本方案描述了一种用于囊性纤维化（CF）的新型诊断检测方法——直肠类器官形态学分析（ROMA）。形态学特征，即圆形度（圆形度指数，CI）和管腔的存在（强度比，IR），可作为CFTR功能的衡量指标。对189名受试者进行的分析显示，该方法能够完美区分CF与非CF个体。
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摘要
摘要
囊性纤维化（CF）的诊断并不总是明确，尤其是在汗液氯离子浓度处于中间范围和/或少于两个致病性突变的情况下 CFTR 可识别突变。生理性CFTR检测方法（鼻电位差、肠电流测量）已被纳入诊断流程，但并非在所有情况下均可行或易于实施（例如在婴儿中）。直肠类器官是在特定培养条件下由直肠活检组织隐窝中分离出的干细胞生长形成的三维结构。非囊性纤维化（CF）个体的类器官呈圆形，具有充满液体的管腔，这是因为CFTR介导的氯离子转运驱动水分进入管腔。而CFTR功能缺陷的类器官则不会膨胀，保持不规则形状且无可见管腔。CF与非CF类器官在形态上的差异可通过“直肠类器官形态分析”（Rectal Organoid Morphology Analysis, ROMA）进行量化，作为一种新型的CFTR生理功能检测方法。在ROMA检测中，将类器官接种于96孔板中，用钙黄绿素染色后在共聚焦显微镜下成像。形态学差异通过两个指标进行量化：圆形度指数（circularity index, CI）用于衡量类器官的圆整程度，强度比值（intensity ratio, IR）用于评估中央管腔的存在情况。与CF类器官相比，非CF类器官具有较高的CI值和较低的IR值。ROMA指标可完全区分167例CF患者与22例非CF个体，表明ROMA是一种有前景的CFTR生理功能检测方法，有助于CF的诊断。直肠活检在大多数医院可在各年龄段常规开展，组织样本可送至中心实验室进行类器官培养与ROMA检测。未来，ROMA还可能用于评估CFTR调节剂的治疗效果。 体外本报告的目的是全面阐述ROMA所使用的方法，以便其他实验室能够进行重复实验。
引言
囊性纤维化（CF）是一种由CF跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的常染色体隐性遗传病。CFTR蛋白是一种氯离子和碳酸氢根离子通道，可维持多种上皮组织的水合状态1。CF是一种高负担、缩短寿命的多系统疾病，主要表现为呼吸系统疾病，但也会影响胃肠道、胰腺、肝脏和生殖道2。
导致疾病的CFTR突变会减少CFTR蛋白的数量或功能，进而引起黏液脱水。已有超过2000种CFTR基因变异被报道3，其中仅有466种得到了充分表征4。
当汗液氯离子浓度（SCC）超过60 mmol/L，或鉴定出两个致病性CFTR突变（依据CFTR2数据库）时，可确诊囊性纤维化（CF）4,5。对于SCC仅中度升高（30–60 mmol/L）的个体（约占汗液检测的4%–5%）6，若同时携带临床意义不同或未知的CFTR突变，则即使存在与CF相符的症状或新生儿筛查阳性，也无法确认或排除诊断。针对此类情况，诊断流程中已纳入二线生理学CFTR检测方法，包括鼻电位差（NPD）和肠电流测量（ICM）。然而，这些检测在大多数医疗中心尚不易开展，且在所有年龄段均难以实施，尤其在婴儿中更为困难5。
直肠类器官是由经直肠活检获取的肠隐窝中分离出的Lgr5(+)成体肠干细胞培养而成的三维结构7。类器官在生物医学研究中的应用日益广泛，例如用于囊性纤维化（CF）中调节剂治疗的效果测试8。可通过负压吸引或钳夹方式进行活检，该操作仅引起轻微不适，安全性高，即使在婴儿中进行亦具有较低的并发症发生率9。从直肠活检组织中分离出的隐窝富含干细胞，在特定培养条件下，这些细胞可自我组装形成直肠类器官。这些类器官的形态受位于上皮细胞顶膜的CFTR蛋白表达与功能的影响。具有功能的CFTR可介导氯离子和水进入类器官腔内，从而引起非CF类器官的肿胀。而CF类器官因缺乏CFTR功能，不发生肿胀，且无可见腔隙10,11。
直肠类器官形态学分析（ROMA）可根据类器官形态的差异，区分囊性纤维化（CF）与非囊性纤维化（非-CF）类器官。非-CF类器官更接近圆形，且具有可见的管腔，而CF类器官则相反。在本实验中，将患者特异性的类器官接种于96孔板中的32个孔内。培养1天后，使用钙黄绿素绿色（calcein green）对类器官进行染色，并在共聚焦显微镜下成像。非-CF类器官呈现更规则的圆形轮廓，其中央区域荧光较弱，这是因为管腔内含有液体，而钙黄绿素仅对细胞进行染色。这些形态学差异通过两个ROMA指数进行量化：圆形度指数（CI）用于量化类器官的圆整程度，而强度比（IR）则用于评估中央管腔的存在与否。本报告中，我们详细描述了获得上述鉴别性指数的实验方案，以促进该技术的可重复性。
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方案
所有涉及人体组织的操作均获得了鲁汶大学医院/鲁汶大学伦理委员会（EC research）的批准。所有研究均在获得父母、监护人和/或患者的知情同意和/或同意后进行。
注意：所有涉及直肠活检和类器官的操作均应在层流柜中进行，以保护研究人员免受任何生物危害，并最大限度降低培养物污染的风险。对于所有实验室操作，研究人员在处理样本时应始终穿戴实验服、手套和护目镜。
1. 直肠活检、隐窝中成体干细胞的分离及类器官培养
- 对于本方案的初始部分，包括培养基制备与使用、类器官培养、传代、扩增以及用于生物样本库的冻存，请参照之前发表的两篇文献中的方案8,12。
- 简要而言，需执行以下步骤：
- 使用活检钳或负压吸引装置采集三至四个直肠活检组织，并将其收集至无菌容器（例如 1.5 mL 微量离心管）中，容器内预先加入上述方案所述的 Ad-DF+++ 培养基。
- 将活检组织置于冰上或 4 °C 条件下运送至中心实验室。也可运送到其他中心，即使运输时间长达 48 小时，组织质量也不会受到显著影响。若预计运输时间超过 6 小时，应使用含 6 mL Ad-DF+++ 培养基的 15 mL 锥形管，而非 1.5 mL 微量离心管。
- 用冷 PBS 清洗活检组织，直至上清液澄清，以去除碎片及脂肪组织等非上皮组织。
- 用 EDTA（终浓度 10 mM）孵育活检组织，以分离隐窝结构。将分离出的隐窝接种于基底膜基质中。在培养的第一周，向培养基中添加广谱抗生素（庆大霉素 50 µg/mL 和万古霉素 50 µg/mL），以防止细菌污染。
- 当隐窝出芽并形成闭合且开始增殖的结构后，通常在 7 天后进行机械性传代。
- 此后每隔约 7 天对获得的类器官进行一次传代。通过此方式扩增培养物，冻存备份样本至生物样本库，或用于后续实验分析。
2. 用于 ROMA 的类器官接种（第 1 天）
- 通过机械法将类器官分割后进行铺板
- 从一个24孔板中选取三个生长良好的孔，用预冷的Ad-DF+++培养基洗涤两次，将类器官收集至1.5 mL离心管中，并在显微镜下进行评估12。
- 确保类器官具有良好的活力和高质量，通常在上一次传代后培养5–7天可达到此状态（图1）。
- 按照前述方案8,12对类器官进行机械分割。重复操作，直至在明场显微镜下观察到大多数类器官较初始状态明显变小。
- 收集较小的类器官，通常对应于将类器官-培养基混合液上层约4/5体积转移至新的离心管中；较大的类器官因重力作用沉降至管底，而较小的类器官则悬浮于液体上层。
- 将含有较小类器官的样品在0.3 × 1000 g 条件下离心2分钟，弃去上清液。
- 用130 µL的40%–50%基底膜基质（用Ad-DF+++培养基稀释12）重悬沉淀。
- 使用200 µL移液器充分重悬。
- 将类器官铺板至96孔板
- 使用20 µL移液器，将类器官接种至预温的96孔板中的32个孔内。确保每个孔中含有前一步制备的类器官-基质混合液4 µL液滴。
- 类器官在溶液中会因重力作用逐渐沉降至管底形成沉淀。为避免此现象并保证铺板均匀，需定期使用200 µL移液器重悬类器官-基质混合液（例如，每铺4–8个孔后重悬一次）。
- 将每个液滴置于孔中央，防止液滴流向孔边缘，以免影响后续成像质量。
- 目标为每孔约30个类器官（最少15个，最多90个），且类器官之间不重叠。
- 需注意，这些类器官将孵育过夜，在此期间会略有生长；若铺板密度过高，可能开始出现重叠。
- 在完成前一至两个孔的铺板后，使用5倍物镜的明场显微镜检查铺板密度。
- 若铺板密度过高，可逐步加入基底膜基质稀释类器官-基质混合液，直至达到理想密度（图2）。
- 铺板完成后，轻轻敲击培养板使其在水平表面上震动，以确保大多数类器官处于同一焦平面。
- 孵育培养板
- 将96孔板置于37 °C、5% CO2条件下孵育8–10分钟，使基底膜基质完成凝胶化。
- 向每孔加入50 µL人结肠类器官完全培养基 +/+12，并过夜孵育16–24小时。
- 不添加forskolin或CFTR调节剂，使类器官在基础条件下生长。
使用共聚焦显微镜进行类器官成像（第2天）
- 用钙黄绿素绿色染色类器官
- 向含有50 µg钙黄绿素绿色的1个小瓶中加入50 µL二甲基亚砜（DMSO），配制1 mM的储备液。
- 取1.2 µL上述储备液加入200 µL Ad-DF+++中，配制钙黄绿素绿色工作液（终浓度为6 µM）。
- 向已接种类器官的96孔板每孔加入5 µL该钙黄绿素混合液（终浓度0.6 µM）。操作时避免触碰或移动孔内基质液滴。
- 盖上盖子后，轻轻旋转并倾斜培养板数次，确保钙黄绿素绿色在孔内均匀分布。
- 将培养板再次于37 °C、5% CO2条件下孵育15–30分钟，以确保所有孔中的类器官充分染色。
- 将培养板转移至共聚焦显微镜
- 将培养板转移至配备自动载物台和集成培养箱的共聚焦显微镜。确保培养板牢固固定在板架中。
- 由于成像过程较短（约10分钟），在37 °C、5% CO2条件下孵育为可选步骤，非必需。
- 对类器官进行聚焦（图3）
- 使用共聚焦显微镜手动确定每孔中类器官的最佳x/y位置和焦平面（z位置），并在成像软件中保存这些位置。
- 最佳聚焦应实现类器官最清晰的轮廓界定，并尽可能显示最大范围的类器官液滴。若染色分布不理想，可重复步骤3.1.4和3.1.5（例如额外孵育5–10分钟）。
- 采用活细胞成像参数：发射波长488 nm，激发波长515 nm（专用于钙黄绿素荧光的检测），物镜使用5x LD倍率。
- 使用共聚焦显微镜获取32个孔中类器官的图像（图3和图4）。
- 以单向方式采集图像，分辨率为1024像素 × 1024像素（像素尺寸2.5 µm × 2.5 µm），位深度为16位。
- 调节激光强度和主增益，以最佳显示囊性纤维化（CF）与非CF类器官之间的形态学差异（例如区分未染色的充满液体的中央腔室（如存在）与染色的细胞边界）。
注意：若主增益过低，荧光信号太弱，类器官轮廓将无法清晰显示；若主增益过高，则类器官图像信号过强且均匀，掩盖细微的形态学差异（图2）。 - 每孔保存一张图像，采用显微镜原生格式，并导出为TIFF文件。
4. 图像分析（图5）
- 在图像分析软件中加载TIFF文件。
- 根据操作员确定的排除标准进行首次质量检查（图2）：存在大量已分化或死亡的结构或碎片、铺板密度不适宜、类器官过多（如相互重叠）或过少、荧光分布不佳（类器官边界不清晰、背景信号过高）。
注意：此步骤也可在步骤 3.4 中将图像导出为 TIFF 文件之前执行。 - 准备用于分析的图像
- 重新校准图像，使1像素对应 2.5 µm x 2.5 µm.
- 为每份类器官培养物创建并打开一个包含全部32张图像的网络数据（.ND）文件，以实现对每位受试者共32张图像的同步分析。
- 描绘类器官
- 使用4,500的较低强度阈值和65,535的较高阈值来界定结构光滑 和 清洁 功能关闭； 填补孔洞 功能开启； 分离 在 x3 处的函数值。
注意：用于界定荧光结构， 填补孔洞 若存在，应包含划定结构内的管腔。
- 使用4,500的较低强度阈值和65,535的较高阈值来界定结构光滑 和 清洁 功能关闭； 填补孔洞 功能开启； 分离 在 x3 处的函数值。
- 计数类器官
- 选择所有结构 ≥40 µm.
- 点击 更新 ND 测量 按钮（每次需要测量时按下）；计数的类器官将被编号。
注：此数值等于32个孔中类器官的总数，不包括细胞碎片等微小残屑。
- 测量强度和圆形度以计算指数
- 选择所有大于或等于的结构60 µm 并计数。
注意：此计数仅针对大小足以显示囊性纤维化（CF）或非囊性纤维化典型形态的类器官。类器官 >40 µm 和 <60 µm 在非囊性纤维化（non-CF）和囊性纤维化（CF）中均表现为体积小且密度高。 - 移除所有接触图片边框的结构。此操作旨在去除未完全显示的类器官，因其形态无法被准确量化。
- 侵蚀1像素（= 2.5 µm) 从每个 ≥ 的边界处60 µm 结构。这可以消除类器官周围弥散的钙黄绿素荧光晕。
- 测量每个结构的平均强度。通过这种方法，测量类器官的平均荧光强度。
- 选择所有结构 ≥60 µm 再次操作，并移除所有接触边界的结构。
- 侵蚀 10 像素 (= 25 µm) 从每个 ≥ 的边界处60 µm 结构。
注意：在非囊性纤维化类器官中，这会破坏细胞边界，仅留下管腔。在囊性纤维化类器官中，这会侵蚀类器官的外层部分，其荧光强度与残留的内层部分大致相同。 - 测量每个被侵蚀结构的平均强度。通过这种方法，可测量类器官中心部分的平均荧光强度。
- 测量每个结构的圆形度，这对应于类器官的平均圆形度。
- 选择所有大于或等于的结构60 µm 并计数。
- 进行第二次质量检查：由软件确定的排除标准。当类器官（定义为直径≥40 µm) 均 ≥60 µm，因为应有足够数量的类器官足够大，以显示出囊性纤维化（CF）或非囊性纤维化典型的形态特征。同时在以下情况中排除 <500 或 >3,000 个类器官（定义为结构 ≥40 µm) 存在于32个孔中。
5. 在成像软件中测量指标（图6）
- 测量圆形度指数（CI）。
注：这对应于步骤 4.6 中测得的平均圆形度，即所有 32 个孔中类器官的平均圆形度。圆形度指数（CI）用于量化类器官的圆整程度，其定义为
，该值在囊性纤维化类器官中低于非囊性纤维化类器官 - 测量强度比（IR）
- 通过将侵蚀后强度测量值的平均值相除来计算 IR 25 µm 从每个 ≥ 的边界处60 µm 通过侵蚀后强度测量的均值确定结构 2.5 µm 从每个 ≥ 的边界处60 µm 结构
注：IR 用于检测中心管腔的存在或缺失。IR 等于
，且在囊性纤维化（CF）类器官中高于非囊性纤维化（非-CF）类器官。
- 通过将侵蚀后强度测量值的平均值相除来计算 IR 25 µm 从每个 ≥ 的边界处60 µm 通过侵蚀后强度测量的均值确定结构 2.5 µm 从每个 ≥ 的边界处60 µm 结构
- 简化分析流程
- 使用电子表格软件准备标准工作表，以便在复制数据后自动计算这些指数（图7).
- 计算IR的方法：
- 侵蚀后进行强度测量 2.5 µm 从每个 ≥ 的边界处60 µm 结构。计算时使用平均值（分母）。
- 侵蚀后进行强度测量 25 µm 从每个 ≥ 的边界处60 µm 结构。计算时使用平均值（分子）。
- 为计算 CI，需测量所有孔中类器官的圆形度，其平均值即为 CI。
注意：当需要分析大量图像批次时，可从已校准的 ND 文件开始，通过运行包含所有步骤的宏，将第 4 节所述的图像分析过程进行半自动化处理。
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结果
在常规临床就诊期间，收集了来自212名受试者的类器官。直肠活检过程期间及之后均未发生不良事件。由一名对受试者特征（如基因型和临床信息）不知情的研究人员对类器官进行成像。由于图像质量较低，排除了23名受试者。成功的和失败的类器官培养及图像采集示例见图2。
共分析了来自167名携带CF及两种致病性CFTR突变（根据CFTR2数据库4定义）的受试者和22名非CF受试者的类器官。每份培养物中类器官的平均数量为1,519个（每孔约40-50个类器官）。纳入分析的每份培养物中类器官的平均比例为77%（直径≥60 µm的结构数除以直径≥40 µm的结构数，代表足够大以反映典型CF或非CF形态的类器官所占比例）。
红外光谱（IR）和化学指数（CI）能够显著区分来自囊性纤维化（CF）患者与非CF患者的类器官（p < 0.001）（表1）。通过线性判别分析，在使用全部32个孔的数据时...
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讨论
我们提供了一种详细的直肠类器官形态学分析（ROMA）方案。通过ROMA计算得到的两个指标——IR和CI，能够以100%的准确率区分来自囊性纤维化（CF）患者与非CF个体的类器官。因此，ROMA可作为新型的CFTR生理功能检测方法，与现有的囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）功能检测（如SCC）及其他检测技术互为补充13,14,15。
该方案依赖于肠道类器官的使用，当CFTR功能正常时，类器官呈圆形并具有中央管腔，如先前所述10,11。类器官正越来越多地用于评估新型囊性纤维化（CF）治疗方法（例如在FIS检测中8）。ROMA方案可与FIS检测方案整合，因为在FIS检测中，32个孔需在不含校正剂的条件下过夜孵育。这些孔可在加入钙黄绿素绿...
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披露
本研究由比利时囊性纤维化患者协会“Mucovereniging/Association Muco”、比利时儿科学会BVK-SBP 2019年研究基金以及鲁汶大学医院转化 biomedical 研究基金资助。作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢参与本研究的患者及其家长。感谢Abida Bibi在类器官培养方面所做的全部工作。感谢Els Aertgeerts、Karolien Bruneel、Claire Collard、Liliane Collignon、Monique Delfosse、Anja Delporte、Nathalie Feyaerts、Cécile Lambremont、Lut Nieuwborg、Nathalie Peeters、Ann Raman、Pim Sansen、Hilde Stevens、Marianne Schulte、Els Van Ransbeeck、Christel Van de Brande、Greet Van den Eynde、Marleen Vanderkerken、Inge Van Dijck、Audrey Wagener、Monika Waskiewicz和Bernard Wenderickx提供的后勤支持。我们还要感谢Mucovereniging/Association Muco，特别是Stefan Joris和Jan Vanleeuwe博士，感谢他们的支持与资助。我们感谢比利时类器官项目的所有合作者：Hedwige Boboli（比利时列日CHR Citadelle）、Linda Boulanger（比利时鲁汶大学医院）、Georges Casimir（比利时布鲁塞尔HUDERF）、Benedicte De Meyere（比利时根特大学医院）、Elke De Wachter（比利时布鲁塞尔大学医院）、Danny De Looze（比利时根特大学医院）、Isabelle Etienne（比利时布鲁塞尔CHU Erasme）、Laurence Hanssens（比利时布鲁塞尔HUDERF）、Christiane Knoop（比利时布鲁塞尔CHU Erasme）、Monique Lequesne（比利时安特卫普大学医院）、Vicky Nowé（比利时安特卫普GZA圣文森特医院）、Dirk Staessen（比利时安特卫普GZA圣文森特医院）、Stephanie Van Biervliet（比利时根特大学医院）、Eva Van Braeckel（比利时根特大学医院）、Kim Van Hoorenbeeck（比利时安特卫普大学医院）、Eef Vanderhelst（比利时布鲁塞尔大学医院）、Stijn Verhulst（比利时安特卫普大学医院）、Stefanie Vincken（比利时布鲁塞尔大学医院）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL 圆锥形离心管 | VWR | 525-0605 | |
| 24 孔板 | Corning | 3526 | |
| 96 孔板 | Greiner | 655101 | |
| 明场显微镜 | Zeiss | Axiovert 40C | |
| 离心机 | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 培养箱 | Binder | CB160 | |
| 计算机 | Hewlett-Packard | Z240 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM 800 | |
| 层流罩 | Thermo Fisher | 51025413 | |
| 类器官培养所需材料，详见先前方案10 | |||
| 微量移液器（20、200 和 1000 µL） | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | 电子表格软件 |
| NIS-Elements Advanced Research 分析成像软件 | Nikon | v.5.02.00 | 成像软件 |
| 移液器吸头（20、200 和 1000 µL） | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue 软件 | Zeiss | v2.6 | 成像软件 |
参考文献
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