全面理解啮齿类动物由失活动引起的步态改变

摘要

本实验方案描述了三维运动追踪/评估方法，用于描绘大鼠在暴露于模拟失用环境后步态运动的变化。

摘要

众所周知，废用会影响神经系统，并导致关节运动发生改变；然而，目前尚不明确哪些指标能够恰当地反映这些特征。本研究描述了一种利用视频捕捉进行三维（3D）重建的运动分析方法。通过该技术，观察了在模拟微重力环境中因尾部悬吊导致后肢去负荷的大鼠行走表现所发生的废用相关改变。经过两周的去负荷处理后，大鼠在跑步机上行走，并使用四台电荷耦合器件（CCD）摄像机记录其步态运动。利用图像处理软件重建三维运动曲线，并与对照组个体进行比较。重建的结果指标成功地揭示了步态运动异常的若干特征：站立相期间膝关节和踝关节的过度伸展以及髋关节位置升高。运动分析具有多种优势。首先，它能够实现对行为的定量评估，而非依赖主观判断（例如某些任务中的通过/失败判定）。其次，一旦获得基础数据集，便可从中提取多个参数以满足特定研究需求。尽管该方法在推广应用中仍存在障碍，但通过确立全面的测量指标和实验操作流程，有望缓解其劳动强度高和成本昂贵等缺点。

引言

缺乏身体活动或不使用会导致运动效应器的退化，例如肌肉萎缩和骨量流失¹以及全身性失适应²。此外，最近人们注意到，活动减少不仅影响骨骼肌肉系统结构方面的变化，还会影响运动的质量特征。例如，暴露于模拟微重力环境的大鼠，即使在干预结束后1个月，其肢体位置仍与正常动物不同^3,4。然而，关于活动减少所导致的运动功能缺陷，目前报道仍然较少。同时，这些退化所伴随的整体运动特征也尚未被充分阐明。

本方案演示并讨论了运动学评估的应用，通过参考后肢悬吊大鼠因失用所诱发的步态运动缺陷，来可视化运动变化。

已有研究表明，在模拟微重力环境后行走时，人类⁵和动物^4,6,7,8均会出现肢体过度伸展的现象。因此，为了保证普适性，本研究聚焦于一些通用参数：站立相中期（midstance）膝关节和踝关节的角度，以及跖趾关节与髋关节之间的垂直距离（大致相当于髋部高度）。此外，本文讨论部分还提出了视频运动学评估的潜在应用价值。

一系列运动学分析可能是评估神经控制功能特征的有效手段。然而，尽管运动分析方法已从足迹观察或对采集视频的简单测量^9,10发展到多摄像头系统^11,12，但目前尚未建立通用的方法和参数。本研究中的方法旨在通过全面的参数提供这种关节运动分析。

在之前的研究¹³中，我们尝试通过综合视频分析来展示神经损伤模型大鼠的步态改变。然而，通常情况下，运动分析的潜在结果往往受限于分析框架中预设的变量。因此，本研究进一步详细说明了如何引入具有广泛适用性的用户自定义参数。若能合理设置参数，基于视频分析的运动学评估将具有更广泛的应用价值。

方案

本研究经京都大学动物实验委员会批准（Med Kyo 14033），并依照美国国立卫生研究院指南（《实验动物护理与使用指南》，第8版）进行。本研究采用7周龄雄性Wistar大鼠。实验操作流程示意图见补充文件1。

1. 让大鼠适应跑台行走

注意：有关该操作步骤的详细信息，请参见先前发表的报告¹³。

1. 将大鼠放置于专为啮齿类动物设计的跑步机上（参见材料表）。在第一次实验中，让动物自由探索跑步机，以适应环境。
   注意：此过程约需5分钟。
2. 逐步增加跑带速度至所需水平（20 cm/s），并让大鼠行走。如有需要，可在跑步机末端施加电刺激¹⁴。
   注意：一次行走训练持续约10–20分钟。
3. 每隔一天重复一次此过程，持续1周或根据需要更频繁地进行^15,16,17。
   注意：应在第2步开始前1周启动适应期。
4. 将大鼠以每笼2–3只的方式群养于笼具中，维持12小时光照-12小时黑暗的循环周期。自由摄食和饮水ad libitum。

2. 大鼠后肢去负荷的应用及关节标记的设置

注意：使用线绳和粘性胶带固定大鼠尾部以抬高其后肢，具体方法如先前报道所述^18,19,20。确保线绳和胶带固定在尾根部，以防止尾部皮肤滑脱。应密切监测动物状态，必要时调整减重高度或胶带的松紧程度。

1. 使用麻醉面罩吸入2-5%异氟烷，在大鼠尾巴近端缠绕一条30 cm长粘性胶带的前半部分。
2. 将一根1 m长的棉线（厨房用棉绳，直径约1 mm）对折。在折叠后的50 cm中点处打结形成一个环，结的位置距离末端约5 cm，以形成一个周长为10 cm的环。
3. 让粘性胶带剩余的15 cm部分穿过棉线环一次，以固定胶带。然后将胶带剩余部分缠绕在尾巴的远端。
4. 将棉线的另一端固定在笼子上方的平台。将动物饲养在足够高的笼子中，使其后肢通过尾巴被抬高。除后肢去负荷外，其余环境条件应与对照组（Ctrl组）相同，如食物、饮水和垫料。
5. 按照以下步骤设置关节标记点和软件（参见材料表）。
   注意：有关此步骤的详细信息，请参见Wang等¹³。
   1. 在吸入2-5%异氟烷的麻醉状态下，将彩色半球形标记点（直径3 mm）粘贴至剃毛后对应骨性标志点的皮肤上。保持异氟烷浓度尽可能低，以避免麻醉过深。
   2. 确保标记点位置包括前上髂棘（ASIS）、大转子（髋关节）、膝关节（膝）、外踝（踝关节）和第五跖趾关节（MTP）²¹。
      注意：若需要测量脚趾角度，可用油性记号笔标记脚趾尖端（参见材料表）。建议使用液体胶水作为粘合剂，因其干燥速度更快。

3. 使用采集的视频进行标记点追踪

1. 打开 MotionRecorder 应用程序（参见 材料表），并启动跑步机。将大鼠放置在跑步机的跑带上。
   注意：用于视频采集的四台相机（参见 材料表）沿跑步机的长边布置：每侧各两台相机，相距约 50 cm × 50 cm，面向跑带区域的中心。
2. 将跑带速度逐渐增加至 20 cm/s。当大鼠以目标速度正常行走时，点击 录制 图标以开始视频采集。当获得足够步数（建议连续 5 步，理想为 10 步）后，再次点击 录制 图标以停止采集。
   注意：在一次实验中对多只动物进行数据采集。每只大鼠最多尝试五次。若某只大鼠不愿行走，可先采集其他个体，稍后再尝试该个体。相机的采集速率为 120 帧/秒。
3. 打开 3DCalculator 应用程序（参见 材料表），并加载待分析的视频文件。
4. 通过调节顶部的水平滑动条，裁剪视频以包含足够数量的连续步态周期。通过拖动黄色滑动条末端的图标来调整所捕获图像的范围。
5. 为标记点进行标注，点击简笔画模型上的 标记图例，将其拖动至视频中对应的标记点位置后释放鼠标。此过程将为简笔画模型中的标记图例分配对应标记点的颜色。对每个需追踪的标记点重复此操作。
6. 点击 自动追踪 图标。若系统未能准确追踪标记点，或因标记点丢失导致追踪中断，则切换至手动模式。
   注意：除非标记点丢失，否则该自动过程不会停止。若每数帧即频繁中断，建议重新定位丢失的标记点。
7. 若需使用手动模式，点击 手动 图标进行切换。点击简笔画模型上的 缺失标记图例 及其在视频中对应的标记点。在手动模式下，每点击一次，视频前进一帧。
   ​注意：可使用公开可用的自动点击应用程序，以减轻标记点追踪（数字化）人员的操作疲劳（参见 材料表）。

4. 计算所需参数

1. 打开 KineAnalyzer 应用程序（参见 材料表）并加载文件。
2. 前往 查看 > 编辑标记主控器 菜单。它会打开 "标记物主编辑" 窗
   注意：捕获的标记在被标注之前仅以简单的数字显示。
3. 点击 目标标签 （标志性）在 标记物 标签，然后单击所需的 颜色该过程将每个标记指定到特定的解剖标志点。
4. 前往 链接 点击两个点创建线条 标记物 依次进行。该过程通过标记的标记物创建对应于每个肢体的线条。
5. 通过从调色板中选择所需颜色，为创建的线条分配颜色 颜色 柱
6. 通过指定参考线/运动线及角度方向来定义角度。前往 角度 标签。命名角度后，指定 载体 A （参考线）和 载体 B （移动线条）通过点击 标记物 对应每个标记点。然后，用一个数值定义角度的方向 操作 同一标签页中的部分。
   注意：本研究主要关注站立相中期（midstance）的参数：KSt（膝关节角）、ASt（踝关节角）、MHD（跖骨-髋关节距离：相当于髋关节高度，详见下一部分）。膝关节角定义为股骨与胫骨之间的夹角，踝关节角定义为胫骨与第五跖骨之间的夹角。0° 表示关节完全屈曲。
7. 在 距离 标签，定义距离参数（MHD）。选择两个对应的标记点 距离设置 关节轨迹将作为标准化步态周期的函数提供。
   注意：角度/参数的定义仅需执行一次。完成此定义过程后，参数设置将可用于后续评估。

结果

将12只动物随机分为两组：去负荷组（UL，n = 6）和对照组（Ctrl，n = 6）。对于UL组，通过尾巴悬吊使动物后肢去负荷2周（UL期），而Ctrl组动物则自由活动。去负荷2周后，UL组表现出与Ctrl组明显不同的步态模式。图1展示了代表性受试者的归一化关节运动轨迹。在支撑相期间，UL组的膝关节和踝关节伸展程度大于Ctrl组（即踝关节表现为跖屈），这种现象被称为“踮足行走”^3,16。本研究旨在确定这些运动功能退变的全面特征。为了从整体结果中提取定量指标，采用了上述三个参数：KSt，支撑中期的膝关节角度；ASt，踝关节角度；MHD，跖骨-髋关节距离（第五跖趾关节与髋关节之间的垂直距离），该距离实际上等同于支撑中期髋关节的高度。

在卸载后2周时，卸载组（UL组）的KSt值和ASt值均显著高于对照组（Ctrl组）（图2A、B

讨论

环境的改变会导致运动系统功能特征和肌肉骨骼组分的波动^26,27。收缩结构或环境的异常可能影响功能能力，即使在机械或环境畸变消除后，这种影响仍可能持续存在¹⁹。客观的运动分析有助于对这些功能能力进行定量测量。如上所述，视频分析是获取此类参数的一种强大方法。

为了在视频分析中追踪关节标志点，通常使用红外标记物和摄像机，而手动追踪也较为常见^10,28。采用彩色半球形标记物并结合自动捕捉流程，可使该追踪过程更简便且更具成本效益。尽管存在因皮肤滑动导致结果波动的可能，本研究仍采用了此种追踪方法。为解决皮肤滑动问题，Bojados 等人还尝试了放射学方法，将标记物直接植入皮肤下方的骨骼上¹⁷。

运动分析的另一个优...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶带	NICHIBAN CO.,LTD.	SEHA25F	用于固定大鼠尾部线绳以实现后肢去负荷的胶带
小型动物麻醉装置	SHINANO MFG CO.,LTD.	SN-487-0T
自动点击器	N.A.	N.A.	可免费下载至个人电脑的软件（https://www.google.com/search?client=firefox-b-1-d&q=自动点击器)
CCD相机	Teledyne FLIR LLC	GRAS-03K2C-C	用于视频采集的CCD（电荷耦合器件）相机
棉线	N.A.	N.A.	用于将大鼠尾部悬挂在笼顶的线绳
异氟烷吸入用溶液	辉瑞日本公司	(01)14987114133400
关节标记物	TOKYO MARUI 公司	0.12 g BB	经改装后用作半球形标记物的6 mm软气枪弹丸
Kine Analyzer	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	用于分析的软件
Konishi Aron Alpha	TOAGOSEI 公司有限公司	#31204	用于将球形标记物粘附于大鼠解剖标志点的超级胶水
运动记录仪	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	视频录制软件
油漆记号笔	MITSUBISHI PENCIL CO., LTD	PX-21.13	使用油性记号笔标记动物脚趾
三维运动捕捉装置（用于小型动物的KinemaTracer）	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	由四个摄像头组成的三维运动分析系统（https://www.kicnet.co.jp/solutions/biosignal/animals/kinematracer-for-animal/ 或 https://micekc.com/en/）
三维（3D）计算器	KISSEI COMTEC CO.,LTD.	N.A.	用于标记物追踪的软件
跑步机	MUROMACHI KIKAI CO.,LTD	MK-685	配备透明外壳、电刺激装置和速度控制单元的跑步机
Wistar大鼠（雄性，7周龄）	N.A.	N.A.	可从实验动物供应商处购买获得