一种用于透析通路相关手功能障碍的小鼠模型

摘要

本方案详细描述了小鼠髂总动静脉瘘创建的手术步骤。我们建立此模型以研究与血液透析通路相关的肢体病理生理学。

摘要

慢性肾病是一个重大的公共卫生问题，需要长期肾脏替代治疗（如血液透析）的终末期肾病（ESRD）患病率持续上升。自体动静脉瘘（AVF）成形术仍是ESRD患者主要的血管通路选择。然而，约半数血液透析患者会出现与透析通路相关的手功能障碍（ARHD），临床表现从轻微的感觉异常到指端坏疽不等。值得注意的是，目前对导致ARHD的潜在生物学机制了解甚少，且尚无合适的动物模型可用于阐明其机制或开发预防/治疗ARHD的新疗法。本文介绍一种新的小鼠模型，通过在左侧髂总动脉与髂总静脉之间建立动静脉瘘（AVF），从而便于评估肢体的病理生理变化。显微外科手术包括血管游离、静脉纵行切开、动静脉吻合建立以及静脉重建。假手术组则包含除AVF建立以外的所有关键步骤。髂血管AVF成形可导致具有临床相关性的中心血流动力学改变、外周缺血以及后肢神经运动功能受损。这一新型的临床前AVF模型能够重现血液透析患者常见的神经运动功能紊乱，为研究人员探究ARHD病理生理机制及测试潜在治疗手段提供了有价值的实验平台。

引言

对于通过血液透析接受肾替代治疗的终末期肾病（ESRD）患者而言，建立并维持功能良好的血管通路仍然是一个重要的首要目标¹。当肾功能严重不足时，必须通过反复进行血液透析治疗来清除代谢废物、纠正电解质紊乱并维持体液平衡，从而保障长期生存²。因此，血管通路对于ESRD患者而言是一条"生命线"，而在该患者群体中，自体动静脉内瘘（AVF）仍是首选的透析通路方式³。然而，约有30%–60%的血液透析患者会出现一系列手部功能障碍，临床上定义为通路相关性手功能障碍（ARHD）。ARHD的症状可从肌力减弱、运动不协调，到单肢瘫痪和指端坏疽不等，可能在AVF成形术后早期即出现，也可能随着瘘管成熟而逐渐发展。此外，ARHD会干扰ESRD的治疗进程，与生活质量下降、心血管疾病风险升高以及死亡率增加密切相关^2,3,4。

已开发出多种动物模型用于研究动静脉瘘（AVF）成形术后血流动力学改变所诱导的血管重塑^{5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15}。髂血管或股血管动静脉瘘的大动物模型^{16,17,18,19,20}，以及采用颈动脉-颈外静脉吻合或肾下腹主动脉-下腔静脉造瘘的啮齿类动物模型，已被广泛用于研究上述AVF成熟与通畅性的相关特征²¹。例如，静脉高压、管腔直径增大以及静脉壁增厚是AVF成功成熟的标志，而中膜显著纤维化、内膜增生或血栓形成且无血流变化则常表现为AVF失败的特征^6,15。然而，大动物模型缺乏小鼠模型所具备的实验灵活性和转基因能力，而现有的啮齿类动物模型由于解剖位置限制和/或缺乏相关的肢体病理改变，难以有效支持对动静脉瘘相关肢体疾病（ARHD）的研究。事实上，由于缺乏能够模拟相关临床表型的成熟临床前动物模型，尽管出现症状的ARHD患者数量持续增加，但阐明其病理生物学机制并开发新型治疗策略的研究进展仍处于停滞状态。因此，本研究的主要目的是建立一种独特的ARHD小鼠模型，并提供AVF显微外科手术的操作步骤以及AVF相关病理生理学特征的详细描述。

方案

所有实验程序均经佛罗里达大学和马尔科姆·兰德尔退伍军人事务医疗中心的机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。

注意：8至10周龄的雄性C57BL/6J小鼠购自杰克逊实验室，在光照（12小时明/12小时暗循环）、温度（22 °C ± 1 °C）和湿度（50% ± 10%）受控的动物设施中饲养。每笼饲养五只小鼠（笼具尺寸：宽18 cm × 长29 cm × 高12.5 cm），提供筑巢材料、饲料和饮水 随意摄取在标准饲料适应7天后，小鼠转为酪蛋白基础饲料喂养7天，作为饮食过渡阶段。随后，小鼠喂养添加0.2%–0.15%腺嘌呤的酪蛋白基础饲料2–3周，以在动静脉瘘（AVF）手术前诱导肾功能障碍（CKD），具体方法如先前所述。^22,23,24对照组小鼠饲喂不含腺嘌呤补充剂的酪蛋白基础饲料（对照组）。对照组和慢性肾病（CKD）饲料在整个术后恢复期（POD）持续维持。

1. 术前测量

1. 使用双功能超声成像评估基线/术前结局指标、主髂动脉血管直径和血流动力学参数，并通过激光多普勒评估后肢灌注，方法如前所述²⁵。
2. 测定单侧后肢握力及跑台步态评估，以建立基线后肢功能，方法如前所述^25,26。
3. 通过FITC-菊粉清除法和/或血清尿素氮（BUN）水平测定肾小球滤过率（GFR），评估肾功能，方法如前所述^22,24,27。

2. 手术准备

1. 准备以下手术器械和用品（材料表）：高温珠灭菌器、眼用润滑剂、电动毛发修剪器、酒精消毒棉片、氯己定擦拭巾、超细格拉夫镊子、灭菌0.9%生理盐水、29 G和31 G针头注射器、2 x 2无纺布海绵、中号单头圆头（SC-9）和小号双头硬质尖头（SC-4）棉签、低温电灼器、直型杜蒙特镊子、45°角杜蒙特镊子、直型万纳斯弹簧剪、弯型万纳斯弹簧剪、圆柄持针器、多种规格的缝合线（4-0丝线、5-0聚乙醇酸缝线、6-0丝线和10-0尼龙缝线）、肝素、可吸收明胶海绵、直型持针器以及布托啡诺。
   注：用于固定四肢的橡胶带以及用于腹部和腿部的牵开器为手工制作。
2. 手术前，使用高压蒸汽灭菌器在120–125 °C条件下对手术器械进行30分钟湿热灭菌，随后干燥30分钟。每完成一只动物的手术后，均需使用70%乙醇清洁，并通过高温珠灭菌器（240–270 °C，3分钟）进行灭菌处理。
3. 使用29–31 G针头注射器配制灭菌0.9%生理盐水、肝素化盐水（100 IU/mL）和布托啡诺（0.01 mg/mL）。

3. 麻醉与体位

1. 在诱导室中启动小鼠麻醉（异氟烷浓度2.5%，流速0.8 mL/min）。当小鼠达到充分麻醉状态后，将其仰卧位放置于覆盖无菌手术巾的手术台上。在剃毛和体位固定过程中，将异氟烷浓度逐渐降低至约1.2%。
2. 涂抹眼用润滑剂，以防止手术期间眼睛干燥。
3. 使用电动剃毛笔去除腹部手术区域的毛发以及腿部用于术后灌注测量的毛发，并清理手术区域内的所有毛发。
4. 使用橡胶带和图钉固定小鼠的上下肢，通过检测脚趾夹捏反射来评估麻醉深度，并根据需要调整麻醉剂量。在整个手术过程中，每3-5 分钟进行一次呼吸模式评估，以校准麻醉水平。

4. 手术目标区域的探查

1. 多次交替清洁剃毛的皮肤区域 酒精消毒与 用氯己定擦拭巾以环形方式擦拭以消毒手术区域。
2. 从胸骨下缘至耻骨联合行正中剖腹切口。游离耻骨脂肪垫以获得更开阔的手术视野。
3. 打开剖腹切口，使用拉钩暴露腹腔内容物，并用中号单头圆头棉签将小肠和大肠移出腹腔。用生理盐水浸湿的无纺布海绵覆盖肠管。
4. 当充分暴露腹膜后血管结构后，用小块浸有生理盐水的无纺布海绵覆盖剩余的肠管、肾脏及输尿管。根据需要，使用中号单头圆形棉签轻柔挤压膀胱顶部，以排空膨胀的膀胱。
5. 使用直头杜蒙镊和小型双头硬质尖头棉签，从腹主动脉分叉处近端约1 cm处开始，向左髂总动脉分叉水平方向仔细剥离血管周围筋膜及脂肪组织。
   注意：在整体分离动静脉结构时，左髂动脉和静脉保持相互粘连。此步骤 将提供足够的血管动员，以促进动静脉瘘的建立。
6. 若遇到起源于左髂总静脉或汇入左髂总静脉的小静脉分支，可根据需要使用低温电凝，必要时联合6-0丝线结扎。
7. 将弯头镊子的尖端穿过左侧髂总血管束下方，并轻轻多次撑开，以游离血管与其下方的腹膜后肌层图1A).

5. 建立共同髂动静脉瘘吻合

1. 在分离出的左侧髂总动静脉束周围放置两根4-0丝线缝线，将其用作血管束的结扎线（例如交叉夹闭）。每根4-0丝线打单结，依次从近端向远端施加 远端。
2. 确保丝线交叉夹之间相隔足够距离，以隔离约 2 mm 的血管长度，依次施加缝合结扎线将引起左侧髂静脉充血。
3. 使用4-0丝线作为牵拉手柄，顺时针旋转左侧髂血管神经束，并微调位置，使静脉暂时位于动脉前方图1B).
4. 用直头Vannas弹簧剪做一个纵向静脉切口（约1 mm），并用0.9%生理盐水轻轻冲洗静脉管腔内的残余血液图1C）。在此步骤中需谨慎操作，因为高压生理盐水冲洗可能导致静脉损伤。
   注意：静脉冲洗后髂动脉中残留的红色区域为下一步操作提供了可视窗口。
5. 通过静脉后壁置入一根交锁的10-0尼龙缝线。
   注意：此部分髂静脉应紧贴髂动脉前壁，且两血管壁自然粘连。缝线应同时穿过两层管壁，并以单个结扎结打结固定图1D）。注意，当针穿过两侧血管壁时，会有少量出血，此出血源自髂动脉内的滞留血液。如果此步骤中管腔内持续出血，说明丝线结扎交叉夹可能过松，需要进一步收紧。
6. 抓住重叠的缝线末端，施加轻柔张力，使髂动脉前壁与后壁分离。使用弯头Vannas弹簧剪进行约1.0 mm × 0.3 mm的椭圆形切口，去除髂动脉和静脉粘连的管壁组织。
   注意：动静脉瘘在建立此共同通道后即已形成。在通过静脉切开暴露进行后髂静脉/前髂动脉壁切口时，可能损伤静脉的侧壁。应谨慎操作以避免此类并发症，因为这会显著减小瘘管直径，并可能导致血栓形成。
7. 用0.9%生理盐水和肝素化生理盐水（100 IU/mL）轻柔冲洗暴露的动脉管腔中的残余血液²⁸ (图1E).
8. 动静脉内瘘成形术后，使用两到三根10-0尼龙线以间断缝合方式关闭前壁初始静脉切口（图1F).
9. 将血管束恢复至其原始解剖位置，并在修复的静脉切口旁放置一小块生理盐水浸湿的可吸收明胶海绵，以促进止血。
10. 依次从远端到近端松开4-0单结交叉夹紧结扎线。松开每根缝线时，密切观察静脉切开部位是否有过度出血。
11. 如果止血不充分，重新应用交叉夹钳，并在出血部位再缝合一针10-0尼龙线。若确认止血可靠，则移除缝线，随后移除可吸收明胶海绵。
12. 用小型双头硬质尖头棉签轻轻擦拭血管束，以进一步促进血流恢复。通过观察搏动性、鲜红色的氧合血液进入髂静脉，并与来自后肢的暗色静脉血混合，确认手术操作技术成功。
13. 注射肝素化生理盐水（0.2 IU/g）¹⁵ 进入下腔静脉以实现全身抗凝，从而改善动静脉瘘的通畅性结果。
    注意：尽管此步骤是在血管重建后进行（与人类手术中在血管阻断前使用肝素不同），但在该手术阶段实施此操作可减少术中出血并提高动静脉瘘通畅率。注射时应选择有筋膜和/或脂肪覆盖的部位，以防止穿刺部位出血。
14. 注射肝素化生理盐水后，重新检查手术部位是否止血。若无出血问题，使用可吸收的5-0 PGA缝线连续缝合中线筋膜，然后缝合皮肤切口。
15. 假手术操作中，除不进行动静脉瘘（AVF）成形外，其余关键步骤均与AVF手术一致。在左侧髂血管动静脉束近端以4-0丝线打单结，并使血管夹闭时间与AVF手术保持一致（例如约20分钟，具体时长取决于显微外科医生的技术熟练程度）。

6. 术后护理与测量

1. 关闭腹腔切口后，使用激光多普勒成像技术测量双侧胫骨前肌和足底的血流灌注。
   注意：单侧灌注不足可证实动静脉瘘导致的动脉血流分流（"窃血"现象）。
2. 皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，并将小鼠放回预热的小鼠笼中，笼内铺有高吸水性的柔软垫料和筑巢材料。
3. 让小鼠在预热的笼中恢复，直至麻醉作用消退，表现为小鼠能够自主活动并对外界刺激有反应（约2小时）。在恢复期间，应提供易于摄取的湿润软质食物。
4. 术后48小时内每12小时给予一次丁丙诺啡和/或皮下生理盐水补液，并在术后连续5天进行每日监测。对于病情恶化或出现明显组织坏死（改良缺血评分≥2²⁹）的小鼠，应实施安乐死。
5. 术后采用连续双功能超声评估动静脉瘘的通畅性；若小鼠发生动静脉瘘血栓形成，则应排除在后续分析之外，除非实验目的为研究动静脉瘘成熟失败的机制。
6. 在恢复期间评估其他术后结局指标，如局部血流动力学、抓握力和步态表现。在实验结束处死动物时，采集动静脉瘘及肌肉组织，用于组织形态学分析^25,27。

结果

与接受酪蛋白饮食的动物相比，接受腺嘌呤饮食的动物肾小球滤过率降低（对照组：441.3 ± 54.2 µL/min vs. 慢性肾病组：165.1 ± 118.3 µL/min，p < 0.05），血清尿素氮水平升高（对照组：20.39 ± 4.2 µL/min vs. 慢性肾病组：38.20 ± 10.65 µL/min，p < 0.05），证实了动静脉瘘手术前已存在肾功能不全。

动静脉瘘通畅性的验证
尽管术中肉眼确认技术成功是判断瘘管通畅性的初步依据，但这并不能完全保证在整个研究期间瘘管保持通畅或完成生理成熟。术后通畅性结果（即成功或失败）通过双功能超声成像和组织学检查共同确定，方法如我们先前所述²⁵。图2分别展示了动静脉瘘吻合口的代表性B型、脉冲波多普勒和彩色多普勒超声图像及其形态学切片。在彩色多普勒分析中，通畅的瘘管可直接观察到湍流血流动力学特征以及瘘口部位的频谱增宽。流入道和流出...

讨论

自体动静脉瘘（AVF）成形术后，发生获得性透析性手病（ARHD）的血液透析患者比例持续上升^30,31。确实，一些未解决的症状性并发症^4,32,33，如疼痛、无力、感觉异常和/或活动范围减小，可能对患者的健康状况产生负面影响^{4,32,33,34,35,36}，并威胁其接受高质量重复性血液透析治疗的能力。尽管建立持久的血液透析通路是终末期肾病（ESRD...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.15% 腺嘌呤饮食	ENVIGO	TD.130899	20% 酪蛋白，0.15% 腺嘌呤，0.9% P
0.2% 腺嘌呤饮食	ENVIGO	TD.130900	20% 酪蛋白，0.2% 腺嘌呤，0.9% P
10-0 尼龙缝线	AD surgical	XXS-N1005T4
29 G 针头注射器	Exel International	14-841-32
31 G 针头注射器	Advocate	U-100 胰岛素注射器
4-0 丝线缝线	AD surgical	S-S41813
45度角 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11253-25
5-0 PGA 缝线	AD surgical	PSGU-518R13
6-0 丝线缝线	AD surgical	S-S618R13
可吸收明胶海绵	ETHICON	1975
酒精棉片	Covidien	5110-cs4000	70% 异丙醇
丁丙诺啡	NA	NA	0.01 g/mL
C57BL6/J 小鼠	Jaxon Laboratory
酪蛋白饮食	ENVIGO	TD.130898	20% 酪蛋白，0.9% P
棉签	CONSTIX	SC-9	中号单头圆形棉签
棉签	CONSTIX	SC-4	小型双头硬质尖头棉签
Curity 无纺布纱布（2x2）	Covidien	9022
弯曲 Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tools	15001-08
多普勒超声仪	VisualSonics	Vevo 2100
超细 Graefe 镊子	Fine Science Tools	11150-10	2 对
眼用润滑剂	CLCMEDICA	Optixcare 眼用润滑剂
肝素（5000 U/mL）	国家药品编码目录	63739-953-25	100 IU/mL
高温珠灭菌器	Fine Science Tools	18000-50
低温电凝器	Bovie	AA04
电动毛发修剪器	Wahl	5640-600
无粉外科手套	Ansell	7824PF
圆柄持针器	Fine Science Tools	12076-12
无菌手术巾单	Dynarex	DY440-MI
灭菌 0.9% 生理盐水	国家药品编码目录	46066-807-25
直型 Dumont 镊子	Fine Science Tools	11253-20
直型持针器	Fine Science Tools	FST 12001-13
直型 Vannas 弹簧剪刀	Fine Science Tools	25001-08
TrizChLOR4	国家药品编码目录	17033-279-50