生成人诱导性多能干细胞来源的2型肺泡上皮细胞的三维球体及二维气液界面培养模型

摘要

本方案描述了人诱导性多能干细胞衍生的类似2型肺泡上皮细胞（iAT2s）。这些细胞可在三维培养条件下以自我更新的球体形式进行培养，或适应于气液界面（ALI）培养条件。

摘要

在肺部，肺泡上皮构成一道抵御环境刺激的物理屏障，在维持稳态和疾病发生中发挥关键作用。Ⅱ型肺泡上皮细胞（AT2s）是远端肺上皮的兼性前体细胞。AT2s的功能障碍和损伤可导致并加剧多种肺部疾病。因此，深入理解AT2s的生物学特性对于阐明肺部生物学及疾病机制至关重要。然而，原代人源AT2s通常难以分离且来源有限。为克服这些局限，可通过模拟肺发育过程的定向分化方案，由人诱导性多能干细胞（iPSC）分化获得Ⅱ型肺泡上皮细胞（iAT2s），从而提供一种替代来源 体内 肺发育。iAT2s 在无饲养层条件下生长，其转录组程序与人类成体原代AT2细胞相似，并能执行AT2细胞的关键功能，例如表面活性物质的合成、包装和分泌。本方案详细描述了通过连续传代在三维（3D）培养体系中维持具有自我更新能力的iAT2s，或将iAT2s适应于气液界面（ALI）培养体系的方法。在接种前，需制备iAT2s的单细胞悬液，接种于3D溶解态基底膜基质（下文简称 "基质"），它们会自组装成单层上皮细胞球体。在三维培养中，iAT2细胞可被连续解离为单细胞悬液，用于传代或接种至二维气液界面（ALI）培养系统。在ALI培养中，iAT2细胞形成具有极性的单层结构，其顶面暴露于空气中，使该体系易于进行环境暴露实验。因此，本方案可提供无限供应的iAT2细胞，产量可达1 × 10以上³⁰ 每输入细胞在15次传代过程中产生的细胞数，同时维持由SFTPC指示的AT2细胞程序^tdTomato 表达。所获得的细胞代表了一种可重复且具有相关性的研究平台，可用于研究基因突变、模拟环境暴露或进行药物筛选。

引言

在肺部，气道和肺泡上皮细胞是首先接触吸入性环境暴露物的细胞，这些暴露物包括通过吸入气溶胶传播的病原体以及香烟烟雾等有害刺激物。2型肺泡上皮细胞（AT2s）在维持肺部稳态中起关键作用，因其是远端肺上皮的兼性前体细胞，能够产生表面活性物质以降低肺泡表面张力，并对吸入性暴露物启动固有免疫反应。^1,2然而，肺部损伤或在AT2细胞中选择性表达的基因发生突变（例如）均可导致AT2功能障碍 SFTPC, SFTPB，以及 ABCA3^3,4,5. 以往研究这些基因突变的方法主要依赖于小鼠模型⁶ 或导入永生化细胞系的含突变工程载体⁷因此，需要能够模拟遗传和环境干扰对生理相关细胞类型中AT2细胞影响的平台，并以高效的方式 体外 需要进一步的系统研究来深入理解AT2细胞在健康与疾病中的作用。

在模拟空气传播暴露方面，气液界面（ALI）培养的原代气道上皮细胞已被成功用于揭示香烟烟雾引起的关键分子反应⁸ 以及模拟气道感染^9,10与气道上皮模型系统相比，作为疾病感染或损伤关键部位的肺泡上皮，其相应的气液界面（ALI）培养系统发展程度要低得多。已采用永生化细胞系在气液界面进行培养，以模拟肺泡上皮^11,12，但这些细胞系在转录组水平上与原代肺泡上皮细胞存在差异¹³ 缺乏关键的细胞机制，例如在气液界面处分泌表面活性剂或形成紧密连接的能力¹²原代人AT2细胞可在成纤维细胞存在下以三维球体形式培养^1,14 但存在局限性，包括难以从肺组织外植体中获取，以及在迄今为止大多数培养条件下易发生衰老或失去细胞表型。这些特性限制了原代AT2细胞的广泛应用 体外 研究，尽管近期在优化无饲养层的三维培养体系以扩增原代AT2细胞方面已取得进展^15,16,17,18.

定向分化方案已被开发用于模拟 体内 生成人诱导性多能干细胞（iPSC）来源的2型肺泡上皮细胞（iAT2s）的发育里程碑¹⁹iAT2细胞在含有CHIR99021、KGF、地塞米松、cAMP和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）的无血清、三维限定培养基中，以自我更新的球状体形式生长，该培养基称为 "CK + DCI"¹⁹，无需成纤维细胞饲养层，且可进行长期培养 >20个片段^20,21此外，iAT2细胞与人类成体原代AT2细胞具有相似的转录组程序，能够形成板层小体，并产生和包装表面活性物质^19,21,22该方案详细描述了通过将细胞解离为单细胞悬液对iAT2s进行连续传代的方法。在此阶段，iAT2s可重新接种并进一步在三维培养体系中扩增，或接种于二维气液界面（ALI）培养体系中。²³这些方法可用于研究AT2细胞在稳态及疾病状态下的内在生物学特性^20,22 并利用可扩展的、符合生理相关性的平台来探究化合物或刺激物的作用效果^23,24，这一点先前已有报道。

方案

所有涉及人iPSC系分化的实验均遵循波士顿大学机构审查委员会的规定（方案编号H33122）。用于重编程为iPSC的真皮成纤维细胞来自已签署书面知情同意书的供体，获取过程经密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院人类研究保护办公室批准。重编程的iPSC由马萨诸塞州波士顿市波士顿大学和波士顿医疗中心再生医学中心制备。

1. 肺泡球体解离

1. 根据表1中所述的成分配制完全无血清分化培养基（cSFDM）。
2. 根据表2，在已配制的cSFDM基础培养基中配制CK + DCI培养基。
3. 根据实验需要，将2D（适用于人胚胎干细胞的）和/或3D（生长因子减少型）基质置于冰上解冻。
4. 使用移液器或带真空的抽吸移液器，从12孔板中含由定向分化衍生的肺泡球体（alveolospheres）的3D基质液滴中吸除全部CK + DCI培养基¹⁹。
5. 每滴加入1 mL分散酶（dispase，2 mg/mL）。使用P1000移液器轻轻将液滴吹打混入分散酶中。37 °C孵育1小时，于30分钟后轻轻吹打上下混合一次。
6. 将步骤1.5中解离的类器官（来自一个基质液滴）转移至15 mL锥形管中。加入10 mL Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM，参见材料表）进行洗涤。
7. 室温下以300 x g离心5分钟。使用移液器或带真空的抽吸移液器吸除上清液，尽可能残留最少的上清。
   注意：必须彻底去除所有分散酶，因为残留的分散酶可能会溶解后续接种细胞所用的基质。若在沉淀物上方观察到明显的浑浊层，说明分散酶尚未完全溶解基质，可向沉淀物中再添加分散酶，并在37 °C继续孵育20-30分钟。
8. 每滴用1 mL 0.05%胰蛋白酶重悬细胞，并转移回12孔板。37 °C孵育12-15分钟。在显微镜下观察解离情况。此阶段应避免过度吹打细胞。
   注意：孵育结束时，使用P1000移液器吹打3-5次后，细胞应达到单细胞悬液状态。若需将iAT2细胞传代至气液界面培养（ALI，步骤3），则胰酶消化时间应尽量缩短（最长12分钟），使细胞呈2-3个细胞的小团簇状态，而非完全单细胞悬液，以便接种至细胞培养小室时更适宜。
9. 加入等体积含胎牛血清（FBS）的培养基（DMEM中含10%适用于胚胎干细胞的FBS）以终止胰蛋白酶作用。室温下以300 x g离心5分钟。
10. 用10 mL IMDM洗涤细胞一次。室温下以300 x g离心5分钟。
11. 用适量体积的缓冲液重悬细胞用于计数，并使用血细胞计数板对细胞进行计数（参见材料表）。
    注意：从一个初始接种密度为400个细胞/µL、已完全融合的50 µL基质液滴中，预期每滴可获得500,000至1.5 x 10⁶个细胞。
12. 使用iAT2细胞的单细胞悬液，通过接种于3D基质中生成肺泡球体（步骤2）和/或接种于细胞培养小室上进行气液界面（ALI）培养（步骤3）。

2. iAT2细胞的3D包埋培养

1. 计数后（步骤 1.11），确定需重新接种到 3D 基质中的细胞数量（每 12 孔板孔中接种 50–100 µL 的 3D 基质液滴，细胞密度为 400 个细胞/µL 基质）。在室温下以 300 × g 离心 5 分钟，然后用移液器尽可能吸除上清液。
2. 将细胞重悬于 3D 基质中。如需防止基质聚合（温度升高时会发生聚合），应快速操作并置于冰上。
3. 使用 P200 移液器将一个 3D 基质液滴加入预热的 12 孔板的每个孔中。移液时需小心，避免在基质液滴中产生气泡。在连续加样多个液滴时，不要让细胞悬液发生沉降。
4. 将培养板放入 37 °C 培养箱中孵育 20–30 分钟，使基质液滴完成聚合。
5. 每孔加入 1 mL CK + DCI + 10 µM Y-27632 培养基（参见材料表），以完全覆盖基质液滴。
6. 72 小时后，更换为不含 10 µM Y-27632 的 CK + DCI 培养基。
7. 每 48–72 小时更换一次新鲜的 CK + DCI 培养基。
   ​注意：iAT2 细胞通常需要每 10–14 天传代一次，具体时间取决于细胞系和接种密度。

3. 将iAT2细胞传代至气液界面（ALI）

1. 使用前1小时，将2D基质按照生产商说明书要求用杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物F-12（DMEM/F12）稀释至工作浓度，新鲜包被6.5 mm细胞培养小室 材料表然后，向每个6.5 mm细胞培养小室中加入100 µL稀释后的基质。将基质置于37 °C培养箱中孵育30分钟，或在室温下放置1小时，使其聚合。
2. 用移液器或连接真空泵的抽吸移液器吸除细胞培养小室中多余的基质，并用 DMEM/F12 洗涤一次。在加入细胞前立即吸除该洗涤液。
3. 计数后，确定在培养小室中接种所需数量细胞的细胞数目（520,000 个活细胞/cm²）。²，相当于每6.5 mm细胞培养插件中172,000个活细胞）。以300 x g 室温下孵育5分钟。尽可能吸除上清液。
4. 将细胞重悬于适当体积的溶液中，使每孔细胞培养插入物接种100 µL CK + DCI + 10 µM Y-27632（细胞悬液浓度应为1,720 个细胞/µL）。取100 µL加入细胞培养插入物的顶室。以十字形轻轻振荡培养板，确保细胞在细胞培养插入物表面均匀分布，并在4倍物镜下显微镜观察确认。
   注意：接种密度至关重要，可能需要优化，范围为每6.5 mm细胞培养小室160,000–300,000个细胞。钙黄绿素绿（见 材料表可将细胞膜通透性染料加入细胞中，随后在倒置荧光显微镜下观察，以在接种后对细胞进行成像。
5. 向每个细胞培养小室的基底外侧加入500 µL CK + DCI + 10 µM Y-27632。
6. 吸弃接种后48 h的顶端CK + DCI + 10 µM Y-27632培养基，使用移液器开始气液界面（ALI）培养（称为 "气升式").
   注意：此时细胞应达到100%汇合。如果细胞未达到100%汇合，仍应在指定时间点执行步骤3.7–3.8；汇合的细胞单层可能需要更长时间才能形成。
7. 72小时后，将基底侧培养基从含10 µM Y-27632的CK + DCI更换为不含10 µM Y-27632的CK + DCI。
   注意：应尽可能减少，若存在，应极少， "泄漏" 向顶端加入培养基。然而，如果在最初几天内发生泄漏，则需继续每天吸出顶端液体，直至不再有进一步的泄漏。
8. 每48-72小时用新鲜的CK + DCI更换基底外侧培养基。
   注意：用于气液界面（ALI）培养的iAT2细胞在接种后5-14天达到最大程度的成熟。
9. 如有更长期实验需求，可在接种后对细胞进行长达28天的培养，并密切监测。
   注意：在培养时间过长时，可能会观察到气液界面（ALI）失效的可见迹象，例如细胞从插入物边缘脱落或单层细胞出现孔洞，此时该ALI模型已无法用于实验。

结果

将iAT2细胞传代为单细胞悬液，随后重铺于3D基质中或细胞培养小室的2D表面，用于气液界面（ALI）培养（图1）。单细胞解离后，通过流式细胞术分析iAT2细胞。简而言之，将细胞重悬于含1%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并加入钙黄绿素蓝活力染料（1:1000），在流式细胞仪上进行检测，设门筛选非碎片、单细胞及tdTomato阳性细胞。此处以SPC2细胞系（SPC2-ST-B2克隆²⁰）为例，该细胞系携带靶向内源性SFTPC位点的tdTomato报告基因，便于在培养过程中对AT2细胞程序进行可视化观察与追踪（图2A）。当iAT2细胞重铺于3D基质形成类球体时（图2B），以及铺于细胞培养小室时（图2C），SFTPC-tdTomato的表达均得以维持。可通过测量跨上皮电阻（TEER）评估ALI培养模型的完整性（图2D）。测量TEER时使用伏特欧姆计（见材料表），在顶端室加入100 µL CK + DCI培养基。未接种细胞但涂有Matrigel的细胞培养小室作为空白对照。每孔在三个不同位置进行读数。

图1：实验方案流程的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：实验方案的代表性结果。（A）在三维培养条件下，来源于人诱导性多能干细胞的2型肺泡上皮样细胞（iAT2s）中SFTPC-tdTomato的代表性流式细胞术结果。所示阴性对照为非肺内胚层细胞（CD47lo）。（B）iAT2s在三维培养中不同传代后时间点（dpp）的代表性活细胞成像（SFTPC-tdTomato，比例尺 = 50 µm）。（C）iAT2s在气液界面接种后的代表性活细胞成像（SFTPC-tdTomato，比例尺 = 500 nm）。（D）iAT2s在气液界面接种后的代表性跨上皮电阻值。n = 3，误差条表示标准偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

试剂	500 mL 所需体积	终浓度
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	375 mL	75%
Ham's F-12 Nutrient Mixture (F12)	125 mL	25%
B-27 (含 RA) 添加剂	5 mL	1%
N-2 添加剂	2.5 mL	0.50%
BSA (7.5% 储存液)	3.3 mL	0.05%
Primocin (50 mg/mL 储存液)	1 mL	100 µg/mL
Glutamax (100x 储存液)	5 mL	1x
抗坏血酸 (50 mg/mL 储存液)	500 µL	50 µg/mL
1-硫代甘油 (MTG) (来自 2 mL IMDM 中 26 µL 的溶液)	1.5 mL	4.5 x 10-4 M

表1：完全无血清分化培养基（cSFDM）的成分。

试剂	终浓度
CHIR99021	3 µM
rhKGF	10 ng/mL
Dexamethasone	50 nM
8-溴腺苷-3',5'-单磷酸钠盐 (cAMP)	0.1 mM
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (IBMX)	0.1 mM

表2：CK + DCI 培养基的成分。

讨论

AT2s maintain lung homeostasis, and dysfunction of these key alveolar cells can both cause and result from various lung diseases. Due to the difficulty of accessing and isolating primary human AT2s, iAT2s are generated. By applying the directed differentiation methods described elsewhere²⁵ and the expansion and cell seeding described here, iPSCs generated from any individual can be differentiated into robustly self-renewing iAT2s, thus providing patient-specific cells for biomedical research, including basic biomedical research developmental studies, disease modeling, cell-based therapies, or drug screens. The present protocol details a method for dissociating iAT2s to a single-cell suspension, which can then be replated in 3D Matrigel to generate alveolospheres for cell expansion or replated in 2D ALI culture for further experiments.

The protocol has several critical steps to ensure successful passaging and replating in both 3D and ALI cultures. Mechanical trituration must be minimized, as excessive pipetting can decrease cell viability. In addition, the seeding density of iAT2s in both 3D and 2D ALI cultures is critical; for 3D culture, in general, 400 cells/µL of 3D Matrigel is optimal for most iPSC lines. However, a range of densities from 100-500 cells/µL has, at times, been successful, and optimizing the density may be required for different cell lines. For ALI culture, optimizing the seeding density of iAT2s on the cell culture inserts is also essential to achieve a confluent monolayer of cells 48 h after seeding (i.e., on the day of air-lift). Some iAT2 lines require more cells per insert; thus, if troubleshooting is required, a range from 160,000-300,000 cells/insert for 24-well cell culture inserts is recommended. 3D cultures can also be scaled to 24- and 48-well plates by maintaining the seeding density at 400 cells/µL of 3D matrix and reducing matrix droplet size to 25 µL and 20 µL, respectively. ALI cultures can be scaled to 96-well cell culture inserts by coating each insert with 30 µL of the matrix, plating 80,000 cells in 30 µL per insert, and feeding with 150 µL of basolateral media per well. Seeding density and matrix and media volumes need to be scaled and optimized accordingly for other plate formats.

A limitation of this protocol is that the cells used for ALI plating have to be sufficiently purified to be NKX2-1+ and SFTPC+^19,20,21,23 to form iAT2 ALIs, and ALI culture formation may vary from line to line. In addition, this protocol allows expansion and generation of AT2-only cultures, providing a reductionist model system based on a single key alveolar cell type. Importantly, other relevant alveolar cell types, such as alveolar type 1 cells, were missing from these platforms. Other groups have had success culturing primary human AT2s as spheroids or organotypic cultures with or without fibroblasts^{1,14,15,16,17}; however, primary human AT2s tend to lose their expression of key surfactants when cultured in normal 2D culture without ALI conditions²⁶. Furthermore, recent work has shown that iAT2s express higher proliferative markers and lower AT2 maturation markers than fresh, uncultured human primary AT2s²⁷. Despite these differences between iAT2s and fresh primary human AT2s, we found that even cultured primary AT2s displayed transcriptomic differences from fresh, uncultured primary AT2s²⁷, and thus conclude that these in vitro models have various strengths and limitations for modeling in vivo lung biology.

The iAT2 platform can be applied to study genetic mutations from patient-derived iPSCs^19,20. The system could also be substantially scaled up to accommodate high throughput drug screening. In addition, iAT2 ALIs are suitable for environmental exposures such as viral or bacterial infection or exposure to cigarette smoke, e-cigarette vapor, or other aerosols²³. In summary, this protocol for generating both 3D and 2D ALI cultures of iAT2s allows for long-term culture of a disease-relevant cell type and provides a physiological, scalable platform that enables the usage of these cells in many applications.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）	Sigma	I5879	用于 CKDCI
12 孔细胞培养板	Corning	3513	用于细胞培养
1-硫代甘油（MTG）	M6145	Sigma	用于 CKDCI
2D Matrigel（基质）—适用于人胚胎干细胞的 Matrigel 基质	Corning	8774552	用于包被 ALI Transwell
3D Matrigel（基质）—生长因子减少型 Matrigel	Corning	356230	用于培养 iAT2 类球体
8-溴腺苷-3',5'-单磷酸钠盐（cAMP）	Sigma	B7880	用于 CKDCI
抗坏血酸	A4544	Sigma	用于 CKDCI
不含视黄酸的 B27	Life Technologies	12587-010	用于 CKDCI
牛血清白蛋白（BSA）（7.5%）	Thermo Fisher	15260037	用于 CKDCI
钙黄绿素蓝	Life Technologies	C1429	用于流式细胞术中的活/死细胞区分
钙黄绿素绿	Life Technologies	C1430	可选，用于细胞培养插件上细胞的可视化
细胞培养插件 — Costar 6.5 mm 透明 Transwell，孔径 0.4 µm	Millipore-Sigma	CLS3470-48EA	ALI Transwell
CHIR99021	Tocris	4423	用于 CKDCI
地塞米松	Sigma	D4902	用于 CKDCI
分散酶（2 mg/mL）	Thermo Fisher	354235	用于溶解 Matrigel
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）	Thermo Fisher	11995	用于配制胰酶失活培养基（含 10% FBS 的 DMEM）
杜氏改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F12）	Thermo Fisher	A4192002	用于洗涤
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher	14190	用于流式细胞术分析
胎牛血清（FBS）（Hyclone 鉴定级）	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	用于配制胰酶失活培养基（含 10% FBS 的 DMEM）
Glutamax	Life Technologies	35050-061	用于 CKDCI
Ham's F-12 营养混合物（F12）	Cellgro	10-080-CV	用于 CKDCI
血细胞计数板	Fisher	02-671-6	用于细胞计数
Invivogen Primocin 1 G（50 mg/mL）	Fisher Scientific	NC9392943	用于 CKDCI
伊氏改良杜氏培养基（IMDM）	Thermo Fisher	12440053	用于 CKDCI
Millicell ERS-2 伏特计	Millipore	MERS00002	用于测量跨上皮电阻
N2 补充剂	Life Technologies	17502-048	用于 CKDCI
重组人 KGF	R&D Systems	251-KG-010	用于 CKDCI
视黄酸	Sigma	R2625	用于 CKDCI
台盼蓝	Thermo Fisher	15250061	用于传代过程中的细胞计数
胰酶-EDTA（0.05%）	Gibco	25-300-062	用于解离 iAT2 类球体
Y-27632 二盐酸盐	Tocris	1254	传代后加入细胞中