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方法文章

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

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DOI：

10.3791/63816

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2022年4月28日

 ,  , 
1Department of Neurology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

本文内容

摘要

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。

摘要

蛋白质纤维状包涵体是多种神经退行性疾病的關鍵病理特徵。在阿爾茨海默病（AD）的早期階段，β-淀粉樣肽在細胞外空間形成原纖維，這些原纖維作為種子，逐漸生長並成熟為大的淀粉樣斑塊。儘管對此已有基本認識，目前對大腦中淀粉樣纖維的結構、組成及沉積模式的了解仍然有限。其中一個主要障礙在於難以從腦組織提取物中分離出高度純化的淀粉樣纖維。以往曾使用親和純化和基於激光捕獲顯微切割的方法來分離淀粉樣蛋白，但這些方法受限於所能回收的材料量極少。本項新穎且可靠的實驗方案描述了利用十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解結合蔗糖密度梯度超速離心和超聲處理，對淀粉樣斑塊核心進行生化純化，可從AD患者及AD模型動物腦組織中獲得高純度的纖維。對純化材料進行基於質譜（MS）的自下而上蛋白質組學分析，是一種鑒定幾乎所有淀粉樣纖維主要蛋白成分的可靠策略。以往對淀粉樣暈圈中蛋白質的蛋白質組學研究揭示出一組出乎意料地龐大且功能多樣的蛋白質群體。值得注意的是，在優化純化策略後，共純化的蛋白質數量減少了十倍以上，表明所分離的SDS不溶性材料具有高度純度。負染色法和免疫膠體金電子顯微鏡技術進一步驗證了這些樣品的純度。未來還需進一步研究，以闡明促使這些蛋白質沉積形成淀粉樣包涵體的空間與生物學特性。總體而言，這一分析策略有望顯著推動對淀粉樣蛋白生物學的理解。

引言

淀粉样蛋白是一种极为稳定的超分子结构，存在于多种蛋白质中，其中一些可导致病理变化1。在多种神经退行性疾病中均可观察到细胞内或细胞外淀粉样蛋白聚集体的积累2。淀粉样蛋白聚集体具有异质性，富含大量蛋白质和脂质3。近年来，淀粉样蛋白蛋白质组的研究引起了基础与转化神经科学家的广泛关注。目前已开发出多种方法，用于从小鼠及人脑尸检组织中提取和纯化淀粉样蛋白聚集体。激光捕获显微切割、免疫共沉淀、去细胞化以及生物化学分离等方法被广泛用于提取和纯化淀粉样斑块、纤维和寡聚体4,5,6,7。许多研究集中于利用半定量质谱技术分析这些致密纤维沉积物的蛋白质组成。然而，现有研究结果存在不一致性，且此前报道中大量共纯化的蛋白质数量之多令人惊讶，其生物学意义尚难以解释。

现有文献在描述阿尔茨海默病（AD）及AD小鼠模型脑组织中淀粉样蛋白核心蛋白质组时，主要局限在于所纯化的材料含有大量共纯化的蛋白质，难以有效处理。本方法的总体目标是克服这一局限，建立一种可靠的生化纯化流程，用于分离淀粉样纤维核心。该策略采用了一种先前报道的基于蔗糖密度梯度超速离心的生化方法，从死亡后的人类AD脑组织和小鼠脑组织中分离富含SDS不溶性淀粉样蛋白的组分8,9。该方法在现有研究基础上进一步结合超声处理和SDS洗涤步骤，以去除大多数松散结合的淀粉样相关蛋白，从而获得高度纯化的淀粉样纤维（图1）。通过本方案纯化的纤维可克服从脑组织提取物中分离淀粉样纤维进行结构研究时常遇到的多个挑战。透射电子显微镜（TEM）观察证实了所纯化材料的完整性和纯度（图2）。在本研究中，分离得到的纤维被溶解后用胰蛋白酶消化成肽段，并通过非标记质谱（MS）分析可快速鉴定构成纤维核心的蛋白质成分。值得注意的是，其中部分蛋白质本身具有在无膜细胞器中形成超分子组装体的倾向。此外，在淀粉样蛋白β（Aβ）纤维分析中鉴定出的许多蛋白质也与其他神经退行性疾病相关，提示这些蛋白质可能在多种蛋白病变中发挥关键作用。

该SDS/超声处理方法不太可能改变或破坏纤维核心的结构。纯化后的材料适用于多种自上而下和自下而上的蛋白质组学分析方法，以及基于质谱的其他结构分析策略，如化学交联或氢-氘交换。该方法的整体回收率相对较高，因此适用于需要微克至毫克级纯化材料的详细结构研究。纯化后的材料也适用于冷冻电镜（cryoEM）和原子力显微镜的结构研究。本方案结合哺乳动物的稳定同位素标记，可促进对淀粉样蛋白结构的固态核磁共振（NMR）研究10。

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方案

本方案涉及使用人类或脊椎动物的脑组织。所有研究均按照西北大学批准的机构指南进行。当前工作流程采用 APP 基因敲入（AppNL-G-F/NL-G-F）小鼠脑皮层及海马脑区提取物进行标准化11。该方案已针对 6 至 9 月龄小鼠的脑提取物优化，可有效从雄性和雌性动物中纯化淀粉样蛋白。

注意：为更好地理解整体实验流程，请参见图1中的实验流程示意图。

1. 组织采集与淀粉样蛋白纯化

注意：理想情况下，淀粉样纤维应从新鲜解剖的脑区中分离。然而，该方法也适用于快速冷冻或闪冻的脑组织。以下是脑组织快速冷冻以供后续使用时储存的简要步骤。

  1. 脑组织的采集与保存：解剖小鼠大脑，迅速分离富含淀粉样蛋白的区域（即皮层和海马），随后在液氮或干冰乙醇浴中快速冷冻。
    注意：快速冷冻有助于保持组织成分的结构特性。小鼠通过异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死12,13。建议避免使用CO2，因其可能破坏脑组织蛋白质组的完整性。
  2. 解剖完成后，将新鲜组织切成小块（例如5 mm × 5 mm）并储存，以便在淀粉样蛋白提取前实现更高效的匀浆化。将组织转移至无菌冻存管中，拧紧管盖，并迅速浸入冷冻介质中。
  3. 将组织保存在超低温条件下（即-80 °C或液氮中）。若计划在数日后进行提取，可将组织暂时存放在-20 °C环境中，并避免反复冻融。在准备进行提取与纯化时，将冷冻组织置于湿冰上解冻。
    ​注意：组织直接接触液氮可能导致组织和蛋白质损伤。需注意乙醇浴可能使冻存管标签上的永久性标记褪色。

2. SDS 不溶性物质的富集

注意：除非另有说明，所有步骤均需在冰上操作，并在 4 °C 下离心。本实验方案中所用缓冲液和溶液的详细信息见补充文件 1。化学品和仪器的生产厂家及目录编号见材料表。

  1. 取新鲜解剖的或速冻后置于冰上解冻的脑组织区域，放入含有6-8个陶瓷珠和新配制的冰上预冷匀浆缓冲液（每0.25-1 g湿组织质量使用1 mL）的2 mL离心管中。
  2. 将离心管转移至珠磨匀浆仪中，在4000 rpm条件下进行组织研磨，每次30秒，共两个循环，中间间隔30秒。
    注意：也可使用电动搅拌器或匀浆系统对组织进行研磨和匀浆。
  3. 在15 mL离心管中，向1 mL全脑组织匀浆液中加入9 mL冰上预冷的匀浆缓冲液，用实验室封口膜密封，于4 °C下旋转过夜（端对端旋转），以确保充分溶解。
    注意：为去除不需要的大细胞碎片和脂质，次日早晨在4 °C下以800 × g离心10分钟，收集上清至新离心管中。将剩余沉淀用2 mL冰上预冷的匀浆缓冲液重悬，充分混匀后再次在4 °C下离心10分钟，并将两次上清合并。
  4. 缓慢向组织提取物悬液中加入固体蔗糖，使其终浓度达到1.2 M，充分混匀后在4 °C下以250,000 × g离心45分钟。
  5. 小心用移液器吸除并弃去上清。通过吹打将沉淀重悬于含1.9 M蔗糖的2 mL匀浆缓冲液中，随后在4 °C下以125,000 × g离心45分钟。
    注意：缓冲液体积可根据前一步骤回收的材料量进行调整。通常，此步骤中匀浆缓冲液的最佳体积为样品体积的10倍（V/V）。
  6. 用移液器收集顶部白色固体层，转移至新的离心管中，并通过反复吹打将其溶于1 mL冰上预冷的洗涤缓冲液中，避免引入气泡。
  7. 除顶层外，沉淀中也富含淀粉样纤维。为获得更高得率，可将两部分合并后继续操作。小心用移液器移除中间水相层并弃去。
  8. 将合并后的组分在4 °C下以8000 × g离心20分钟，弃去上清。
  9. 向洗涤后的沉淀中加入1 mL冰上预冷的消化缓冲液，重悬后在室温（RT）孵育3小时。
  10. 在4 °C下以8000 × g离心20分钟，用移液器移除上清。
  11. 将消化后的沉淀用1 mL冰上预冷的Tris缓冲液重悬并洗涤两次（操作同步骤2.8）。
  12. 用移液器反复吹打，将洗涤后的沉淀重悬于含1% SDS和1.3 M蔗糖的1 mL溶解缓冲液中，随后在4 °C下快速以200,000 × g离心60分钟。
    注意：尽管淀粉样纤维对去垢剂和变性剂具有高度抗性，但长时间暴露于去垢剂（1% SDS）可能会影响纤维完整性或去除紧密结合的蛋白质，从而影响后续分析。因此，在重悬沉淀后应立即进行离心。
  13. 保留沉淀，并向剩余上清中加入50 mM Tris缓冲液（体积比1:0.3），以将蔗糖浓度从1.3 M降低至1 M，然后在4 °C下再次以200,000 × g离心45分钟。
  14. 将两次获得的沉淀溶解于100 µL含0.5% SDS的Tris缓冲液中，合并用于淀粉样蛋白纯化。可见的沉淀体积较小，呈不透明状、微白色（见图2A）。

3. 淀粉样蛋白纯化

注意：合并两个沉淀，通过移液吹打至溶解均匀，获得均一溶液后，继续进行后续的淀粉样蛋白纯化步骤。

  1. 为了使沉淀物中的富含淀粉样物质完全溶解，将试管置于超声波清洗仪中进行机械剪切处理，以中等频率运行，每次超声30秒，间隔30秒，共循环20次。
  2. 立即在4 °C条件下以20,000 × g离心30分钟，并将沉淀重悬于500 µL的0.5% SDS Tris缓冲液中。
  3. 重复步骤3.1和步骤3.2共四次，总计进行五次洗涤。可根据需要增加洗涤次数以提高纯度。
    注意：在0.5% SDS条件下，超声和洗涤步骤已达到优化效果，更高浓度可能会影响纤维的结构完整性或蛋白质组成。不建议在此步骤中提高SDS浓度。
  4. 最后一次离心后，用200 µL超纯水洗涤沉淀，并在4 °C条件下以20,000 × g离心30分钟，以去除残留的去垢剂。含有纯化淀粉样纤维的沉淀呈半透明状，有时难以观察。
  5. 将含有纯化淀粉样纤维的最终沉淀溶解于100 µL超纯水中。随后应立即进行下游处理，或将其纤维悬液保存于-20 °C以供后续分析。若已冷冻，请在冰上解冻后再开始沉淀操作。

4. 甲醇-氯仿沉淀法

注意：如果最终目标是进行蛋白质分析，建议进行脱盐处理并去除其他非蛋白质类杂质。

  1. 在1.5 mL离心管中，向纯化的100 µL淀粉样纤维中加入400 µL甲醇，并充分涡旋混匀。
  2. 向管中加入100 µL氯仿，并充分涡旋混匀。
  3. 加入300 µL超纯水，并彻底涡旋。由于蛋白质沉淀，混合物将变为浑浊。
  4. 在室温下以12,000 × g 离心2分钟。
  5. 小心移除水相层（即上层），避免扰动含有蛋白质片状物的界面层。
  6. 再次加入等体积的甲醇，并在室温下以12,000 × g 离心2分钟。
  7. 用移液器弃去上清液，并在室温下将沉淀空气干燥。避免过度干燥；若过度干燥，淀粉样组分将难以重新溶解。

5. 胰蛋白酶消化

  1. 将沉淀溶解于 50 µL 盐酸胍（GuHCl）缓冲液中。如有需要，可在冰水浴中超声处理，并于 95 °C 加热 5 分钟。
  2. 室温下充分涡旋振荡 45 分钟至 1 小时，以完全溶解。此步骤完成后沉淀物不可见，溶液呈透明外观。
  3. 加入等体积的 0.2% 表面活性剂溶液，室温下涡旋振荡 60 分钟以促进溶解。此步骤可增强胰蛋白酶的酶活性。
  4. 从 500 mM 储存液中加入 1 µL 三(2-羧乙基)膦（TCEP），孵育 60 分钟。
  5. 加入 2 µL 500 mM 碘乙酰胺（IAA），避光孵育 20 分钟。
  6. 用 5 µL TCEP 溶液淬灭 IAA，反应 15 分钟。
  7. 向管中加入适量体积的 50 mM 碳酸氢铵溶液，使盐酸胍浓度降至 1.5 M。
  8. 向管中加入 1% 表面活性剂溶液（每 50 µg 蛋白质加 1 µL）。
  9. 加入胰蛋白酶（每 100 µg 蛋白质加 1 µg），于 37 °C 振荡反应过夜。

6. 肽段纯化

  1. 次日早晨，通过加入甲酸将消化后的肽溶液酸化至 pH 2.0。
  2. 在2 mL接收管中，向C18（正十八烷基）离心柱中加入200 µL 50%甲醇溶液，并在室温下以1500 × g 离心2分钟进行活化。重复此活化步骤一次。
  3. 向C18柱的树脂床中加入200 µL平衡缓冲液，并在相同条件下离心2分钟，以平衡树脂。重复此步骤一次。
  4. 将酸化后的肽溶液加载到C18柱上，在室温下以1500 × g 离心2分钟。收集穿流液并再次上样一次，之后弃去第二次的穿流液。
  5. 使用洗涤缓冲液按步骤6.3的方法对结合在C18树脂上的肽进行两次洗涤。洗涤柱时使用相同的平衡缓冲液。
  6. 加入40 µL洗脱缓冲液洗脱肽段，随后在室温下以1500 × g 离心2分钟。重复此洗脱步骤三次，以提高回收肽段的得率。
  7. 使用真空离心浓缩仪蒸发去除水相溶液，将肽段干燥。干燥后的肽段可在-20 °C保存数周，待进行质谱分析。

7. 设置质谱仪用于肽段分析

注意：质谱参数详见补充文件1（改编自本实验室此前发表的研究）14。

  1. 在将肽样品上样进行质谱分析之前，将干燥的肽沉淀溶解于20 µL上样缓冲液中，并进行微定量BCA法（micro BCA）以测定回收肽的浓度。
  2. 将溶解后的肽转移至玻璃小瓶中，并向UPLC系统自动进样器中上样3 µg肽（根据micro BCA定量结果）。
  3. 以250 nL/min的流速将样品加载至带有通气孔的捕获柱（C18 HPLC柱，0.075 mm × 20 mm）。
  4. 将捕获柱与分析柱（0.075 µm × 500 mm）串联连接，并在电喷雾电离（ESI）源处装配喷针尖端，施加2000 V的喷雾电压。
    注意：本研究中采用电喷雾电离（ESI），其中流动相在高电压作用下被电离进入气相。由此产生的喷雾通过加热毛细管导入质谱仪的真空腔室。在真空条件下，液滴在热和电压作用下发生去溶剂化并释放离子。随后，离子在高电压环境中被加速进入质谱分析器。
  5. 采用2小时采集运行时间分析样品。本研究使用数据依赖性采集模式，选择前20个最强的前体离子进行碎裂分析。
    注意：在数据依赖性采集模式中，MS1扫描检测有限数量的前体肽，并对其进行碎裂以进行MS2分析。然而，动态排除策略在此存在局限性，因为高丰度的Aβ肽将被排除在碎裂之外，导致对其含量的低估。
  6. 为实现Aβ肽的绝对定量，使用靶向MS/MS方法对相同样品再进行一次分析。本研究中，已制备了针对APP基因敲入小鼠模型中所有可能的胰蛋白酶切Aβ肽的m/z比值详尽列表（见补充表1）。其他研究组应根据所使用的动物模型及目标蛋白（如阿尔茨海默病中的Aβ）可能产生的肽段，制备类似的列表。
    注意：为解决高丰度肽段被排除的问题，可采用靶向分析策略，提供一组与Aβ胰蛋白酶切肽段相对应的特定m/z值列表。该方法可克服数据依赖性采集中Aβ肽段被排除的问题，并能以高分辨率定量不同单体形式（Aβ38、Aβ40和Aβ42肽）的绝对含量。
  7. 质谱仪生成肽样品的质谱图，并将原始数据文件保存至指定目录。使用该文件，借助成熟的统计学与生物信息学工具进行谱图匹配分析。目前已有多种在线和离线的数据库搜索与分析工具可供使用。

8. 质谱数据分析

  1. 使用离线 Rawconverter 工具（http://www.fields.scripps.edu/rawconv/）提取 MS1 和 MS2 文件。
  2. 在基于网络的质谱数据搜索引擎上进行数据的鉴定、定量和详细分析。本研究中使用了 Integrated Proteomics Pipeline - IP2（Bruker：http://www.integratedproteomics.com/） 。
    注意：还可使用其他多种在线或离线质谱数据分析工具，例如 MaxQuant（https://www.maxquant.org/）。
  3. 上传 MS1 和 MS2 文件后，选择更新的小鼠蛋白质组数据库。本研究中选用了一个经过更新的小鼠数据库，其中包含额外的 App 基因敲入特异性突变，用于通过 ProLuCId 和 SEQUEST 算法进行肽段鉴定11。
  4. 在 IP2 分析系统中选择默认参数，并根据实验需求进行修改。本研究中，前体离子的肽段质量容差设为 50 ppm，碎片离子设为 600 ppm（其他在 IP2 中使用的参数详见补充文件 1）。
    注意：研究人员可根据实验目标调整搜索参数。例如，为鉴定翻译后修饰，可添加各种 PTM 的差异修饰项（如泛素化、SUMO 化、磷酸化）。

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结果

本文总结了一种使用改良的蔗糖密度梯度超速离心法分离和纯化淀粉样纤维的详细方法（见图1）。该方法的创新之处在于引入了基于超声波清洗的步骤，即使用水浴超声系统清洗，随后进行SDS溶解，从而去除与高密度、高纯度纤维共同纯化的许多松散结合的蛋白质。超声处理步骤可产生强烈的剪切力并扰动纤维，削弱疏水作用力，使SDS可溶性的松散结合蛋白释放至SDS洗涤缓冲液中。由此可回收获得少量高纯度的淀粉样纤维核心。如图2A所示，在富集后可见明显的沉淀物，初始状态呈不透明状（可能由于杂质所致）；然而，在经过超声处理和多次SDS洗涤后，沉淀物变为半透明且几乎不可见。与SDS可溶性组分相比，纯化后淀粉样蛋白的刚果红染色结果展示了淀粉样纤维的富集情况（图2B）。刚果红染色可用于确认不同组分中的淀粉样物质，并可通过明场显微镜观察。如图2C所示，SDS可溶性组分不与刚果红染料结合染色。

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讨论

由于从阿尔茨海默病（AD）脑组织中提取纯化纤维存在生物学复杂性和实验技术限制，结构生物学家和生物化学家在深入理解淀粉样蛋白的结构与组成方面面临挑战16,17。在分子水平上，淀粉样纤维具有多态性，表现出长度和复杂性各异的异质性群体18,19。为了更深入地理解其生物学特征及与疾病的病理相关性，必须对来自人尸脑组织和AD模型小鼠脑组织的多态性淀粉样纤维的组成进行详尽的表征20,21。大量蛋白质可直接与Aβ42相互作用，而另一些蛋白质则可能倾向于形成大型纤维状结构或蛋白质复合物22,23,24。然而，确定这些与A...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目R01AG061865支持，资助对象为R.J.V.和J.N.S.。作者感谢西北大学Vassar和Savas研究团队成员提供的富有见地的讨论。我们还诚挚感谢南加州大学的Ansgar Seimer博士和Ralf Langen博士提供的关键性意见。我们感谢Farida Korabova博士在西北大学先进显微镜中心进行的样品制备和负染电子显微镜成像工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱 0.075 mm x 20 mmThermo Scientific164535可使用其他厂商的替代仪器、化学品和抗体
碳酸氢铵Sigma-Aldrich9830
抗淀粉样蛋白 β (1-16) 6E10 抗体Biolegend803001
抗淀粉样蛋白 β (17-24) 4G8 抗体Biolegend800701
抗淀粉样蛋白 β (N 端 82E1) 抗体IBL America10323
抗淀粉样纤维 LOC 抗体 EMD MilliporeAB2287
BCA 试剂盒Thermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
氯化钙Sigma-Aldrich C1016
胶原酶Sigma-AldrichC0130
Complete  蛋白酶抑制剂混合物Sigma-Aldrich11697498001
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)Thermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
盐酸胍Sigma-AldrichG4505
HyperSep C18 小柱Thermo Fisher Scientific60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2 http://www.integratedproteomics.com/
碘乙酰胺 (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 组织匀浆系统电机Cole ParmerGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
Micro BCA 试剂盒Thermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 μm x 50 cmThermo Scientific164942
Optima L-90K 超速离心机Beckman CoulterBR-8101P-E
Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪Thermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 离心柱Thermo Fisher Scientific89870
Precellys 24 组织匀浆器Bertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) 表面活性剂胰蛋白酶增强剂PromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
叠氮化钠VWR97064-646
十二烷基硫酸钠 (SDS)Sigma-Aldrich74255
Sorvall Legend Micro 21R 微型离心机Thermo Fisher Scientific75002446
真空离心浓缩仪Labconco7315021
三(2-羧乙基)膦 (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
胰蛋白酶 Gold-质谱级PromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano 系统Thermo ScientificULTIM3000RSLCNANO

参考文献

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脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征
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