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利用3D打印技术制备工程化血管皮瓣

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DOI：

10.3791/63920

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2022年5月19日

 ,  , 
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion-Israel Institute of Technology

本文内容

摘要

工程化皮瓣需要整合功能性血管网络。在本方案中，我们介绍一种制造包含分级血管网络的3D打印组织皮瓣的方法，并将其直接与大鼠股动脉进行显微外科吻合。

摘要

构建可植入的、具有功能性的厚实组织需要设计出层级化的血管网络。3D生物打印是一种通过有序且自动化地逐层添加可打印的生物材料（称为生物墨水）和细胞来制造组织的技术，能够构建出传统组织工程技术无法实现的高度复杂结构。因此，3D生物打印是一种极具吸引力的方法 体外 模拟从毫米级血管到微血管网络的天然血管复杂结构的方法。

在颗粒状水凝胶中进行三维生物打印的技术进步，使得能够高分辨率挤出基于低粘度细胞外基质的生物墨水。本研究提出了一种结合三维生物打印与牺牲模具三维打印的方法，用于构建工程化带血管组织瓣。该方法利用重组胶原甲基丙烯酸酯生物墨水，在明胶支撑浴中对内皮细胞和支持细胞进行三维生物打印，以构建自组装毛细血管网络。所打印的微血管网络围绕一种中尺度管状多孔支架组装，该支架通过牺牲式三维打印模具制备，并接种了内皮细胞。

该组装结构可诱导中尺度血管的内皮细胞与周围毛细血管网络发生吻合，在工程化组织瓣中形成分级的血管网络。随后，通过套管技术将所构建的组织瓣经手术吻合直接植入大鼠股动脉。所述方法可进一步拓展用于制备多种带血管组织瓣，适用于重建手术及血管化研究。

引言

严重的组织缺损可由创伤性损伤、先天性缺陷或疾病引起，目前治疗这些缺损的金标准是使用自体移植物、带血管组织瓣和显微血管游离皮瓣作为组织替代物。然而，这些方法存在供体部位组织有限以及供体部位并发症等缺点1。因此，人们对可用于修复此类缺损的替代性组织替代物的需求日益增长2。工程化组织构建物的厚度受限于营养物质和气体向细胞的扩散能力，因此，构建适当且功能完善的血管网络对于生成大尺寸、厚实且充分营养供给的支架至关重要。

已采用多种方法来促进工程化植入物的血管化3，包括 体内 招募宿主的血管支持、在支架内递送生长因子和细胞因子、植入物的预血管化、利用微图形化技术生成可灌注的分支微血管网络4, 使用牺牲材料形成血管通道/网络5以及在3D生物打印结构内形成通道5,6厚组织的血管化需要构建包含大尺度血管和微毛细血管尺度血管的分级血管网络。大尺度血管可有效将血液分布至整个结构，并允许与宿主血管进行显微外科吻合，而微毛细血管尺度血管则有助于营养物质的扩散。

近年来，由于生物打印技术相较于传统组织工程方法具有诸多优势，已受到广泛关注。组织和器官是具有特定结构的复杂而精细的三维物体。三维生物打印技术能够以高分辨率逐层沉积生物材料，从而有望制造出复杂的组织和器官替代物（如肾脏、肺、肝脏）7。目前已有多项打印技术被应用于生物打印，包括基于挤出的技术、喷墨打印8、激光辅助沉积9,10以及基于立体光刻的技术11,12。其中，基于挤出的技术通过在材料本体表面施加压力，使材料从喷嘴中挤出成形。

自由形态可逆嵌入悬浮水凝胶（FRESH）是一种生物打印技术13,14，该技术使用颗粒状支撑材料，挤出的材料被沉积并固定在支撑浴中。支撑浴为挤出的、尚未交联的生物墨水在交联前提供机械支撑。该技术的主要优势在于，支撑浴能够支持低粘度材料的挤出，这些材料在挤出后至交联前无法维持其形状15。这扩大了可用作生物墨水的材料范围。

本文介绍了一种构建包含微尺度和中尺度血管网络的血管化皮瓣的实验方案。为实现这一目标，首先在重组人胶原蛋白甲基丙烯酰胺（rhCollMA）水凝胶中生物打印出自组装的微血管网络，随后该网络与一个较大的、可植入的血管支架内部相连，从而形成完全工程化的组织皮瓣16。为了实现工程化组织的快速且直接灌注，需要通过显微外科技术将支架血管与宿主血管进行直接吻合。然而，该血管支架的缝合保持强度不足以采用传统的显微外科血管壁缝合方式进行吻合。因此，本文描述了一种"cuff"17,18,19方法，用于实现与大鼠股动脉的吻合。该方法通过环形缝合固定血管断端，无需穿透血管壁即可完成吻合。

尽管本方案旨在研究rhCollMA环境中分级血管系统，但该方法可拓展并应用于多种新领域。该方案可用于在不同生物墨水中进行多种组织特异性细胞的生物打印。此外，构建物的几何形状和尺寸可轻松调整，以满足特定需求，例如大尺寸组织重建或生物学研究。

方案

所有动物实验均经以色列理工学院临床前研究管理局（PCRA Technion，伦理批准编号：058-05-20）批准，并在其监督下进行。实验使用雄性Sprague-Dawley大鼠（275–350 g）。有关本实验方案中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 血管支架的制备

  1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件创建所需血管支架形状的三维计算机模型，或从在线资源库下载所需血管结构的3D文件。
    1. 创建一个内径为0.9 mm、外径为2 mm、高度为18 mm的圆柱体。沿圆柱体侧壁添加直径为0.22 mm的径向开窗。
  2. 使用3D设计软件创建支架的模具，并将其导出为.stl文件。接着，在设计中添加一个漏斗结构，以便后续更容易填充模具。
  3. 将.stl文件导入熔融沉积成型（FDM）3D打印机的切片软件中。以0.1 mm的层高对模型进行切片，并将其导出为.gcode文件，或直接发送至3D打印机。
  4. 使用配备0.25 mm喷嘴的FDM 3D打印机，以水溶性丁烯二醇乙烯醇共聚物（BVOH）长丝打印模具。打印完成后，将模具存放在真空干燥箱中，直至使用。
    警告：避免用手直接接触BVOH长丝，因其对湿气敏感。此外，建议将长丝储存于真空干燥箱中，以防受潮。
  5. 配制聚-L-乳酸（PLLA）与聚乳酸-共-乙醇酸（PLGA）按1:1比例混合的1,4-二氧六环溶液。
    1. 称取350 mg PLLA和350 mg PLGA，转移至20 mL玻璃小瓶中。
    2. 用量筒量取10 mL 1,4-二氧六环，用玻璃移液管转移至玻璃小瓶中，并向小瓶中加入一根小型磁力搅拌子。
      警告：1,4-二氧六环为有害有机溶剂，操作时应佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱内进行。
    3. 将玻璃小瓶置于70 °C的热水浴中，持续搅拌过夜，直至所有聚合物完全溶解。将所得溶液储存于密封的玻璃容器中，备用。
  6. 用PLLA:PLGA溶液填充BVOH模具。
    1. 使用正向置换移液器量取30 µL聚合物溶液，注入模具中。
      注意：填充模具所需的溶液体积取决于所设计血管的体积。持续添加聚合物溶液，直至模具的漏斗部分完全充满。
    2. 将模具在100 × g 条件下离心2分钟，再补充20 µL聚合物溶液，以确保模具完全填满。
  7. 将填充后的模具置于-80 °C下冷冻至少30分钟，确保所有聚合物溶液完全冻结。随后将模具进行过夜冷冻干燥，以去除溶剂。
    注意：冷冻干燥过程完成后，模具内聚合物的颜色应由透明变为白色。
  8. 为去除牺牲性模具材料，将冷冻干燥后的模具转移至5 L去离子水浴中，在轻微搅拌条件下浸泡。当水变浑浊时及时更换。待所有BVOH完全溶解后，将支架自然风干，并储存于真空干燥箱中备用。

2. 用纤连蛋白包被血管支架

  1. 将PLLA:PLGA血管支架浸入70%乙醇中30分钟，进行消毒。
  2. 用PBS洗涤支架，每次5分钟，共洗3次。
  3. 在PBS中配制50 µg/mL的人纤维连接蛋白溶液，并用其包被支架。
    1. 将500 µL纤维连接蛋白储备液（1 mg/mL）与9.5 mL PBS混合。
    2. 将已消毒的血管支架浸入该纤维连接蛋白溶液中，在37 °C孵育60分钟，以促进蛋白吸附。
  4. 孵育结束后，用PBS冲洗支架以去除未结合的纤维连接蛋白。将包被后的支架储存于4 °C，最多可保存1周。

3. rhCollMA 生物墨水的制备

  1. 准备磷酸盐缓冲液以中和酸性的rhCollMA生物墨水储备液。
    1. 通过将5.495 g Na2HPO4、1.55 g NaH2PO4和30 mg NaCl溶解于50 mL去离子水中，配制10倍浓度的磷酸盐缓冲液储备液。
    2. 将1份10倍浓度磷酸盐缓冲液与9份去离子水混合，制备10倍稀释的1×磷酸盐缓冲液。
  2. 将900 µL rhCollMA储备液与100 µL 10倍浓度磷酸盐缓冲液混合，以中和酸性rhCollMA溶液。
  3. 用适量的1×磷酸盐缓冲液稀释中和后的rhCollMA溶液，使其达到目标浓度10 mg/mL。
    注意：rhCollMA储备液的浓度因批次而异，因此所需1×磷酸盐缓冲液的体积也会有所不同。
  4. 配制将与稀释后的中性rhCollMA混合的致孔剂-光引发剂溶液（PEO-LAP）。
    1. 通过将160 mg聚环氧乙烷（PEO）溶解于10 mL不含酚红的DMEM中，配制1.6%（w/v）的PEO溶液。
    2. 向该溶液中加入20 mg二苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP），使溶液中LAP终浓度为0.2%（w/v）。此后，需用铝箔包裹溶液或将其置于避光处，以防光照降解。
    3. 通过0.22 µm滤膜过滤除菌PEO-LAP溶液，并于4 °C保存，最多可保存1周。
  5. 在进行生物打印前，按1:1体积比将稀释后的中性rhCollMA溶液与PEO-LAP溶液混合，得到最终的生物墨水溶液。应使用移液器混合，避免使用涡旋振荡器，以防止产生气泡。
  6. 若溶液中引入了大量气泡，可在2,000 × g条件下离心30秒。离心后再次轻轻混匀生物墨水溶液，以确保其均匀性。

4. 颗粒支撑浴的制备

  1. 制备明胶颗粒支撑材料。
    1. 在生物安全柜中，将一支2 g冻干支撑材料管中的内容物分装至两个无菌的50 mL锥形管中，每管约含1 g。
    2. 向每根管中加入40 mL冷的（4 °C）不含酚红的DMEM培养基，剧烈涡旋振荡，直至所有冻干支撑材料完全溶解。
    3. 将所得悬液置于4 °C静置，使支撑材料充分再水合。
    4. 将支撑材料置于真空腔中脱气30分钟，以减少气泡产生。
    5. 以2,000 × g离心5分钟。确保材料完全沉淀至管底，上清液澄清透明。
    6. 小心吸除上清液，避免吸入管底的支撑材料。
      注意：去除上清液后，倾斜管子时支撑材料不应流动。若材料发生流动，请使用相同离心条件再次离心，无需添加新的上清液。
  2. 使用正向置换移液器将约4 mL已制备并压实的支撑材料转移至12孔板的每个孔中。将孔板轻敲于坚硬表面，促使支撑材料在孔内均匀铺展。
    注意：推荐的支撑材料最小体积应为待打印结构体积的3倍。
  3. 将含有支撑材料的孔板置于冷却的生物打印平台或4 °C环境中，直至使用，以防止明胶颗粒融化。

5. 将内皮细胞和支持细胞与生物墨水结合

  1. 根据制造商说明，将基础培养基与其相应的培养基试剂盒组分（包括抗生素溶液、胎牛血清和内皮细胞生长补充剂）混合，配制内皮细胞培养基。
  2. 通过将 500 mL 低糖 DMEM、58 mL 胎牛血清、5.8 mL 非必需氨基酸（NEAA）、5.8 mL 谷氨酰胺替代物、5.8 mL 1 M HEPES 和 5.8 mL 青霉素-链霉素-制霉菌素溶液混合，配制牙髓干细胞培养基。
  3. 在 10 mL 内皮细胞培养基中制备含有 2 × 106 个表达 ZsGreen1 的人脂肪微血管内皮细胞（HAMEC-ZsGreen1）和 6 × 106 个牙髓干细胞（DPSCs）的细胞悬液。
  4. 将细胞悬液在 200 × g 条件下离心 4 分钟，获得细胞沉淀。吸除上清培养基。
  5. 将细胞沉淀重悬于 1 mL 事先配制好的 rhCollMA 生物墨水（含 PEO-LAP）中，得到每 1 mL 生物墨水中含 8 × 106 个细胞的总细胞浓度。
    注意：将生物墨水与细胞混合后，应立即进行下一步操作。若细胞悬液放置时间过长，细胞会沉降至管底，导致活力下降。对于不涉及细胞的实验，可跳过步骤 5.1–5.5，或在生物墨水中加入荧光微珠以替代细胞，从而增强打印结构的显微观察效果。
  6. 将细胞-生物墨水混合物转移至打印 cartridge 中。
    1. 将内径为 0.22 mm 的针头安装至 3 mL 棕色打印 cartridge 上，并将 cartridge 置于 50 mL 圆底离心管中。
    2. 使用正向置换移液器从顶部将 1 mL 细胞-生物墨水混合物加入打印 cartridge，以减少气泡产生。
  7. 将打印 cartridge 安装至生物打印机的相应工具位上。

6. 使用 rhCollMA 生物墨水进行微血管网络的生物打印

  1. 为生物打印的微血管网络创建一个三维 CAD 设计。
    1. 绘制一个包含中心直径为 2 mm 圆形通道的 4 mm 正方形的二维图案。将该草图沿高度方向拉伸 4 mm，得到一个尺寸为 4 mm × 4 mm × 4 mm 且带有中心通道的立方体。将此对象导出为 .STL 文件。
  2. 将 12 孔板的 .STL 模板导入生物打印机切片软件的 实体建模 选项卡，并将其放置在虚拟打印平台的指定区域。
  3. 将立方体形状的 .STL 文件导入生物打印机切片软件的 实体建模 选项卡。点击 对象属性 区域下的 使用外部切片器 复选框 | 配置切片器。在弹出窗口中，选择“直线填充模式”，并在 填充密度 栏中输入 30%，然后点击 确认。
  4. 通过点击立方体并使用鼠标移动，将立方体形状复制到每个目标虚拟孔中。
  5. 在生物打印机切片软件的 材料 选项卡中，点击 添加材料 按钮，为 rhCollMA 生物墨水创建新的材料设置。选择适合打印的参数：在 压力 栏中输入 2 psi，在 速度 栏中输入 20 mm/s。
    注：每种生物墨水材料都有其特定的打印参数，这些参数可保存在应用程序的材料列表中。
  6. 在相应的输入框中分别输入 线宽 和 线高 值为 0.24 mm，并将 加速度 值设为 400 mm/s2。
  7. 在 实体建模 选项卡中，点击立方体对象，然后从 材料 区域选择 rhCollMA 材料，将其分配给该立方体形状。切换至 生物组装 选项卡，点击 发送打印任务 按钮，将打印任务发送至生物打印机。
  8. 将装有细胞生物墨水的打印 cartridge 装入基于 3D 挤出的生物打印机的 3 mL 常温气动分配工具中。
  9. 在生物打印机界面屏幕的 控制-加热/冷却 选项卡下，点击 冷却 按钮，将打印平台温度设置为 4 °C。将含有支撑浴液的培养板装载到打印平台上。
    注：由于环境温度差异或生物墨水批次间的变异性，打印压力和速度的参数可能需要调整。例如，在较冷的环境中，需要更高的压力或更慢的速度才能挤出相同量的材料。
  10. 在生物打印机界面屏幕的 打印 选项卡中，点击第 6.7 步发送的打印任务，然后点击 开始 | 执行 以启动打印任务。
  11. 打印完成后，将培养板暴露于波长 405 nm、光强为 3 mW/cm2 的光源下照射 30 秒，以启动 rhCollMA 生物墨水的交联反应。
  12. 交联后，将培养板置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育至少 20 分钟，直至所有支撑浴液完全融化。
  13. 轻柔吸除液化的支撑浴液，并替换为内皮细胞培养基。将构建物继续在 37 °C、5% CO2 条件下孵育，直至用于后续实验步骤。
    ​注：由于打印后构建物可能发生收缩，建议在同一天内完成第 6 步和第 7 步的组装操作。

7. 组装生物打印的微血管网络与血管支架以获得工程化带血管化皮瓣

  1. 在去除生物打印微血管网络的支撑材料后，立即将纤维连接蛋白包被的PLLA:PLGA血管支架置入生物打印结构的主通道中。
  2. 将组装好的构建物在37 °C和5% CO2条件下孵育2天。
  3. 用内皮细胞包被血管支架的管腔。
    1. 制备浓度为1 × 107 个细胞/mL的表达tdTomato的人脂肪微血管内皮细胞（HAMEC-tdTomato）细胞悬液。
    2. 将20 µL该细胞悬液滴加至疏水表面（例如，非组织培养[nonTC] 10 cm培养皿）上。
    3. 轻轻将血管支架置于液滴上方，使支架一端的管腔与细胞液滴接触。
    4. 从支架的另一端（即未接触液滴的一端）抽吸液滴，使细胞悬液充满支架管腔。
    5. 将接种后的支架放入微量离心管中，置于湿润培养箱内的旋转仪上孵育60分钟；随后将支架转移至12孔板中，并加入2 mL内皮细胞培养基。
  4. 将工程化皮瓣培养7天，每隔2天更换一次新鲜的内皮细胞培养基。

8. 工程化皮瓣的共聚焦显微镜观察与免疫荧光染色

  1. 培养 4 天和 7 天后，使用共聚焦激光扫描显微镜对组装的支架进行活细胞成像。
    1. 在显微镜图像采集软件中设定 ZsGreen1 和 tdTomato 荧光蛋白的荧光通道。
    2. 选择 5×/0.16 物镜并设置 0.5× 放大倍数（像素大小为 5 µm），定义包含 22 层、每层厚度为 41 µm 的 Z 轴层扫。
    3. 设定 3 × 2 拼接扫描，以成像并捕获整个结构。
  2. 调整激光强度和增益值，以获得清晰的荧光信号，避免信号饱和并尽量减少背景，然后采集图像。
  3. 使用显微镜图像采集软件或类似的图像分析软件，对采集的 Z 轴层扫图像进行最大强度投影，生成单张二维图像。
  4. 对感兴趣区域进行高倍成像。
    1. 切换至 10×/0.3 物镜并设置 0.5× 放大倍数（像素大小为 1.25 µm），定义包含 9 层、每层厚度为 41 µm 的 Z 轴层扫。
    2. 重复执行步骤 8.2–8.3。
  5. 培养 7 天后，将工程化皮瓣浸入 4% 多聚甲醛中固定 20 分钟。
  6. 用 PBS 洗涤结构 3 次，每次 5 分钟。
  7. 向结构中加入含 0.3% (v/v) Triton-X 的 PBS，室温孵育 15 分钟，以通透细胞。
  8. 用 PBS 洗涤结构 3 次，每次 5 分钟。
  9. 将 5% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 溶解于 PBS 中，配制封闭液。将封闭液加入工程化皮瓣中，室温孵育 1 小时。
  10. 将小鼠抗平滑肌肌动蛋白 (anti-SMA) 抗体按 1:50 稀释于前述 5% BSA 溶液中，配制一抗溶液，用于标记表达 SMA 的支持细胞。
  11. 将支架置于一抗溶液中，4 °C 过夜孵育。
  12. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  13. 将 Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体 (1:400 稀释) 和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI, 2.5 µg/mL) 溶于 PBS 中，配制二抗溶液。
  14. 将二抗溶液加入支架中，室温孵育 3 小时。
  15. 用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  16. 将结构置于 PBS 中，4 °C 保存，最长可保存 1 个月。
  17. 使用共聚焦激光扫描显微镜对染色后的支架进行成像。
    1. 在显微镜图像采集软件中设定三个荧光通道（DAPI、ZsGreen 和 Cy3）。
    2. 定义总厚度为 50 µm、每层厚度为 2 µm 的 Z 轴层扫。随后设定拼接扫描，以成像结构的更大区域。
    3. 调整采集参数，以获得清晰的荧光信号，避免信号饱和并尽量减少背景。
    4. 使用 20×/0.8 物镜并设置 1.0× 放大倍数（像素大小为 0.31 µm）采集图像。
  18. 使用显微镜图像采集软件或类似的图像分析软件，对采集的 Z 轴层扫图像进行最大强度投影，生成单张二维图像。

9. 使用套管技术将构建的皮瓣直接吻合至大鼠股动脉

  1. 准备并灭菌（高压灭菌）以下外科器械：15号手术刀、一把细齿镊子和一把小型环柄剪刀。此外，准备并灭菌以下显微外科器械：直头精细尖头3号珠宝匠镊子、弯头珠宝匠镊子、带弯曲钳口的圆柄持针器、一对血管扩张器、解剖剪、外膜剪以及带施用器的血管夹。
  2. 通过将5 mL肝素储备液与195 mL生理盐水混合，配制100 IU/mL的肝素化生理盐水溶液。
  3. 切割并灭菌聚酰亚胺套管。
    1. 在解剖显微镜下切割聚酰亚胺管，制成2.5 mm长的节段。
    2. 在每个节段的一端，沿管壁纵向切开1.25 mm，以形成套管手柄。在另一端做斜切，便于血管外翻。
    3. 将套管浸入70%乙醇中，随后用肝素化生理盐水冲洗两次。
  4. 准备一只雄性Sprague-Dawley大鼠（275–350 g）进行手术。
    1. 术前7天开始，每天皮下注射环孢素（10 mg kg-1），以实现免疫抑制。
    2. 手术前，使用3%异氟烷吸入麻醉，按照机构标准操作程序通过诱导室进行麻醉。通过捏压双足并检查反射来确认深度麻醉状态。
    3. 皮下注射镇痛药布托啡诺（0.03 mg kg-1）和抗凝剂肝素（200 IU kg-1）。
    4. 在动物眼睛上涂抹润滑性眼膏，防止脱水。
    5. 剃除大鼠手术区域的毛发，并用碘液和70%乙醇对术区进行消毒。使用胶带将动物四肢固定在手术台上。
  5. 暴露并分离股总动脉。
    1. 沿腿部与腹部之间的凹陷处做一条长约2 cm的斜切口，切开皮肤。
    2. 使用镊子和钝头剪刀将皮肤从下方组织分离，以显露腹股沟脂肪垫。
    3. 使用剪刀和镊子，从脂肪垫的上缘、内侧和下缘将其完全剪除。注意不要损伤脂肪垫下方的大血管。
    4. 将脂肪垫向外侧翻转，保留腹壁下血管完整。将湿润纱布覆盖在翻转的脂肪垫上，防止干燥，并将其固定。确保股总血管清晰可见。
      注：该脂肪垫后续将用于对吻合口施加轻柔压力。
    5. 从近端的腹股沟韧带到远端的腹壁下动脉分支点处，将股动脉从其鞘膜中游离出来以充分暴露。
      注意：股动脉下方通常有一分支，常称为Murphy支。注意不要损伤这一难以观察的分支。
    6. 结扎并切断Murphy支，然后在股动脉中段用两条相距1 mm的结扎线结扎股动脉。保留其中一条结扎线的一端较长，以便后续将血管末端拉入套管中。
  6. 使用外膜剪在两条结扎线之间剪断动脉。
    注意：执行此切割时不应有出血。若动脉断端出血，应夹闭动脉并重新结扎。
  7. 利用结扎线的长端，将每根血管末端插入上一步准备好的聚酰亚胺套管中，使两个套管的手柄彼此朝向相反方向。
  8. 插入后，同时在套管手柄和血管上施加夹子，以固定套管位置。
  9. 准备一支配备27 G针头的注射器，内含肝素化生理盐水溶液。
  10. 牵拉已结扎的血管末端，并在靠近结扎线处将其剪断。立即用肝素化生理盐水彻底冲洗血管末端，直至管腔内无可见血液。
    注意：必须充分冲洗血管末端，因残留血液会形成血栓，手术完成后进入血流可能导致血管闭塞及下肢灌注丧失。
  11. 一手握住血管鞘膜，另一手持血管扩张器扩张血管管腔，以扩大其内径。
  12. 在套管本体周围放置一根松散的6-0聚丙烯环形缝线。使用两个血管扩张器将血管末端外翻至套管本体上，并通过收紧环形缝线将其固定。
    注：若操作过程中夹闭的血管出现渗血，需用肝素化生理盐水彻底冲洗管腔。
  13. 用肝素化生理盐水冲洗构建的皮瓣，然后将带血管的套管插入血管支架的管腔内。在支架与套管本体周围施加6-0聚丙烯环形缝线，将支架固定到位。对血管支架的两侧均执行此步骤。
  14. 在吻合部位周围包裹一层0.2 µm聚苯乙烯膜滤器，以隔离构建的皮瓣与周围组织。
  15. 先松开远端夹子，再松开近端夹子，以恢复血管内的血流。
  16. 若吻合口有出血，将脂肪垫复位覆盖于股血管之上，并用无菌纱布施加轻柔压力3分钟。
  17. 使用6-0聚丙烯缝线将脂肪垫缝合复位，然后使用5-0 PGA可吸收缝线缝合皮肤。
  18. 用生理盐水清洁伤口区域，并涂抹碘溶液。
  19. 术后镇痛及动物管理：在饮水中配制0.1%（v/v）曲马多溶液。此外，每日皮下注射肝素（200 IU kg-1）和环孢素（10 mg kg-1）。
  20. 将动物单独置于清洁笼内，并放置于加热灯下。持续监测动物状态，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。

结果

本方案描述了一种工程化皮瓣的制备方法，该皮瓣由血管支架（图1Ai）和生物打印的微血管网络（图1Aii）组成，二者组装后形成介观和微观尺度的血管结构（图1Aiii）。根据本方案，设计并3D打印出用于血管支架的BVOH模具（图1B，C）。对所获得的打印结构进行目视检查，查看是否存在细小的BVOH丝状残留物，这些残留物可能出现在模具的空腔区域（图1D）。此类丝状物通常表明材料参数设置不当或BVOH已吸收水分。应清除这些残留物，因其可能导致模具填充不完全，并在最终的血管支架中引发结构缺陷。随后，按照方案所述，将PLLA:PLGA溶液注入模具，接着进行冷冻干燥及洗涤步骤。所得PLLA:PLGA血管支架需进行目视检查，以确认管壁完整性及管腔通畅性（图1E）。

将浓度为 10 mg/mL 的中和 rhCollMA 生物墨水与 PEO:LAP 溶液按 1:1 比例混合。用 Zs-Green1 标记的人脂肪微血管内皮细胞和牙髓干细胞重悬于 rhCollMA 生物墨水中，将混合液装入打印 cartridge 并置于打印机上。在明胶支撑浴中，打印出具有中心通道的矩形结构，其填充模式为直线交叉（图 1D）。打印完成后，对结构进行交联处理，随后溶解并洗去支撑浴。培养 4 天后，对结构进行活体成像，以检测微血管网络的自组装情况。图 1D 展示了生物打印结构中高度发育的 HAMEC-ZsGreen1 微血管网络示例。

接下来，将纤维连接蛋白包被的血管支架插入打印结构的中央通道中（图2A）。组装好的结构培养2天，期间细胞收缩凝胶，使其牢固附着于血管支架上。随后，根据实验方案，用表达tdTomato的HAMECs细胞对血管支架进行内衬。培养7天后，对结构进行固定并成像。图2B展示了组装结构的侧面视图，其中生物打印微血管中的内皮细胞显示为绿色，而血管支架的内皮层显示为红色。图像显示，在生物打印凝胶中形成了绿色的微血管自组装结构，而血管支架则被红色的内皮细胞所包覆。在更高倍镜下，可见从红色内皮层起源的新生血管芽出并吻合至生物打印的微血管网络（图2C）。随后，对结构进行α-平滑肌肌动蛋白（SMA）染色，以标记牙髓干细胞。免疫染色完成后，使用激光扫描共聚焦显微镜对结构进行成像（图2D）。

最后，在培养7天后，按照方案所述，将构建的皮瓣通过显微外科技术吻合至大鼠股动脉。代表性操作视频见补充视频S1。图2E展示了夹闭器移除前完成吻合的代表性图像，图2F展示了移除夹闭器并实现止血后吻合部位的代表性图像。在伤口闭合前应无可见出血。

血管支架的3D生物打印过程示意图；图像显示支架设计、结构和细胞。
图1：所制备的中尺度和微尺度血管的代表性图像。（A）本实验方案步骤的示意图。经许可转载16。（B）血管支架牺牲模具的计算机辅助设计（CAD）图。（C）代表性3D打印牺牲模具的侧视图（比例尺 = 0.5 mm）。（D）牺牲模具的顶视图（比例尺 = 0.5 mm）。（E）采用本方案制备的代表性血管支架（比例尺 = 5 mm）。（F）3D生物打印重组人胶原甲基丙烯酰胺（rhCollMA）微血管网络的CAD设计图。网格线间距 = 1 mm。（G）高度发育的生物打印血管网络的代表性图像，其中HAMEC-ZsGreen1呈绿色。比例尺 = 200 µm。缩写：CAD = 计算机辅助设计；rhCollMA = 重组人胶原甲基丙烯酰胺；HAMEC = 人脂肪微血管内皮细胞；PLLA = 聚-L-乳酸；PLGA = 聚乳酸-共-乙醇酸。（请点击此处查看该图的放大版本。）

工程化组织灌注研究；HAMVEC-diTomato，HAMVEC-ZsGreen；显微镜，血管化。
图2：组装的血管化皮瓣的代表性图像。 （A）生物打印微血管系统与血管支架组装结构的代表性照片。比例尺 = 1 mm。（B）血管支架内皮化后第4天拍摄的工程化皮瓣侧视图。生物打印的微血管系统以绿色显示（HAMEC-ZsGreen1），内皮层以红色显示（HAMEC-tdTomato）。比例尺 = 1 mm。（C）生物打印的绿色血管系统与红色内皮层之间吻合的代表性图像。比例尺 = 200 µm。（D）孵育7天后平滑肌肌动蛋白（红色）、细胞核（蓝色）和内皮细胞（绿色）免疫荧光染色的代表性图像。比例尺 = 0.1 mm。（E）工程化皮瓣与大鼠股动脉完成吻合后、夹闭前，以及（F）松开夹闭后的代表性图像。缩写：HAMEC = 人脂肪微血管内皮细胞；SMA = 平滑肌肌动蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的放大版本。

补充视频 S1：将血管支架吻合至大鼠股动脉的代表性显微外科手术。 请点击此处下载该视频。

讨论

构建具有血管化的组织是组织工程领域的主要挑战之一20。目前用于构建工程化血管组织的方法主要集中于形成自组装的微血管网络21,22,23，或制造介观尺度的血管支架24,25，而未能重建可在植入后立即直接灌注的分级血管系统26。在本研究中，我们描述了一种利用两种3D打印技术制造包含微尺度和介观尺度血管结构的分级血管网络的实验方案。该方案结合了3D生物打印自组装的微血管网络与介观尺度血管支架，从而构建出可植入的血管化皮瓣。此外，本文还提供了一种将该皮瓣直接与大鼠股动脉进行吻合的实验操作流程。

近年来，3D生物打印因其相较于传统组织工程技术更广泛的适用性而受到关注。尽管本实验方案描述的是在rhCollMA生物墨水内构建微血管网络，但所采用的方法经过少量修改后，亦可广泛应用于大量已研究或新型的生物墨水及支撑浴体系27,28。我们选择rhCollMA作为生物墨水，是由于I型胶原蛋白在人体细胞外基质（ECM）中含量丰富，可为细胞附着提供适宜的环境。此外，rhCollMA通过植物重组表达生产，并进一步修饰了甲基丙烯酰基团，使其能够进行光聚合，形成稳定的三维水凝胶29,30。光交联过程通过添加光引发剂LAP实现，该引发剂已被证实无细胞毒性，且可被405 nm蓝光激活，从而避免了紫外光可能带来的光毒性。然而，光敏性生物墨水的使用要求在配制生物墨水和支撑材料时必须采用不含酚红的培养基。此外，本方案中描述了明胶支撑材料的使用，该材料可实现rhCollMA等生物墨水的高保真挤出打印。因此，在支撑材料制备过程中必须使用低温培养基，并确保打印平台处于冷却状态。过热可能由交联所用光源或环境温度升高引起，需特别注意。

本研究采用基于挤出的生物打印机来构建生物打印的微血管网络，目前已有多种 commercially available 的生物打印机可生成类似的结构。此外，所提出的方法可轻松修改并应用于研究不同的几何形状、尺寸和填充模式。在本工作中，选择直线型填充模式以形成相互连通的孔隙，该模式能够以较高的保真度快速打印。

气泡在挤出式生物打印中会带来显著挑战，尤其是在支撑材料内部。因此，必须尽量减少气泡的存在和形成，在转移支撑材料、制备生物墨水-细胞悬液以及将其转移至打印 cartridge 时，应使用正向置换移液器。

在本研究中，采用人脂肪来源的内皮细胞和牙髓干细胞作为支持细胞，因为这些细胞相对容易从患者体内分离获得。此外，选择总细胞浓度为 8 × 106 个细胞/mL，因为该浓度已被证明可形成最发达的血管网络16。尽管本方案可用于利用不同类型的细胞、不同来源的细胞以及不同的生物墨水生成微血管系统，但仍需对细胞浓度进行校准，以确定微血管网络发育的最佳条件。此外，可将组织特异性细胞（如成肌细胞或成骨细胞）掺入生物墨水中，以构建具有组织特异性的血管化组织瓣。

多孔血管支架的模具是使用市售的挤出式3D打印机，通过3D打印水溶性材料制备而成。该方法基于快速成型平台，具有成本效益高、可快速研究和筛选多种不同几何形状与尺寸的血管支架的优点31。然而，该方法的一个局限性在于大多数3D打印机的分辨率有限32。但随着增材制造行业的快速发展，这些限制有望随时间得到改善。该方案的另一个局限性是在制备过程中使用了有机溶剂，由于大多数有机溶剂对细胞具有毒性，因此无法将生物打印过程与血管支架的制备过程相结合。

与推动细胞悬液相比，采用负压抽吸的方式将细胞接种到支架腔内的方法对细胞的定位分布具有显著影响。使用负压可实现支架内腔的有效内皮化，同时最大限度减少细胞悬液通过支架壁上孔隙外溢的情况16。

所述用于显微外科吻合的"cuff"方法可轻松修改并适用于多种血管支架材料或尺寸，以及适用于多种动物模型中的不同动脉和静脉。对该方案的调整将包括使用不同尺寸的聚酰亚胺管和缝合线。该方法无需穿刺支架壁，从而避免可能由此引发的结构缺陷。本研究提供了一种具有广泛适用性的实验方案。该方案的关键环节，包括中尺度和微尺度血管的制备及其组装与植入，对于重建外科应用以及血管和其他组织工程研究中的工程化皮瓣而言，均具有重要意义。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本项目获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的资助（资助协议编号：818808）。rhCollMA由CollPlant公司（以色列雷霍沃特）慷慨提供。作者感谢以色列理工学院临床前研究管理局在动物护理方面的协助，同时感谢Janette Zavin、Galia Ben David和Idan Redenski。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二噁烷Biosolve 化学品42405
27 G × 0.5" 钝头分配针慢性髓性白血病供应901-27-050
3cc 棕色注射器筒 &活塞组Nordson EFD7012085使用琥珀色注射器以阻隔光线，防止过早交联
5-0 AssuCryl PGA 可吸收缝合线Assut缝合线用于皮肤伤口闭合的可吸收缝线
6-0 聚丙烯缝合线Assut缝合线9351
Acland钳S&和B-1V
外膜剪刀S&与SAS-15
斜角3号钟表镊S&安培与温度JFAL-3-18
BioAssemblyBot 400 3D生物打印机高级解决方案六轴三维生物打印机
牛血清白蛋白 ProbuminMillipore 82-045-1
布托啡诺vetmarketB15100
BVOH长丝逐字55903一种水溶性1.75 mm直径丝材
施加压力的钳夹镊子S&安培与温度CAF-4
牙髓干细胞LonzaPT-5025
Dietrich 牛头犬夹精细科学工具（FST）18039-45
磷酸氢二钠（Na2HPO₄Carlo Erba 试剂480141
解剖剪S&安培与温度18039-45
DMEM，高糖，无酚红赛多利斯01-053-1A
杜润泪爱尔康DJ03
ECM 培养基 + 子弹套装Sciencell#1001
乙醇 96%加多特团队64-17-5
GlutaMAXGibco35050061谷氨酰胺替代物
山羊抗小鼠Cy3抗体Jackson115-166-072
肝素钠  5,000 I.U./mLPanpharma-
人脂肪微血管细胞Sciencell#7200
人纤维连接蛋白SigmaF0895-5MG1 mg/mL 的储备浓度
Isoflurane，USP TerrellPiramal Critical CareNDC 66794-011-25
生命支持Advanced Biomatrix5244用于FRESH 3D生物打印的明胶支撑悬液
苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂（LAP）Sigma-Aldrich900889
低葡萄糖DMEM生物工业公司01-050-1A
MICROMAN E M1000E，100–1,000 µLGilsonFD10006
小鼠抗SMA抗体DakoM0851
非必需氨基酸（NEAA）Gibco11140068
持针器精细科学工具（FST）12500-12
4% PBS中的多聚甲醛溶液ChemCruz SC-281692
青霉素-链霉素-制霉菌素溶液生物工业公司03-032-1B
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaP5368-10PAK
聚(乙二醇)，分子量 250,000 至 400,000Acros Organics178602500
聚-L-乳酸，IV 5.0 dl/g（PLLA）Polysciencse, Inc.18582-10
聚酰亚胺管，内径：0.0249"，OD：0.0273"Cole-Parmer95820-05用于制作显微外科吻合术套管的薄壁管
Prusa I3 MK2.5 3D 打印机Prusa Researchhttp://www.prusa3d.com/一款流行的商用3D打印机
Resomer RG 503 H，聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)（PLGA）赢创工业集团719870
rhCollMACollPlanthttps://collplant.com/由 CollPlant（以色列雷霍沃特）慷慨提供
圆柄持针器S&&和B-15-8
手术刀柄 - #3Fine Science Tools (FST)10003-12
小型精细直剪Fine Science Tools (FST)14090-09
氯化钠Biosolve 化学品19030591
磷酸氢二钠（NaH2PO4Riedel-de Haen4276
Solidworks达索系统CAD 软件
3号直头镊子S&&和JF-3-18
直齿镊精细科学工具（FST）11050-10
手术刀片15号斯旺-莫顿有限公司305
Triton-X 100BioLab LTD57836
TSIM高级解决方案用于BioAssembly Bot的3D切片与设计软件
血管扩张器S&与D-5a.1
蔡司 Tivato 700 手术显微镜Zeiss

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