本方案提供了在小鼠中进行多次静脉推注给药及有创血流动力学监测的逐步操作流程。研究人员可利用本方案开展未来针对肺动脉高压的治疗性化合物筛选。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
肺动脉高压（PAH）是一种主要累及肺部小肺动脉的进行性致死性疾病。目前尚无治愈PAH的方法，因此发现可用于治疗PAH的新化合物至关重要。小鼠低氧诱导PAH模型是PAH研究中广泛使用的一种模型，该模型可重现人类PAH第3组疾病的临床表现，是评估新型实验性PAH疗法有效性的关键研究工具。利用该模型开展的研究通常需要在小鼠体内给药。对于需直接注入血液的化合物，优化静脉（IV）给药是实验操作中的关键环节。理想的静脉注射系统应能够在设定的时间过程中实现多次给药。尽管小鼠低氧诱导PAH模型在许多实验室中被广泛应用，但在该模型中实施多次静脉推注给药及有创血流动力学评估在技术上仍具挑战性。本方案中，我们将提供逐步操作指南，介绍如何实施多次静脉推注给药 通过 小鼠颈静脉穿刺及动脉和右心室插管用于缺氧诱导的肺动脉高压小鼠模型的血流动力学评估
引言
肺动脉高压（PAH）定义为静息状态下平均肺动脉收缩压超过20 mmHg1,2。它是一种进行性且致命的疾病，其特征是肺动脉压力持续升高，导致右心室超负荷，最终因右心室衰竭而死亡1。目前，肺动脉高压尚无治愈方法。
使用肺动脉高压动物模型对于评估实验性肺动脉高压（PAH）疗法的有效性至关重要。在这些模型中，小鼠低氧诱导的PAH模型为人类PAH第3类疾病的发病机制提供了关键见解3,4。利用该模型开展的研究通常需要向小鼠给药，以评估新化合物的有效性和安全性。因此，研究人员需要一份详细的实验操作流程，用于化合物给药和血流动力学测量，以确保从开始到结束整个过程中给药的一致性以及血压测量的可重复性。
已有文献报道了静脉（IV） 注射和血压测量的方法5,6。然而，这些方法缺乏直观的图示和详细的描述。本文展示了成功实施静脉推注以及准确测量和记录体循环和右心室血压的关键步骤。本文所述的操作流程对于致力于通过静脉给药平台开发肺动脉高压（PA....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物实验均在耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。
1. 动物、器械、血压测量设备和低氧舱的准备
- 动物适应性饲养。
注意：本研究使用的实验动物为雄性、8周龄、体重25-27 g的C57BL/6小鼠。在估算实验所需动物数量时，应考虑多种因素，包括手术相关死亡率、意外手术并发症以及突发性非预期死亡。每组至少使用10只小鼠，以确保达到统计学效力，避免统计效能不足的研究。- 收到动物后，将其饲养于通风的啮齿类动物笼具中（每笼5只动物为一组），提供合适的垫料、啮齿类饲料和饮水。让动物在新环境中适应至少3天（12小时光照-黑暗循环，温度18-20 °C）。
- 将动物随机分配至以下组别：常氧组（第1组）、低氧组（第2组）和低氧+7C1/let-7 miRNA组（第3组）。
- 手术器械与血压测量设备准备。
- 通过高压灭菌法对所有手术器械进行灭菌 （图1A）。
- 准备一个临时注射平台，配备自制麻醉鼻罩（图1B）、缝合包（图1C）以及用于肺动脉高压（PAH）实验的设备（
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
麻醉通常会降低血压。因此，使用最低剂量的麻醉以消除对有害刺激产生的运动反应。成功的右心室腔进入可通过不同静脉系统区域内的血流动力学波形变化来观察（图8）。
在本研究中，小鼠被随机分配至常氧（21% O2）组（n = 10）、低氧（10% O2）组（n = 10）或低氧 + 7C1/let-7 治疗组（n = 10）。为了评估 let-7 miRNA 在抑制低氧诱导的肺动脉高压（PAH）发展中的作用，将配制的 7C1/let-7 miRNA 以每周两次、每次 1.5 mg/kg 的剂量通过静脉注射给予 C57BL/6 小鼠，持续 4 周（图 2D）。
暴露于低氧或常氧环境4周后，在闭胸小鼠中测量SBP和RVSP。图9A显示了来自常氧、低氧或低氧+7C1/let-7 miRNA处理组的代表性血压曲线。与常氧对照.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
已建立多种肺动脉高压动物模型，以模拟人类肺血管阻力升高的病理过程。其中，小鼠低氧诱导的肺动脉高压（PAH）模型被广泛用于评估新型实验性PAH疗法的有效性。利用该模型的研究通常需要向小鼠给予化合物。与已发表的其他静脉（IV）注射及有创血流动力学评估方案相比，本方法同时提供了直观的图示和详细的描述。
成功实施该操作并获得准确且可重复的血压测量结果有三个关键步骤。第一，确保注射器针头正确插入颈静脉。颈静脉注射位置错误可能导致皮下注射。第二，确保麻醉深度足够。每只小鼠保持一致的麻醉深度对于获得组间可比较的数据至关重要。麻醉过深可导致血压水平显著下降。除异氟烷吸入麻醉外，腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪是小鼠手术中另一种广泛使用的麻醉方法。这两种方法各有优缺点。与注射用氯胺酮/赛拉嗪相比，异氟烷吸入麻醉具有多项优势，包括起效快、不涉及管制药品、恢复迅速，且更易于控制麻醉深度。其缺点是设备成本较高、气味难闻，以及操作人员可能暴露于废气麻醉气体中。第三，确保导管位于心脏右心室内部。长时间或多次右心室插管失败可导致错误的血压读数。
小鼠的静脉注射主要通.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
K Zsebo、M Simons 和 P-Y Chen 是 VasoRx 公司的科学创始人及股东。M Simons 是 VasoRx 公司科学咨询委员会成员。HJ Duckers 是 VasoRx 公司的员工及股东。其他作者声明不存在竞争利益。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助 P30AR070253 提供的联合生物学联盟微基金（PYC）、心血管医学研究教育基金（PYC）、VasoRx 公司基金（MS）以及 NIH 资助 HL135582（MS）、HL152197（MS）的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-0 普罗烯缝合线包 | Ethicon | 8698G | 用于切口闭合 |
| 8-0 尼龙缝合线包 | AROSurgical Instruments | T06A08N14-13 | 用于结扎 |
| 麻醉诱导室 | VETEQUIP | #941444 | 在动物暴露于麻醉期间固定动物 |
| 导管接口电缆 PEC-4D | Millar | 用于将 Millar Mikro-Tip 导管连接至 PCU-2000 | |
| 活性炭罐过滤器 | VETEQUIP | #931401 | 用于帮助清除 废麻醉 气体 |
| 棉签 | McKesson | 24-106 | 用于在注射部位施加压力以防止出血 |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14059-11 | 手术工具 |
| 胰岛素注射器 28 G | EXEL | 26027 | 用于颈静脉静脉注射 |
| 异氟烷 | COVETRUS | #029405 | 用于小鼠麻醉 |
| LabChart 8 软件 | ADInstruments | 用于数据分析 | |
| Mikro-Tip 压力导管 SPR-1000 (1.0 F) | Millar | 用于有创血压测量 | |
| 25 G 针头 | BD | 305124 | 用于在血管上制造小孔 |
| 氧气控制器 ProOx 氧气传感器 | BioSpherix | E702 | 用于氧气浓度监测 |
| PCU-2000 压力控制单元 | Millar | 用于将 Millar Mikro-Tip 导管连接至 PowerLab 4/35 | |
| PowerLab 4/35 | ADInstruments | 用于数据采集。 研究人员需将 PowerLab 4/35 连接到装有 LabChart 8 软件的个人笔记本电脑以进行操作。 | |
| Prism 8 | GraphPad | 用于统计分析和科学绘图 | |
| 半密封式低氧室 | BioSpherix | 一种为动物模拟高海拔条件的人工环境 | |
| 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15021-15 | 手术工具 |
| 镊子型号 4 | Electron Microscopy Sciences | 0302-4-PO | 手术工具 |
| VasoRx 化合物 7C1/let-7 miRNA | VasoRx, Inc. | 批号 B2-L-16Apr | 静脉注射化合物 |
| VIP 3000 兽用蒸发器 | COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC. | 用于精确输送麻醉剂 |
参考文献
- McLaughlin, V. V., McGoon, M. D. Pulmonary arterial hypertension. Circulation. 114 (1), 1417-1431 (2006).
- Hoeper, M. M., Humbert, M. The new haemodynamic definition of pulmonary hypertension: evidence prevails, finally. European Respiratory Journal. 53....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
