用于组织工程的尺寸可控且无乳液的壳聚糖-京尼平微凝胶的制备

摘要

本方案描述了一种基于壳聚糖-京尼平的非乳液法微凝胶制备方法。这些微凝胶的尺寸可精确调控，并具有pH依赖性溶胀特性以及可降解性 体内, 并可负载治疗分子，以持续的方式随时间逐渐释放，使其在组织工程应用中具有高度相关性。

摘要

壳聚糖微凝胶因其广泛的应用前景、低成本以及低免疫原性，在组织工程领域备受关注。然而，传统的壳聚糖微凝胶通常采用乳液法制备，该方法需要使用有机溶剂冲洗，而有机溶剂具有毒性且对环境有害。本实验方案介绍了一种快速、无细胞毒性、非乳液法的壳聚糖-京尼平微凝胶制备方法，无需有机溶剂冲洗步骤。文中所述微凝胶可实现精确的尺寸控制，具有生物分子持续释放的特性，因此在组织工程、生物材料及再生医学领域具有高度相关性。壳聚糖通过京尼平交联形成水凝胶网络，随后经注射器滤器挤出以生成微凝胶。微凝胶可通过过滤获得不同粒径范围，且表现出pH依赖性溶胀行为，并能随时间发生酶促降解。这些微凝胶已在大鼠生长板损伤模型中得到应用，实验证明其可促进软骨组织修复，并在体内28天时实现完全降解。in vivo 由于其成本低、操作便捷，且使用细胞相容性材料易于制备，此类壳聚糖微凝胶为组织工程提供了一项令人振奋且独特的技术。

引言

生长板，也称为骨骺板（physis），是位于长骨末端的软骨结构，负责儿童时期的骨骼生长。如果生长板受到损伤，可能会形成一种称为"骨性桥接"的修复组织，从而干扰正常生长，导致生长缺陷或成角畸形。流行病学数据显示，所有儿童骨骼损伤中有15%–30%与生长板相关。在这些损伤中，高达30%会发生骨性桥接的形成，使得生长板损伤及其相关治疗成为一个重要的临床问题^1,2,3,4。当出现骨性桥接时，最常见的治疗方式是切除骨性桥接组织，并植入间隔材料，例如硅胶或脂肪组织⁵。然而，接受骨性桥接切除手术的患者往往预后不佳，因为目前尚无任何治疗方法能够完全修复受损的生长板^6,7,8。鉴于这些局限性，迫切需要开发有效的治疗策略，以预防骨性桥接的形成，并促进健康骨骺软骨组织的再生。

水凝胶微粒（或称微凝胶）近年来因其可作为可注射支架并实现治疗药物的持续释放而受到关注^9....

方案

所有动物实验程序均经科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会批准。本研究采用6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠生长板损伤模型的建立参照先前发表的文献³⁰。

1. 壳聚糖聚合物的制备

1. 从商业渠道获取纯化并经冷冻干燥的低分子量（LMW）壳聚糖（参见 材料表).
2. 加入495 mL双蒸水（ddH₂O）₂将 O 和一个搅拌子加入 1 L 烧杯中。加入 5 g 壳聚糖（步骤 1.1），充分混合。
   注意：壳聚糖在生理 pH 条件下的水溶液中仅微溶，因此在此步骤中壳聚糖不易溶解。
3. 向上述制备的壳聚糖溶液中加入5 mL冰醋酸。
4. 在50 °C水浴中，盖上表面皿，以300 rpm转速搅拌18小时。
5. 使用布氏烧瓶和漏斗，将壳聚糖溶液依次通过孔径逐渐减小的滤纸进行过滤：22 µm、8 µm 和 2.7 µm（参见 材料表).
6. 将过滤后的壳聚糖溶液加入纤维素透析管中（参见 材料表）并置于去离子水中透析₂室温下孵育4天，期间更换ddH₂O₂每天一次。
   注意：使用超纯 ddH₂O₂

结果

壳聚糖微凝胶的成功制备依赖于京尼平与壳聚糖之间的交联反应，特别是壳聚糖聚合物链上的氨基参与该反应。与其他微凝胶制备技术相比，该方法无需使用乳液或溶剂洗涤，且可在廉价设备条件下快速、简便地完成。微凝胶成功制备的一个显著标志是壳聚糖与京尼平混合后，溶液颜色由乳白色明显转变为深蓝色。京尼平与含氨基化合物（如壳聚糖或其他蛋白质）之间的交联反应在文献中已有充分表征³⁴。简而言之，该交联机制被认为是壳聚糖的氨基对京尼平进行亲核攻击的过程，其中京尼平作为二醛，形成稳定的缩合产物³⁵。这些短链状的稳定缩合京尼平分子在壳聚糖聚合物之间充当交联桥。交联反应导致溶液变为深蓝色，这可能是由于亲核攻击引发开环反应后，中间产物发生氧自由基诱导的聚合与脱氢反应所致³⁶。

微凝胶经过滤并重悬于1:1的水稀释液后，可便捷地应用于多种生物材料领域。近期已有研究报道，采用这种无乳液法合成的壳聚糖微凝胶促进生长板损伤后的软骨再生。微凝胶按本文所述方法制备，可保持空载状态，或负载S.......

讨论

近年来，微凝胶因其在药物递送或细胞封装等多种用途上的高度适用性而受到广泛研究⁹。在组织工程领域，微尺度生物材料结构的制备简便性具有重要意义，因为它使研究人员能够在特定的尺寸和时间尺度上开发基于水凝胶的策略。然而，大多数制备壳聚糖微凝胶的方法需要昂贵的设备和试剂、乳液体系或具有细胞毒性的溶剂冲洗步骤，从而限制了其向临床应用的转化^{15,16,17,18,19,20}。这些微凝胶在制备上具有显著的便利性，无需使用乳液技术或溶剂冲洗。此外，这些微凝胶保留了组织工程结构所需的理想特性，如pH依赖性溶胀与药物负载能力、可调控的降解行为以及治疗药物的持续释放。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	SigmaAldrich	AX0073
BD 鲁尔锁注射器	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner 漏斗	Fisher Scientific	FB966F	直径 100 mm
壳聚糖（低分子量）	SigmaAldrich	448869	脱乙酰度 75-80%
透析膜管	Fisher Scientific	08-670-5C	截留分子量 3500
乙醇	SigmaAldrich	493538
京尼平	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i 培养箱	ThermoFisher	50116047
封口膜（Parafilm）	Fisher Scientific	13-374-12
重组人 SDF-1α	Peprotech	300-28A
重组人 TGF-β3	Peprotech	100-36E
Whatman 540 型滤纸	SigmaAldrich	Z241547	孔径 8 mm
Whatman 541 型滤纸	SigmaAldrich	WHA1541055	孔径 22 mm
Whatman 542 型滤纸	SigmaAldrich	WHA1542185	孔径 2.7 mm
金属网筛	McMaster-Carr	9317T86	100 目筛网