脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

摘要

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。

摘要

蛋白质纤维状包涵体是多种神经退行性疾病的關鍵病理特徵。在阿爾茨海默病（AD）的早期階段，β-淀粉樣肽在細胞外空間形成原纖維，這些原纖維作為種子，逐漸生長並成熟為大的淀粉樣斑塊。儘管對此已有基本認識，目前對大腦中淀粉樣纖維的結構、組成及沉積模式的了解仍然有限。其中一個主要障礙在於難以從腦組織提取物中分離出高度純化的淀粉樣纖維。以往曾使用親和純化和基於激光捕獲顯微切割的方法來分離淀粉樣蛋白，但這些方法受限於所能回收的材料量極少。本項新穎且可靠的實驗方案描述了利用十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解結合蔗糖密度梯度超速離心和超聲處理，對淀粉樣斑塊核心進行生化純化，可從AD患者及AD模型動物腦組織中獲得高純度的纖維。對純化材料進行基於質譜（MS）的自下而上蛋白質組學分析，是一種鑒定幾乎所有淀粉樣纖維主要蛋白成分的可靠策略。以往對淀粉樣暈圈中蛋白質的蛋白質組學研究揭示出一組出乎意料地龐大且功能多樣的蛋白質群體。值得注意的是，在優化純化策略後，共純化的蛋白質數量減少了十倍以上，表明所分離的SDS不溶性材料具有高度純度。負染色法和免疫膠體金電子顯微鏡技術進一步驗證了這些樣品的純度。未來還需進一步研究，以闡明促使這些蛋白質沉積形成淀粉樣包涵體的空間與生物學特性。總體而言，這一分析策略有望顯著推動對淀粉樣蛋白生物學的理解。

引言

淀粉样蛋白是一种极为稳定的超分子结构，存在于多种蛋白质中，其中一些可导致病理变化¹。在多种神经退行性疾病中均可观察到细胞内或细胞外淀粉样蛋白聚集体的积累²。淀粉样蛋白聚集体具有异质性，富含大量蛋白质和脂质³。近年来，淀粉样蛋白蛋白质组的研究引起了基础与转化神经科学家的广泛关注。目前已开发出多种方法，用于从小鼠及人脑尸检组织中提取和纯化淀粉样蛋白聚集体。激光捕获显微切割、免疫共沉淀、去细胞化以及生物化学分离等方法被广泛用于提取和纯化淀粉样斑块、纤维和寡聚体^4,5,6,7。许多研究集中于利用半定量质谱技术分析这些致密纤维沉积物的蛋白质组成。然而，现有研究结果存在不一致性，且此前报道中大量共纯化的蛋白质数量之多令人惊讶，其生物学意义尚难以解释。

现有文献在描述阿尔茨海默病（AD）及AD小鼠模型脑组织中淀粉样蛋白核心蛋白质组时，主要局限在于所纯化的材料含有大量共纯化的蛋白质，难以有效处理。本方法的总体目标是克服这一局限，建立一种可靠的生化纯化流程，用于分离淀粉样纤维核心。该策略采用了一种先....

方案

本方案涉及使用人类或脊椎动物的脑组织。所有研究均按照西北大学批准的机构指南进行。当前工作流程采用 APP 基因敲入（App^{NL-G-F/NL-G-F}）小鼠脑皮层及海马脑区提取物进行标准化¹¹。该方案已针对 6 至 9 月龄小鼠的脑提取物优化，可有效从雄性和雌性动物中纯化淀粉样蛋白。

注意：为更好地理解整体实验流程，请参见图1中的实验流程示意图。

1. 组织采集与淀粉样蛋白纯化

注意：理想情况下，淀粉样纤维应从新鲜解剖的脑区中分离。然而，该方法也适用于快速冷冻或闪冻的脑组织。以下是脑组织快速冷冻以供后续使用时储存的简要步骤。

1. 脑组织的采集与保存：解剖小鼠大脑，迅速分离富含淀粉样蛋白的区域（即皮层和海马），随后在液氮或干冰乙醇浴中快速冷冻。
   注意：快速冷冻有助于保持组织成分的结构特性。小鼠通过异氟烷麻醉后行颈椎脱位法处死^12,13。建议避免使用CO₂，因其可能破坏脑组织蛋白质组的完整性。
2. 解剖....

结果

本文总结了一种使用改良的蔗糖密度梯度超速离心法分离和纯化淀粉样纤维的详细方法（见图1）。该方法的创新之处在于引入了基于超声波清洗的步骤，即使用水浴超声系统清洗，随后进行SDS溶解，从而去除与高密度、高纯度纤维共同纯化的许多松散结合的蛋白质。超声处理步骤可产生强烈的剪切力并扰动纤维，削弱疏水作用力，使SDS可溶性的松散结合蛋白释放至SDS洗涤缓冲液中。由此可回收获得少量高纯度的淀粉样纤维核心。如图2A所示，在富集后可见明显的沉淀物，初始状态呈不透明状（可能由于杂质所致）；然而，在经过超声处理和多次SDS洗涤后，沉淀物变为半透明且几乎不可见。与SDS可溶性组分相比，纯化后淀粉样蛋白的刚果红染色结果展示了淀粉样纤维的富集情况（图2B）。刚果红染色可用于确认不同组分中的淀粉样物质，并可通过明场显微镜观察。如图2C所示，SDS可溶性组分不与刚果红染料结合染色。

讨论

由于从阿尔茨海默病（AD）脑组织中提取纯化纤维存在生物学复杂性和实验技术限制，结构生物学家和生物化学家在深入理解淀粉样蛋白的结构与组成方面面临挑战^16,17。在分子水平上，淀粉样纤维具有多态性，表现出长度和复杂性各异的异质性群体^18,19。为了更深入地理解其生物学特征及与疾病的病理相关性，必须对来自人尸脑组织和AD模型小鼠脑组织的多态性淀粉样纤维的组成进行详尽的表征^20,21。大量蛋白质可直接与Aβ42相互作用，而另一些蛋白质则可能倾向于形成大型纤维状结构或蛋白质复合物^22,23,24。然而，确定这些与A.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC 色谱柱 0.075 mm x 20 mm	Thermo Scientific	164535	可使用其他厂商的替代仪器、化学品和抗体
碳酸氢铵	Sigma-Aldrich	9830
抗淀粉样蛋白 β (1-16) 6E10 抗体	Biolegend	803001
抗淀粉样蛋白 β (17-24) 4G8 抗体	Biolegend	800701
抗淀粉样蛋白 β (N 端 82E1) 抗体	IBL America	10323
抗淀粉样纤维 LOC 抗体	EMD Millipore	AB2287
BCA 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225
Bioruptor Pico Plus	Diagenode	B01020001
氯化钙	Sigma-Aldrich	C1016
胶原酶	Sigma-Aldrich	C0130
Complete  蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	11697498001
脱氧核糖核酸酶 I (DNase I)	Thermo Fisher Scientific	EN0521
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
盐酸胍	Sigma-Aldrich	G4505
HyperSep C18 小柱	Thermo Fisher Scientific	60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2	http://www.integratedproteomics.com/
碘乙酰胺 (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
K54 组织匀浆系统电机	Cole Parmer	Glas-Col 099C
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
Micro BCA 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23235
Nanoviper 75 μm x 50 cm	Thermo Scientific	164942
Optima L-90K 超速离心机	Beckman Coulter	BR-8101P-E
Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 离心柱	Thermo Fisher Scientific	89870
Precellys 24 组织匀浆器	Bertin Instruments	P000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) 表面活性剂胰蛋白酶增强剂	Promega	V2072
RawConverter	http://www.fields.scripps.edu/rawconv/
叠氮化钠	VWR	97064-646
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Sigma-Aldrich	74255
Sorvall Legend Micro 21R 微型离心机	Thermo Fisher Scientific	75002446
真空离心浓缩仪	Labconco	7315021
三(2-羧乙基)膦 (TCEP)	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris-HCl	Thermo Fisher Scientific	15568025
胰蛋白酶 Gold-质谱级	Promega	V5280
UltiMate 3000 RSLCnano 系统	Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO