使用该蔗糖溶液可有效分离幼虫与食物。蔗糖溶液易滋生生物污染物，若溶液变浑浊，可通过滤膜除菌以去除污染。
   
   
2. 获取装有6日龄幼虫或目标发育阶段幼虫的试管。
   
   注意事项：我们所有的实验均使用6日龄幼虫（三龄发育阶段中期）；此发育阶段的幼虫体型足够大，便于我们的追踪软件检测，同时活动性较强。
   
   
3. 将蔗糖溶液倒入含有幼虫的食物试管中。
4. 使用刮铲轻轻捣碎并溶解果蝇食物，以释放幼虫。释放出的幼虫将上浮至表面。
5. 静置数分钟，待果蝇食物碎块沉入试管底部；随后将蔗糖溶液和幼虫倒入培养皿中。若需预先筛选幼虫，可通过滤膜过滤收集幼虫。然后可用毛笔将幼虫转移至培养皿中进行挑选。
6. 在进行行为学测试前，将幼虫置于蔗糖溶液中约30分钟，使其适应溶液环境。由于幼虫似乎不摄食蔗糖，将处于饥饿状态，从而提高趋化行为表现。
7. 行为学实验结束后，可将培养皿盖内盛水（或蔗糖溶液），作为废弃实验动物的暂存容器。

5. 行为记录实验方案

5.1. 实验区域设置：

1. 1. 将气味液滴施加到新的96孔板盖的底面（带孔面）。
   
   重要提示： 为避免不同气味及气味浓度之间的交叉污染，每次加样均须使用新的盖子。实验结束后，所有含有气味源的盖子均不重复使用。根据所使用的气味浓度范围，在封闭系统中，气味梯度仅能稳定维持10至20分钟。因此，必须尽量缩短梯度建立与行为实验正式开始之间的时间间隔。
   
   
2. 将盖子翻转，并叠放在另一个已涂布3%琼脂糖层的盖子上方。
   
   重要提示： 翻转盖子时应小心操作，防止气味液滴扩散至相邻孔中。
   
   
3. 当顶部盖子翻转接触琼脂糖表面后，使气味扩散30秒，再引入幼虫。

5.2. 加载幼虫：

1. 将含有气味液滴的顶盖轻轻抬起至足以放入幼虫的高度。
2. 将幼虫从蔗糖溶液转移至琼脂糖层。动物的起始位置取决于所使用的检测方法：
   
   在单气味源检测中，幼虫被释放于气味液滴正下方。
   
   在多气味源检测中，幼虫被释放于孔位 #E3 与 #E4 之间。
   
   重要提示：新引入的动物应保持一致的朝向。我们将动物朝向梯度方向放置，确保其身体和头部朝向最高浓度区域。若动物以与浓度梯度相反的方向引入，则会启动搜寻行为。我们认为，这一初始搜寻阶段会带来不必要的噪声。控制头部朝向可减少在探索行为期间接触实验区域侧壁的幼虫数量。该操作不会预先决定动物的运动方向，也不会显著增加无嗅觉能力的动物偶然沿气味线进行趋化运动的几率（即嗅觉测试中的假阳性结果）。
   
   
3. 重新盖上顶盖，并立即开始记录。
   
   备注：健康的幼虫在进入实验区域后会立即开始爬行，通常在前10秒内可移动约1 cm。若实验人员启动记录较慢，则会丢失初始数据点。因此，建议实验人员在开展实验前熟练掌握用于启动记录的软件操作命令。
   
   
4. 让幼虫在记录期间自由活动（通常为3分钟）。
   
   备注：若幼虫在3分钟结束前撞击实验区域侧壁或到达目标区域（如在梯度检测中），则提前终止记录。
   
5. 记录结束后，立即抬起顶盖，用镊子或画笔移除幼虫。将已追踪的动物置于含有水（或蔗糖溶液）的培养皿盖中。
   
   重要提示：已记录的幼虫不得重复使用。盛水的培养皿盖仅用于在实验过程中方便地区分已记录与未记录的幼虫。
   
6. 若在同一实验装置中连续追踪多个幼虫，应立即加载下一只幼虫并按上述方法开始记录。
   
   重要提示：在同一实验装置中进行的试验次数应基于浓度梯度的稳定性来确定，且应在开展任何行为实验前验证梯度的稳定性²。
   
7. 当所有计划在该实验装置中检测的幼虫均完成追踪并移出实验区域后，丢弃顶盖和琼脂糖层。中间盖板（即琼脂糖盖板）可重复使用。
   
   备注：建议使用 Ethovision 的用户选择“背景减除”检测方法。

6. 视频文章中展示的示例实验

6.1. 使用 1.0 M 乙酸异戊酯进行单一气味源实验。

我们对十只 Or83b-/- 突变体和十只野生型（W1118）幼虫进行了盲法测试，每只幼虫均被分配了一个编号。进行轨迹记录的实验人员未获得任何关于每只动物基因型的信息。每次记录后，根据测试结果为每只幼虫指定一个预测表型：若在整个实验过程中观察到个体在气味源下方聚集，则归类为“嗅觉正常者”；若其运动轨迹迅速离开气味源周围区域，则归类为“无嗅觉反应者”。在记录完20只幼虫的行为后，将轨迹按表型进行分组，并将该分组结果与幼虫的实际基因型进行比对，发现所有表型指派均完全正确。

6.2. 利用乙酸异戊酯的指数梯度和线性梯度进行多气味源实验。

在本实验中，我们比较了野生型幼虫在直线梯度和指数梯度中趋化行为的表现。两种梯度均使用相同的最高浓度（0.5 M）建立，记录其趋化行为。如文章所述，指数梯度的气味源浓度范围为 0.015 至 0.5 M，而直线梯度的气味源浓度范围为 0.25 至 0.5 M（公差为 0.05 M 的等差数列）。

线性梯度代表了一种更具挑战性的趋化环境，因为其局部浓度差异恒定且相对较小，浓度范围较窄（0.25 M）。相比之下，指数梯度的浓度范围更大，且沿着路径的局部浓度差异逐渐增加。

每种梯度几何形状下记录了15条幼虫的运动轨迹，并将路径叠加在同一张图中。对两张图的直观观察显示，野生型幼虫能够稳定地沿梯度向上移动，但在线性梯度条件下蜿蜒程度更大。这表明，相比于线性形状，指数形状的梯度信号在沿梯度长度方向上能被更可靠地检测到。

6.3. 采用“屋顶”几何结构的乙酸异戊酯浓度梯度多气味源实验。

在此，我们验证了幼虫在气味梯度中对局部气味浓度变化敏感，而不仅仅是对气味的有无作出反应。通过施加以下浓度的气味液滴建立异戊醇梯度：0.06、0.12、0.25、0.5、0.25、0.12 M。所形成的梯度几何形状类似于一个在0.5 M处达到峰值的非对称“屋顶”。

幼虫被释放于0.06 M与0.12 M气味液滴之间。我们假设，若幼虫仅通过检测气味的存在来进行行为决策，则它们会沿着整个浓度梯度移动，而不会特别趋向于最高浓度区域。相反，若幼虫对局部浓度变化敏感，则它们会聚集在0.5 M液滴下方。实验记录了15只幼虫，发现经过短暂的探索期后，所有幼虫均聚集于较高浓度液滴下方。这表明果蝇幼虫能够计算局部气味浓度的变化，并据此调控其趋化行为。