用于组织工程的尺寸可控且无乳液的壳聚糖-京尼平微凝胶的制备

摘要

本方案描述了一种基于壳聚糖-京尼平的非乳液法微凝胶制备方法。这些微凝胶的尺寸可精确调控，并具有pH依赖性溶胀特性以及可降解性 体内, 并可负载治疗分子，以持续的方式随时间逐渐释放，使其在组织工程应用中具有高度相关性。

摘要

壳聚糖微凝胶因其广泛的应用前景、低成本以及低免疫原性，在组织工程领域备受关注。然而，传统的壳聚糖微凝胶通常采用乳液法制备，该方法需要使用有机溶剂冲洗，而有机溶剂具有毒性且对环境有害。本实验方案介绍了一种快速、无细胞毒性、非乳液法的壳聚糖-京尼平微凝胶制备方法，无需有机溶剂冲洗步骤。文中所述微凝胶可实现精确的尺寸控制，具有生物分子持续释放的特性，因此在组织工程、生物材料及再生医学领域具有高度相关性。壳聚糖通过京尼平交联形成水凝胶网络，随后经注射器滤器挤出以生成微凝胶。微凝胶可通过过滤获得不同粒径范围，且表现出pH依赖性溶胀行为，并能随时间发生酶促降解。这些微凝胶已在大鼠生长板损伤模型中得到应用，实验证明其可促进软骨组织修复，并在体内28天时实现完全降解。in vivo 由于其成本低、操作便捷，且使用细胞相容性材料易于制备，此类壳聚糖微凝胶为组织工程提供了一项令人振奋且独特的技术。

引言

生长板，也称为骨骺板（physis），是位于长骨末端的软骨结构，负责儿童时期的骨骼生长。如果生长板受到损伤，可能会形成一种称为"骨性桥接"的修复组织，从而干扰正常生长，导致生长缺陷或成角畸形。流行病学数据显示，所有儿童骨骼损伤中有15%–30%与生长板相关。在这些损伤中，高达30%会发生骨性桥接的形成，使得生长板损伤及其相关治疗成为一个重要的临床问题^1,2,3,4。当出现骨性桥接时，最常见的治疗方式是切除骨性桥接组织，并植入间隔材料，例如硅胶或脂肪组织⁵。然而，接受骨性桥接切除手术的患者往往预后不佳，因为目前尚无任何治疗方法能够完全修复受损的生长板^6,7,8。鉴于这些局限性，迫切需要开发有效的治疗策略，以预防骨性桥接的形成，并促进健康骨骺软骨组织的再生。

水凝胶微粒（或称微凝胶）近年来因其可作为可注射支架并实现治疗药物的持续释放而受到关注⁹。由于其高度可调性和良好的生物相容性，微凝胶也非常适合用于生物活性因子或细胞的包封。微凝胶可由多种材料制成，包括聚乙二醇（PEG）等合成聚合物，以及海藻酸盐或壳聚糖等天然聚合物^10,11,12。 研究表明，壳聚糖在组织工程中具有多种有益作用，例如能够破坏革兰氏阴性菌的外膜，从而具备固有的抗菌活性^13,14。此外，壳聚糖成本较低、可与细胞相互作用，并且因其分子结构中含有氨基而易于进行化学修饰。基于壳聚糖的微凝胶为药物递送和材料信号传导提供了一种有前景的生物材料策略，既可促进组织再生，又能防止细菌感染。然而，目前壳聚糖微凝胶的制备通常采用多种技术，这些方法往往需要特殊设备、乳液工艺或具有细胞毒性的溶剂冲洗步骤。例如，一些研究采用基于乳液的方法制备壳聚糖微凝胶，但这些方案需要使用溶剂冲洗和具有细胞毒性的交联剂，可能限制其在临床环境中的转化应用^15,16。其他研究则采用微流控或电喷雾技术制备壳聚糖微凝胶，但这些方法需要专用设备、复杂的前期准备和专业培训^17,18。壳聚糖微凝胶也常通过将交联剂逐滴加入壳聚糖溶液的方式制备；然而，该方法高度依赖于溶液黏度、聚合物浓度和滴加流速，难以精确控制微凝胶的粒径及其分散性^19,20。相比之下，本文所述的微凝胶制备方法无需特殊设备或溶剂冲洗，因此几乎可在任何实验室或条件下进行制备。因此，这类微凝胶是一种高度相关的生物材料，可作为快速、低成本且易于生产的药物递送载体，适用于多种应用场景。

通过调控微凝胶的组成和材料特性，研究人员能够精确控制细胞微环境，从而以材料依赖的方式引导细胞行为。微凝胶可单独使用，也可与整体性生物材料系统结合，赋予特定功能，例如生物活性因子的长效释放，或对内源性或外源性细胞进行精确的空间信号调控。生物材料与微凝胶已成为治疗生长板损伤的有前景的策略。目前已有大量研究致力于开发基于海藻酸盐和壳聚糖的生物材料用于生长板损伤的治疗^{21,22,23,24,25}。由于生长板骨化和骨骼延长具有动态的时间特性，骨桥形成机制尚未完全阐明。 因此，已建立多种动物模型，以更深入地阐明软骨内骨化和骨桥形成的机制，例如大鼠、兔和绵羊模型^26,27,28。其中一种模型为大鼠生长板损伤模型，该模型通过在大鼠胫骨上制造钻孔缺损，可稳定且可重复地形成骨桥，并模拟人类生长板三个区域的损伤情况^29,30。已有多种基于生物材料的治疗策略通过该模型进行了测试。此外，研究人员已开发出两种不同的壳聚糖微凝胶制备方法，可作为可注射的生物材料系统，实现治疗药物的持续释放^10,31。这些微凝胶已在大鼠骨骺损伤模型中应用，在释放SDF-1a和TGF-b3时表现出更优的软骨再生效果³¹。本实验方案中所述技术即为上述壳聚糖微凝胶的制备方法，其可广泛应用于多种组织工程领域。例如，近期研究已利用温敏性或磁响应性壳聚糖微凝胶实现肿瘤药物的可控递送^32,33。

方案

所有动物实验程序均经科罗拉多大学丹佛分校机构动物护理和使用委员会批准。本研究采用6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠生长板损伤模型的建立参照先前发表的文献³⁰。

1. 壳聚糖聚合物的制备

1. 从商业渠道获取纯化并经冷冻干燥的低分子量（LMW）壳聚糖（参见 材料表).
2. 加入495 mL双蒸水（ddH₂O）₂将 O 和一个搅拌子加入 1 L 烧杯中。加入 5 g 壳聚糖（步骤 1.1），充分混合。
   注意：壳聚糖在生理 pH 条件下的水溶液中仅微溶，因此在此步骤中壳聚糖不易溶解。
3. 向上述制备的壳聚糖溶液中加入5 mL冰醋酸。
4. 在50 °C水浴中，盖上表面皿，以300 rpm转速搅拌18小时。
5. 使用布氏烧瓶和漏斗，将壳聚糖溶液依次通过孔径逐渐减小的滤纸进行过滤：22 µm、8 µm 和 2.7 µm（参见 材料表).
6. 将过滤后的壳聚糖溶液加入纤维素透析管中（参见 材料表）并置于去离子水中透析₂室温下孵育4天，期间更换ddH₂O₂每天一次。
   注意：使用超纯 ddH₂O₂最后一次更换的水。
7. 将透析后的壳聚糖溶液转移至烧杯中，用1 M NaOH调节pH至8.0。
8. 将壳聚糖分装至离心管中，于4000 x g 室温下孵育5分钟。
9. 将上清液倒入废液处理系统，并用 ddH₂O 重新悬浮壳聚糖₂O，重复2次。
10. 冷冻后冻干壳聚糖沉淀。
    1. 每天取出冻干产品并记录质量。
       ​注意：当冻干产物的质量不再发生变化时，表明产物已完全干燥，可于 -20 °C 保存至使用。

2. 壳聚糖水凝胶的制备

1. 向一个10 mL鲁尔锁型注射器中加入2 mL 6%乙酸和120 mg纯化壳聚糖（步骤1），制成6% w/v壳聚糖溶液。
2. 使用雌-雌鲁尔锁接头将一个鲁尔锁注射器连接到另一个相同的注射器上，来回混合溶液30秒，或直至壳聚糖在乙酸中完全溶解。
3. 交联前，可根据需要向壳聚糖溶液中添加任何治疗剂或生物活性物质。在本研究中，添加了200 ng的SDF-1a和TGF-b3（参见 材料表) 被加入到微凝胶中。
   注意：SDF-1a 和 TGF-b3 是与生长板组织再生相关的生物活性因子。SDF-1a 可促进间充质干细胞向缺损部位迁移，而 TGF-b3 作为软骨诱导因子，可诱导这些干细胞向软骨细胞谱系分化。³¹. 
   注意：在注射器之间再次混合壳聚糖，以充分混入治疗剂。
4. 制备100 mM的京尼平交联剂储备液（参见 材料表) 于100%乙醇中。
5. 向含有壳聚糖的注射器中加入100 µL制备好的京尼平溶液（步骤2.4），再次在注射器之间来回混合30秒。
6. 将混合物从注射器中推注至35 mm培养皿上，用石蜡膜覆盖，在37 °C湿润环境中孵育过夜。
   注意：溶液将变为深蓝色，表明壳聚糖与京尼平之间已发生交联反应，从而形成壳聚糖微凝胶。
7. 按照以下步骤过滤制备好的壳聚糖微凝胶。
   1. 用刮勺轻轻将水凝胶破碎成较小的碎片。
      注意：组织块应足够小，以便转移至10 mL注射器的后端，直径约为1-2 cm。
   2. 将所需孔径大小的滤器放入一支洁净的10 mL注射器后端。
      注：微凝胶的典型尺寸范围为50-200 µm。
   3. 将破碎的胶块转移至装有滤器的注射器中，加入6 mL ddH₂O₂O.
      ​注意：壳聚糖凝胶在水相介质中会显著溶胀，因此凝胶体积将发生明显变化。
   4. 连接注射器 通过 一个鲁尔锁接头连接至另一个洁净的10 mL注射器。
   5. 用带有滤膜的注射器将凝胶与水的混合物推出，以制备指定最大直径的微凝胶。
      1. 第一次过滤后，打开装有滤膜的注射器后端，将混合物挤回该注射器中。
      2. 更换注射器后端，再次将混合物用力通过滤器。
      3. 重复过滤5-6次，或直至滤器阻力明显减小。
8. 冲洗并纯化过滤后的微凝胶。
   1. 将过滤后的凝胶混合物转移至一个50 mL锥形管中，用ddH₂O定容至20 mL₂O，然后涡旋混合物以确保均匀分散。
   2. 将微凝胶在 100 x g 室温下静置5分钟，倾出上层水相。
   3. 将微凝胶重悬于10 mL 70%乙醇中，涡旋混匀，并置于紫外光下照射1小时以灭菌。
   4. 将微凝胶在 1,000 x g 室温孵育5分钟，弃去乙醇，用ddH₂O洗涤3次₂O.

3. 微凝胶的制备用于 体外 或 体内 应用

注意：本研究在大鼠模型中研究了生长板损伤中的软骨再生。详细信息请参见参考文献³¹。

1. 用等体积的ddH₂O重悬微凝胶沉淀。 微凝胶可在4 °C的ddH₂O中悬浮保存长达1个月。若使用了生物活性物质，则微凝胶必须立即使用。
2. 参照先前发表的研究方法³⁰在动物体内建立损伤部位。
3. 用生理盐水冲洗损伤部位，随后保持动物未处理状态（用于对照研究），或仅注射壳聚糖微凝胶，或注射负载生物活性物质的微凝胶（步骤3.2）。
4. 缝合动物伤口，并给予术后镇痛药物³⁰。
5. 术后第7天或第28天，通过过量CO₂处死大鼠，切除肢体并进行组织学分析，以评估损伤部位的组织修复情况³¹。

结果

壳聚糖微凝胶的成功制备依赖于京尼平与壳聚糖之间的交联反应，特别是壳聚糖聚合物链上的氨基参与该反应。与其他微凝胶制备技术相比，该方法无需使用乳液或溶剂洗涤，且可在廉价设备条件下快速、简便地完成。微凝胶成功制备的一个显著标志是壳聚糖与京尼平混合后，溶液颜色由乳白色明显转变为深蓝色。京尼平与含氨基化合物（如壳聚糖或其他蛋白质）之间的交联反应在文献中已有充分表征³⁴。简而言之，该交联机制被认为是壳聚糖的氨基对京尼平进行亲核攻击的过程，其中京尼平作为二醛，形成稳定的缩合产物³⁵。这些短链状的稳定缩合京尼平分子在壳聚糖聚合物之间充当交联桥。交联反应导致溶液变为深蓝色，这可能是由于亲核攻击引发开环反应后，中间产物发生氧自由基诱导的聚合与脱氢反应所致³⁶。

微凝胶经过滤并重悬于1:1的水稀释液后，可便捷地应用于多种生物材料领域。近期已有研究报道，采用这种无乳液法合成的壳聚糖微凝胶促进生长板损伤后的软骨再生。微凝胶按本文所述方法制备，可保持空载状态，或负载S...

讨论

近年来，微凝胶因其在药物递送或细胞封装等多种用途上的高度适用性而受到广泛研究⁹。在组织工程领域，微尺度生物材料结构的制备简便性具有重要意义，因为它使研究人员能够在特定的尺寸和时间尺度上开发基于水凝胶的策略。然而，大多数制备壳聚糖微凝胶的方法需要昂贵的设备和试剂、乳液体系或具有细胞毒性的溶剂冲洗步骤，从而限制了其向临床应用的转化^{15,16,17,18,19,20}。这些微凝胶在制备上具有显著的便利性，无需使用乳液技术或溶剂冲洗。此外，这些微凝胶保留了组织工程结构所需的理想特性，如pH依赖性溶胀与药物负载能力、可调控的降解行为以及治疗药物的持续释放。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸	SigmaAldrich	AX0073
BD 鲁尔锁注射器	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner 漏斗	Fisher Scientific	FB966F	直径 100 mm
壳聚糖（低分子量）	SigmaAldrich	448869	脱乙酰度 75-80%
透析膜管	Fisher Scientific	08-670-5C	截留分子量 3500
乙醇	SigmaAldrich	493538
京尼平	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i 培养箱	ThermoFisher	50116047
封口膜（Parafilm）	Fisher Scientific	13-374-12
重组人 SDF-1α	Peprotech	300-28A
重组人 TGF-β3	Peprotech	100-36E
Whatman 540 型滤纸	SigmaAldrich	Z241547	孔径 8 mm
Whatman 541 型滤纸	SigmaAldrich	WHA1541055	孔径 22 mm
Whatman 542 型滤纸	SigmaAldrich	WHA1542185	孔径 2.7 mm
金属网筛	McMaster-Carr	9317T86	100 目筛网