低氧诱导小鼠肺动脉高压模型中的多次静脉推注给药与侵入性血流动力学评估

摘要

本方案提供了在小鼠中进行多次静脉推注给药及有创血流动力学监测的逐步操作流程。研究人员可利用本方案开展未来针对肺动脉高压的治疗性化合物筛选。

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种主要累及肺部小肺动脉的进行性致死性疾病。目前尚无治愈PAH的方法，因此发现可用于治疗PAH的新化合物至关重要。小鼠低氧诱导PAH模型是PAH研究中广泛使用的一种模型，该模型可重现人类PAH第3组疾病的临床表现，是评估新型实验性PAH疗法有效性的关键研究工具。利用该模型开展的研究通常需要在小鼠体内给药。对于需直接注入血液的化合物，优化静脉（IV）给药是实验操作中的关键环节。理想的静脉注射系统应能够在设定的时间过程中实现多次给药。尽管小鼠低氧诱导PAH模型在许多实验室中被广泛应用，但在该模型中实施多次静脉推注给药及有创血流动力学评估在技术上仍具挑战性。本方案中，我们将提供逐步操作指南，介绍如何实施多次静脉推注给药 通过 小鼠颈静脉穿刺及动脉和右心室插管用于缺氧诱导的肺动脉高压小鼠模型的血流动力学评估

引言

肺动脉高压（PAH）定义为静息状态下平均肺动脉收缩压超过20 mmHg^1,2。它是一种进行性且致命的疾病，其特征是肺动脉压力持续升高，导致右心室超负荷，最终因右心室衰竭而死亡¹。目前，肺动脉高压尚无治愈方法。

使用肺动脉高压动物模型对于评估实验性肺动脉高压（PAH）疗法的有效性至关重要。在这些模型中，小鼠低氧诱导的PAH模型为人类PAH第3类疾病的发病机制提供了关键见解^3,4。利用该模型开展的研究通常需要向小鼠给药，以评估新化合物的有效性和安全性。因此，研究人员需要一份详细的实验操作流程，用于化合物给药和血流动力学测量，以确保从开始到结束整个过程中给药的一致性以及血压测量的可重复性。

已有文献报道了静脉（IV） 注射和血压测量的方法^5,6。然而，这些方法缺乏直观的图示和详细的描述。本文展示了成功实施静脉推注以及准确测量和记录体循环和右心室血压的关键步骤。本文所述的操作流程对于致力于通过静脉给药平台开发肺动脉高压（PAH）治疗方法的研究人员而言，是一项重要的资源。

方案

所有动物实验均在耶鲁大学机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。

1. 动物、器械、血压测量设备和低氧舱的准备

1. 动物适应性饲养。
   注意：本研究使用的实验动物为雄性、8周龄、体重25-27 g的C57BL/6小鼠。在估算实验所需动物数量时，应考虑多种因素，包括手术相关死亡率、意外手术并发症以及突发性非预期死亡。每组至少使用10只小鼠，以确保达到统计学效力，避免统计效能不足的研究。
   1. 收到动物后，将其饲养于通风的啮齿类动物笼具中（每笼5只动物为一组），提供合适的垫料、啮齿类饲料和饮水。让动物在新环境中适应至少3天（12小时光照-黑暗循环，温度18-20 °C）。
   2. 将动物随机分配至以下组别：常氧组（第1组）、低氧组（第2组）和低氧+7C1/let-7 miRNA组（第3组）。
2. 手术器械与血压测量设备准备。
   1. 通过高压灭菌法对所有手术器械进行灭菌 （图1A）。
   2. 准备一个临时注射平台，配备自制麻醉鼻罩（图1B）、缝合包（图1C）以及用于肺动脉高压（PAH）实验的设备（图1D-F）。
3. 肺动脉高压（PAH）诱导的实验设置。
   1. 安装N₂气罐、氧气传感器和半密闭式低氧舱（图2A）。
   2. 将氧气传感器的设定值设为10% O₂，并让系统达到稳态（图2B、C）。
   3. 将低氧组（第2组）和低氧+7C1/let-7 miRNA组（第3组）动物置于低氧环境（10% O₂）中持续3周。低氧暴露3周后，将动物转移至常氧条件下饲养1周（图2D）。常氧组（第1组）动物在常氧条件下饲养4周。
      注意：(1) 3周低氧暴露后接1周常氧是建立肺动脉高压及右心室心力衰竭的成熟方法⁷。氧气传感器检测半密闭低氧舱内的O₂浓度，并通过气体灌注管输入N₂气体以调节浓度。
   4. 在整个实验期间（3周）每日检查动物状况。若动物出现明显痛苦迹象（如显著体重下降或呼吸困难），应咨询兽医。对于处于严重痛苦状态且需实施安乐死的动物，应将其从研究中剔除。
      注意：低氧暴露会导致小鼠体重下降。体重减少10%通常被视为肺动脉高压形成的可靠指标。
   5. 避免频繁或长时间打开低氧舱。在进行笼具清洁、补充饲料、更换水瓶或给药时，每周打开低氧舱的总时间不得超过1小时。

2. 静脉推注  通过 颈静脉

1. 小鼠准备与麻醉
   1. 从低氧舱中取出低氧（第2组）和低氧+7C1/let-7 miRNA（第3组）小鼠笼具，轻柔地将动物从笼中取出。
      注意：7C1/let-7 miRNA 的给药方案（1.5 mg/kg，静脉注射/次）为每周两次，连续治疗 4 周。建议研究人员在进行静脉注射时，将低氧组和低氧+化合物处理组的动物笼具一并移出低氧舱，以确保所有动物在相同时间间隔内接受同等程度的低氧暴露。
   2. 使用精密天平称量小鼠体重并记录其重量（图3A).
   3. 将小鼠放入与麻醉蒸发器相连的麻醉诱导室中，并关闭盖子（图3B）。提供保温支持，并在麻醉过程中向双眼涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。将小鼠暴露于3%异氟烷，直至失去意识（图3C- D).
   4. 将小鼠从容器中取出，从下颌开始向头侧方向，至胸骨中段向尾侧方向剃除毛发；在侧面，从下颌角开始，沿颈部两侧向肩部方向剃除毛发。图3E).
   5. 将异氟烷麻醉的小鼠仰卧位（腹部朝上）放置在解剖显微镜下的注射平台上，维持麻醉状态 通过 使用带有1.5%异氟烷的鼻罩，并用胶带轻轻固定四肢以 immobilize 身体（图 3F).
   6. 使用直头镊子施加有害刺激（例如脚趾夹捏），以确保达到足够的麻醉水平。麻醉状态下的小鼠在手术前及整个手术过程中均不应对刺激产生反应。
2. 注射剂制备。
   1. 在无菌条件下配制单次注射剂量为1.5 mg/kg的药液。
      注意：将注射用化合物恢复至室温（RT），因为注射低温物质可能引起小鼠不适并导致体温下降（前提是该操作不会破坏化合物）。本研究中使用的7C1/let-7 miRNA化合物的最佳剂量和给药持续时间基于先前的文献报道。^8,9.
   2. 用一次性无菌注射器抽取待注射的液体体积。将注射器竖直握住，推动活塞以排出注射器内的空气。注射器不得重复使用。
   3. 将注射体积限制在25 g小鼠200 μL以内，以减少动物发生血液稀释及心脏异常效应的概率。若需要更大体积，可将注射物分为两次注射，间隔10 min。
3. 准备小鼠以进行静脉注射。
   1. 用聚维酮碘溶液和70%乙醇交替进行三轮擦拭，每轮均轻轻擦洗手术区域。 手术前30分钟皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）。
   2. 使用手术刀片在颈部中线右侧约0.5 cm处做一纵向切口图3G).
   3. 使用镊子分离肌肉和脂肪组织，以定位右侧颈外静脉（图 3H).
      注意：每次注射时应轮换注射部位，以避免瘢痕形成。
   4. 使用高倍物镜以便清晰观察注射区域（图3I).
4. 静脉注射
   1. 将一支28 G无菌针头插入颈静脉，针尖斜面朝上（图3J，K).
      注意：尾静脉注射是颈静脉注射的一种替代方法。然而，由于小鼠尾静脉深度、尾部皮肤颜色和皮肤硬度存在个体差异，该技术在重复给药时操作难度较大。
   2. 缓慢推动注射器活塞，将化合物注入静脉。针头在静脉内保留额外10秒，以防止注入物回流。图 3L).
      注意：蓝色染料有助于清晰观察注射过程。注射待测物质时，请勿加入染料。注射不准确会导致蓝色染料在静脉注射部位周围积聚。
   3. 移除针头，并用棉签按压注射部位以防止出血（图3M).
   4. 用5-0缝线缝合皮肤（图3N). 术后将动物转移至温暖、清洁、干燥的区域，并皮下注射美洛昔康（1 mg/kg，每日一次）。将动物置于清洁的恢复笼中，笼内不使用垫料，底部铺上纸巾。 
      注意：小鼠返回恢复笼后，应在5分钟内从麻醉状态清醒并恢复意识。需监测小鼠是否有痛苦或不适的迹象。
   5. 将动物放回其饲养笼中，并将小鼠笼放回低氧舱内。
      ​注意：从麻醉小鼠到完成颈静脉注射的整个操作过程，单名实验人员约需10–15分钟。为缩短小鼠暴露于常氧环境的时间，建议至少由两名研究人员协作完成颈静脉注射操作。

3. 血压测量

1. 准备血压测量仪器。
   1. 将1.0 F导管尖端浸入37 °C预热的PBS中，至少30分钟，然后再进行血流动力学测量（图4A).
   2. 测量导管插入点至预期导管尖端位置的距离。例如，小鼠升主动脉至颈部中点的距离约为1-1.2 cm；右心室至颈部中点的距离约为2.3-2.8 cm。
   3. 标记两条导管距离刻度，以直观显示插入深度（图4B).
   4. 将导管连接至压力传感器，将压力传感器连接至数据采集设备的1号输入通道，打开压力-容积控制单元，并启动数据采集血压分析软件。新建一份血压分析文档，并将1号通道设置为压力通道。
   5. 根据制造商的协议进行压力校准。让整个装置稳定至少 5 分钟（图 4C).
   6. 在血压分析软件中，选择 单位换算 来自 通道 1 下拉菜单图4D，红色箭头).
   7. 设置默认的单位换算值（图4E).
      注意：血压的单位为毫米汞柱（mmHg）。压力控制单元输出的标准压力为每100 mmHg对应1 V。25 mmHg对应0.25 V输出，100 mmHg对应1 V输出。
2. 准备小鼠以进行血压测量操作。
   1. 用3%异氟烷麻醉小鼠 通过鼻罩吸入
   2. 将兽用眼膏直接涂抹于小鼠眼部表面，以防止角膜干燥，因为小鼠在麻醉状态下无法闭合眼睛。在麻醉状态下剃除小鼠颈部的毛发。
   3. 擦洗剃毛区域 用聚维酮碘溶液和70%乙醇棉签交替擦拭三轮。将麻醉后的小鼠仰卧置于解剖显微镜下的注射平台上。将小鼠的鼻部放入鼻罩以在整个手术过程中维持麻醉（1.5%异氟烷）。
   4. 测试麻醉小鼠对有害刺激的运动反应。在手术前和手术过程中，麻醉小鼠应对有害刺激无反应。
      注意：吸入性麻醉剂（异氟烷）和注射性麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪）均可降低血压。通常情况下，异氟烷吸入麻醉对血压的降低作用较氯胺酮/赛拉嗪轻微，因此异氟烷是优于氯胺酮/赛拉嗪的吸入性麻醉剂。达到适当的麻醉深度对于获得准确且可重复的血流动力学测量结果至关重要。研究人员需保持每只小鼠的麻醉深度恒定。
3. 升主动脉插管
   1. 使用直头镊子施加有害刺激（例如足趾挤压），以确保达到足够的麻醉水平。 从下颌至胸骨做一正中皮肤切口（图 5A).
   2. 分离唾液腺并暴露气管（图5B).
   3. 使用镊子清除血管周围的软组织，以暴露右侧颈总动脉和右侧颈外静脉图5C).
   4. 在操作颈动脉时，向腔内注入0.5 mL PBS以减缓血管痉挛的发展。
   5. 仔细分离右侧颈动脉约5毫米的一段。在血管下方放置一片无菌白纸作为背景，以增强动脉的可见度。图 5D).
      注意：仔细将迷走神经（白色）与动脉分离，确保不切断或损伤神经或动脉。
   6. 使用8-0缝线在血管颅端打一个永久结（#1）以闭合该端图5E).
   7. 打第一个松结（#2）以暂时阻断主动脉血流，然后在前两针缝线之间打第二个松结（#3）图5F第二个松结（#3）将在导管放置后用于快速固定导管。
   8. 使用25 G针头，在第3和第1号结扎线之间的血管沿线刺一个小孔，孔径需足够大以通过导管图 5G).
      注意：颈动脉将含氧血从心脏输送至全身，其内部压力很高。若颈动脉被切断，高压会导致血液喷出图 5H).
   9. 将导管从尖端处1.5英寸位置握住，轻柔地将导管尖端经动脉上的孔（X标记处）插入。收紧位于导管与血管周围的中间缝合结（#3），松紧度应确保导管仍可顺利通过。图 5I- J).
      注意：此步骤需要练习。该步骤可能发生的并发症包括导管插入部位出血和血管痉挛。当发生出血时，动脉失血会减少血容量，导致全身血压严重下降。由于情况严重，动物已达到人道终点，必须实施安乐死。 对于机械性诱发的血管痉挛，通常发生在导管插入过程中，由血管持续收缩引起。这会导致血管开口变小，阻碍导管向颈动脉推进。切勿在遇到阻力时强行推进导管。当遇到中度或重度血管痉挛阻力时，可稍等片刻后再次尝试，或使用更细的导管（例如 1.0 F）。经验丰富的显微外科医生可实现接近 100% 的升主动脉插管成功率。
   10. 当导管穿过第一个松结（#2）且传感器端通过后，将第二个松结（#3）扎紧以固定导管，然后轻轻松开第一个松结（#2）图 5K，L).
   11. 根据导管上的标记，继续将导管插入至升主动脉图4B）直至压力分析显示动脉血压波形（图 5M）。使用数据采集系统和软件记录系统性血压（SBP）数据。
   12. 松开中间的缝合结（#3），以便拔出导管（图5N).
   13. 在将导管从颈动脉拔出之前，先将中间的缝合结（#3）绑在血管周围。图 5O-).
   14. 将导管置于 PBS 中。
4. 右心导管检查
   1. 仔细分离右侧颈外静脉周围的结缔组织，并使用8-0缝线结扎所有细小分支（蓝色箭头）图6A).
      注意：进行右心导管插入术时，通常经由以下途径进入心脏 通过 右侧颈静脉
   2. 使用8-0缝线，打一个永久结（#1），结扎血管的颅端图6B）。然后，在血管的尾端打一个松结（#2）图6C).
   3. 使用25 G针头在永久结（#1）近端打一个小孔（图6D).
      注意：颈静脉将缺氧血输送至心脏，其内压力较低。若颈静脉被切断，血液不会喷出图 6D，E).
   4. 握住导管，将导管插入静脉切口（X标记处）图6E）并收紧尾侧结（#2），将其结扎在导管和血管周围（图6F).
   5. 缓慢而轻柔地将导管推入右心。根据导管上的刻度标记监测导管尖端的插入深度（图4B).
      注意：由于右心室复杂的解剖结构，在闭胸小鼠中评估右心室收缩压（RVSP）具有较大挑战性。该步骤需要较高的专业技术水平和大量实践经验。在经验丰富的显微外科操作者手中，右心室插管的成功率可接近90%。
   6. 根据软件中的压力波形追踪评估导管尖端位置。当导管尖端位于右心室时，监测仪将显示典型的右心室收缩压（RVSP）波形 tracing（图6G，H).
      注意：当肺动脉压力曲线形状异常（例如出现尖峰状曲线）时，提示导管位置不正确。可通过轻轻回撤导管少许，然后缓慢将其向前推进至右心室更中央的位置，以调整导管位置。为避免在研究数据中产生伪影，操作者应避免长时间（不超过1分钟）或重复多次（不超过两次）尝试右心室插管。
   7. 保持导管静止不动，并采集5分钟数据。
   8. 记录完成后，小心地将导管拔出，并将尾侧结（#2）绑在血管周围图6I将导管放回 PBS 溶液中。
      ​注意：实验结束后，根据制造商说明书，使用1%消化酶溶液清洗导管。除了评估血流动力学状态外，研究人员可收获心脏和肺组织，用于肺动脉高压（PAH）的组织病理学检查。为确保多次静脉推注给药的有效性，研究人员可分离肺内皮细胞并检测let-7 miRNA水平。

4. 血压数据的分析

1. 检查血压记录。
   1. 打开血压分析软件数据文件（PAH JOVE.adicht）。
   2. 在通道1中，选择代表压力信号的区域，并将波形光标置于峰值处（X标记），以测量压力幅度（图7A）。
   3. 确定压力波的最大幅度，该值代表收缩压（图7A，红色箭头）。
   4. 按下 Shift + Command + 3（Mac系统）或 Windows + Shift + S（Windows系统），截取图像中的目标区域（图7B 灰色区域），并将其粘贴至图形文件中。
2. 血压数据的统计分析。
   1. 将每只小鼠的血压数据输入统计分析软件。
   2. 对两个研究组（常氧组 vs. 低氧组；低氧组 vs. 低氧+7C1/let-7 miRNA组）进行非配对样本Student's t-检验。若均值差异的p值<0.05，则认为差异具有统计学意义。

结果

麻醉通常会降低血压。因此，使用最低剂量的麻醉以消除对有害刺激产生的运动反应。成功的右心室腔进入可通过不同静脉系统区域内的血流动力学波形变化来观察（图8）。

在本研究中，小鼠被随机分配至常氧（21% O₂）组（n = 10）、低氧（10% O₂）组（n = 10）或低氧 + 7C1/let-7 治疗组（n = 10）。为评估 let-7 miRNA 在抑制低氧诱导的肺动脉高压（PAH）发展中的作用，将配制的 7C1/let-7 miRNA 以每周两次、每次 1.5 mg/kg 的剂量通过静脉注射给予 C57BL/6 小鼠，持续 4 周（图 2D）。

暴露于低氧或常氧环境4周后，在闭胸小鼠中测量了SBP和RVSP。图9A展示了来自常氧、低氧或低氧+7C1/let-7 miRNA处理组的代表性血压曲线。与常氧对照...

讨论

已建立多种肺动脉高压动物模型，以模拟人类肺血管阻力升高的病理过程。其中，小鼠低氧诱导的肺动脉高压（PAH）模型被广泛用于评估新型实验性PAH疗法的有效性。利用该模型的研究通常需要向小鼠给予化合物。与已发表的其他静脉（IV）注射及有创血流动力学评估方案相比，本方法同时提供了直观的图示和详细的描述。

成功实施该操作并获得准确且可重复的血压测量结果有三个关键步骤。第一，确保注射器针头正确插入颈静脉。颈静脉注射位置错误可能导致皮下注射。第二，确保麻醉深度足够。每只小鼠保持一致的麻醉深度对于获得组间可比较的数据至关重要。麻醉过深可导致血压水平显著下降。除异氟烷吸入麻醉外，腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪是小鼠手术中另一种广泛使用的麻醉方法。这两种方法各有优缺点。与注射用氯胺酮/赛拉嗪相比，异氟烷吸入麻醉具有多项优势，包括起效快、不涉及管制药品、恢复迅速，且更易于控制麻醉深度。其缺点是设备成本较高、气味难闻，以及操作人员可能暴露于废气麻醉气体中。第三，确保导管位于心脏右心室内部。长时间或多次右心室插管失败可导致错误的血压读数。

小鼠的静脉注射主要通...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 普罗烯缝合线包	Ethicon	8698G	用于切口闭合
8-0 尼龙缝合线包	AROSurgical Instruments	T06A08N14-13	用于结扎
麻醉诱导室	VETEQUIP	#941444	在动物暴露于麻醉期间固定动物
导管接口电缆 PEC-4D	Millar		用于将 Millar Mikro-Tip 导管连接至 PCU-2000
活性炭罐过滤器	VETEQUIP	#931401	用于帮助清除 废麻醉 气体
棉签	McKesson	24-106	用于在注射部位施加压力以防止出血
精细剪刀	Fine Science Tools	14059-11	手术工具
胰岛素注射器 28 G	EXEL	26027	用于颈静脉静脉注射
异氟烷	COVETRUS	#029405	用于小鼠麻醉
LabChart 8 软件	ADInstruments		用于数据分析
Mikro-Tip 压力导管 SPR-1000 (1.0 F)	Millar		用于有创血压测量
25 G 针头	BD	305124	用于在血管上制造小孔
氧气控制器 ProOx 氧气传感器	BioSpherix	E702	用于氧气浓度监测
PCU-2000 压力控制单元	Millar		用于将 Millar Mikro-Tip 导管连接至 PowerLab 4/35
PowerLab 4/35	ADInstruments		用于数据采集。 研究人员需将 PowerLab 4/35 连接到装有 LabChart 8 软件的个人笔记本电脑以进行操作。
Prism 8	GraphPad		用于统计分析和科学绘图
半密封式低氧室	BioSpherix		一种为动物模拟高海拔条件的人工环境
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15021-15	手术工具
镊子型号 4	Electron Microscopy Sciences	0302-4-PO	手术工具
VasoRx 化合物 7C1/let-7 miRNA	VasoRx, Inc.	批号 B2-L-16Apr	静脉注射化合物
VIP 3000 兽用蒸发器	COLONIAL MEDICAL SUPPLY CO., INC.		用于精确输送麻醉剂