水中抗生素抗性细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征

摘要

本文介绍了一种从水体中分离和鉴定耐药细菌的详细方案，以及对其耐药基因（ARGs）进行分子表征的方法。通过基于培养和非培养依赖性（宏基因组分析）技术的结合，可全面了解印度孟买淡水环境中细菌多样性的总体情况以及存在的各类耐药基因的总库。

摘要

淡水体相关微生物群落中抗生素耐药性（AR）的发展与传播是全球公共卫生的重大关切问题。本研究采集了淡水样本，结合传统基于培养的技术和高通量非培养依赖型宏基因组学方法，对样本中的总细菌多样性及抗生素耐药基因（ARGs）进行了分析。本文提供了一套系统性实验方案，用于定量淡水样本中可培养的总细菌及抗生素耐药性可培养细菌，并对可培养分离株进行表型和基因型耐药性的鉴定。此外，我们还报道了对从淡水样本中提取的总宏基因组DNA进行全宏基因组分析的方法，以鉴定水体中整体细菌多样性（包括不可培养细菌）以及全部不同ARGs（耐药组）的组成。依据这些详细的操作流程，我们观察到淡水样本中抗生素耐药细菌负荷较高，范围达9.6 × 10⁵-1.2 × 10⁹ CFU/mL。大多数分离株对多种测试抗生素具有耐药性，包括头孢噻肟、氨苄西林、左氧氟沙星、氯霉素、头孢曲松、庆大霉素、新霉素、甲氧苄啶和环丙沙星，其多重抗生素耐药（MAR）指数≥0.2，表明分离株具有较高的耐药水平。16S rRNA测序鉴定出潜在的人类病原体，例如 肺炎克雷伯菌, 以及机会性细菌，例如 康氏菌 sp.， 微球菌属 spp. 节杆菌属 种（复数形式）., 和 气单胞菌属 spp。对分离株的分子特征分析显示存在多种ARGs，例如 blaTEM, blaCTX-M （β-内酰胺类） aadA, aac(6')-Ib （氨基糖苷类），以及 dfr1 （甲氧苄啶），这一点也通过全宏基因组DNA分析得到了证实。其他编码抗生素外排泵的抗生素抗性基因（ARGs）也表现出较高的 prevalence。mtrA, macB, mdtA, acrDβ-内酰胺酶-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ 的 氯霉素乙酰转移酶基因 catB10 和 利福平抗性基因 rphB-在宏基因组DNA中也检测到了该基因。通过本研究讨论的实验方案，我们证实了水体中存在具有多种耐药表型和基因型特征的水传播多重耐药细菌。因此，全宏基因组DNA分析可作为传统基于培养技术的补充方法，用于评估水体的整体耐药状况。

引言

抗菌素耐药性（AMR）已被确定为全球最紧迫的问题之一。AMR 的快速演化及其在全球范围内的传播，因其相关的医疗成本，已成为威胁人类健康和全球经济的最大挑战之一¹。抗生素的过度使用和不当使用导致了耐药性的增加。这一点在 COVID-19 大流行期间尤为突出，许多患者因存在 AMR，其相关继发性感染的治疗在很大程度上受到严重影响²。除了人类对抗生素的直接使用或滥用外，农业和畜牧业中抗生素的过度使用和不当使用，以及将其不当排放到环境中（包括水体），也是一个重大关切问题³。细菌中新耐药性状和多重耐药性的出现，迫切凸显了深入理解导致耐药性产生及其传播因素的重要性。多种抗生素耐药菌通常在质粒等可移动遗传元件上携带多个耐药基因（ARGs），可将这些耐药基因转移给非耐药微生物，包括潜在的人类病原体，从而导致“超级细菌”的出现，甚至对最后手段的抗生素也无效⁴。如果这些多重耐药菌存在于水生生态系统中，可通过食用受污染的水产品（如鱼类、螃蟹和软体动物）直接进入人体肠道。via 此途径。先前的研究表明，自然水体系统中耐药菌的传播还可能波及其他水源，包括饮用水，从而进入人类食物链^5,6,

方案

1. 样本采集与处理

1. 样品采集
   1. 在无菌采样容器中采集适量体积的水样，确保容器填充量不超过其容量的3/4。
   2. 采集后应尽快在无菌条件下将样品运送至实验室，并立即进行处理。
2. 样品处理
   1. 使用无菌纱布对水样进行无菌过滤，以去除任何颗粒物。
   2. 对过滤后的水样进行适当的系列稀释，用于后续分析。

2. 总细菌载量及耐药细菌数量的估算

1. 细菌总负荷的测定
   1. 将 18.12 g 改良 R2A 琼脂粉末悬浮于 1,000 mL 双蒸水中，加热溶解。将溶解后的混合物在高压灭菌器中于 121 °C，15 psi 下灭菌 20 分钟。通过将适量高压灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中制备改良 R2A 琼脂平板（例如，向一个 90 mm 的无菌培养皿中加入约 20 mL 高压灭菌后的无菌培养基）。
   2. 均匀铺展 100 µL 将过滤后的水样适当稀释后，涂布于已凝固的改良R2A琼脂平板上。实验重复一次。
   3. 将上述所有平板置于35-37 °C 孵育48小时（根据所用分离培养基的不同，调整温度和孵育时间）。
   4. 以每毫升菌....

结果

总细菌负荷量与抗生素耐药性（AR）细菌计数
通过将水样稀释 10⁻⁴ 至 10⁻⁶ 倍后涂布于改良 R2A 琼脂培养基上，对总细菌负荷量进行计数。为测定 AR 细菌数量，将稀释 10⁻³ 至 10⁻⁶ 倍的样品涂布于含有抗生素的培养基平板上（图 3）。总细菌和 AR 细菌数量均以 CFU/mL 表示，所有涂板实验均设两个重复。根据上述实验方案，本研究测得总细菌数量为 3.0 × 10⁹ CFU/mL。AR 细菌负荷量较高，范围为 9.6 × 10⁵–1.2 × 10⁹ CFU/mL（表 6）。

通过16S rRNA基因测序鉴定可培养细菌
每个分离株的粗提DNA均用作模板，进行16S rRNA基因特异性PCR扩增。在总共测序的15株抗性（AR）分离株.......

讨论

样本的采集与处理具有重要意义，可能影响研究结果及其解释。因此，为了排除样本间的变异性，应在所研究的淡水体多个不同位置进行采样。在处理此类样本时，维持适当的无菌环境条件可防止污染。此外，为避免细菌组成发生变化而影响提取核酸的质量和数量，样本从采集到后续处理的运输过程应保持在4 °C条件下，并尽量缩短时间间隔。已有多个研究指出，若未谨慎控制样本采集与处理之间的这一过渡期，可能在后续分析阶段导致结果出现差异^12,13。

使用不同稀释度进行涂布可确保菌落既不会重叠成团，也不会因数量过少而难以计数。实验需设置重复组，以消除因移液或操作误差导致的CFU/mL结果差异。此外，每次实验均需设置对照组平板，以确认所用抗生素有效，并排除假阳性结果。因此，对照组平板上应无可见菌落生长，这表明所用抗生素具有抑菌效果。

在进行药敏试验（AST）时，接种菌液的浓度和琼脂平板的厚度可能影响抑菌圈（ZOI）的直径，从而影响结果的判读。因此，在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 bp DNA 标准分子量标记	Himedia	MBT049-50LN	用于估计扩增片段的大小
2x PCR Taq 预混液	HiMedia	MBT061-50R	用于配制 PCR 反应体系
37 °C 培养箱	GS-192, Gayatri Scientific	NA	用于细菌培养
6x 上样缓冲液	HiMedia	ML015-1ML	上样和示踪染料，有助于增加 DNA 样品比重并监测电泳进程
琼脂糖粉末	Himedia	MB229-50G	用于琼脂糖凝胶电泳（AGE）中分离扩增产物
氨苄西林抗生素纸片	HiMedia	SD002	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
高压灭菌器	Equitron	NA	用于培养基、玻璃平板、试管等物品的灭菌
Bioanalyzer 2100	Agilent Technologies	NA	用于检测扩增文库的质量和数量
生物安全二级 B2 型柜	IMSET	IMSET BSC-Class II Type B2	用于细菌培养、抗生素敏感性试验（AST）等微生物学操作
头孢噻肟抗生素纸片	HiMedia	SD295E-5VL	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
头孢噻肟抗生素粉末	HiMedia	TC352-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
头孢曲松抗生素纸片	HiMedia	SD065	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
微量离心机 Minispin	Eppendorf	Minispin Plus-5453	用于粗提 DNA 过程中沉淀杂质
氯霉素抗生素纸片	HiMedia	SD006-5x50DS	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
环丙沙星抗生素纸片	HiMedia	SD060-5x50DS	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
环丙沙星抗生素粉末	HiMedia	TC447-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
比色计	Quest	NA	用于测定菌液悬浮液的光密度（OD）
综合性抗生素耐药基因数据库（CARD）			用于抗生素耐药基因（ARGs）的功能注释；https://card.mcmaster.ca/
冷却摇床培养箱	BTL41 Allied Scientific	NA	用于培养细菌的培养基平板的孵育
超低温冰箱（-40 °C）	Haier	DW40L, Haier Biomedicals	用于甘油菌种的保存
DNA 文库构建试剂盒	NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina	NA	用于双端测序文库的制备
EDTA	HiMedia	GRM1195-100G	用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液
电泳装置	TechResource	15 cm 凝胶制胶托盘	用于制备琼脂糖凝胶 并进行电泳
带电极的电泳电源	Genei	NA	用于运行琼脂糖凝胶电泳（AGE）
红霉素抗生素纸片	HiMedia	SD222-5VL	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
红霉素抗生素粉末	HiMedia	CMS528-1G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
红霉素抗生素粉末	HiMedia	TC024-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
Escherichia coli ATCC 25922	HiMedia	0335X-1	在进行抗生素敏感性试验（AST）时作为对照菌株
溴化乙锭	HiMedia	MB071-1G	用于电泳后在凝胶成像系统下对 DNA 进行嵌入染色和可视化
荧光计	Qubit 2.0	NA	用于测定提取的宏基因组 DNA 的浓度
凝胶成像系统	BioRad		用于电泳后观察 PCR 扩增产物
庆大霉素抗生素纸片	HiMedia	SD170-5x50DS	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
冰乙酸	HiMedia	AS119-500ML	用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液
甘油	HiMedia	GRM1027-500ML	用于制备甘油菌种保存液
亚胺培南抗生素纸片	HiMedia	SD073	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
Kaiju 数据库	NA	NA	用于测序读段的分类学归属分析；https://kaiju.binf.ku.dk/
卡那霉素抗生素纸片	HiMedia	SD017-5x50DS	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
卡那霉素抗生素粉末	HiMedia	MB105-5G	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
左氧氟沙星抗生素纸片	HiMedia	SD216-5VL	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
LB 肉汤培养基	Himedia	M1245-500G	用于菌液的富集培养
麦氏比浊标准	Himedia	R092-1No	用于比较菌液悬浮液的浓度
分子生物学用水	HiMedia	TCL018-500ML	用于配制 PCR 反应体系
穆勒-欣顿琼脂（MHA）	HiMedia	M173-500G	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
新霉素抗生素纸片	HiMedia	SD731-5x50DS	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
PCR 梯度热循环仪	Eppendorf	Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz	用于扩增 16S rRNA 区域及多种抗生素耐药基因的 PCR 反应
引物	Xcelris	NA	用于 PCR 扩增
改良 R2A 琼脂	HiMedia	M1743	用于制备培养基平板，以分离总细菌和抗生素耐药菌（AR）
支架序列生成	CLC Genomics Workbench 6.0	NA	用于生成支架序列
测序仪	Illumina 平台（2 x 150 bp 化学体系）	NA	用于扩增文库的测序
氯化钠	HiMedia	TC046-500G	用于配制 0.85% 生理盐水，以对水样进行系列稀释
土壤 DNA 提取试剂盒	Xcelgen	NA	用于从过滤后的水样中提取完整的宏基因组 DNA
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213	HiMedia	0365P	在进行抗生素敏感性试验（AST）时作为对照菌株
分类学归属分析	Kaiju 生物信息学工具	NA	用于将测序读段分类至从门到属的不同分类学层级
综合性抗生素耐药基因数据库（CARD）	NA	NA	用于抗生素耐药基因（ARGs）的功能注释
替加环素抗生素纸片	HiMedia	SD278	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
甲氧苄啶抗生素纸片	HiMedia	SD039-5x50DS	用于进行抗生素敏感性试验（AST）
Tris 碱	HiMedia	TC072-500G	用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液
万古霉素抗生素粉末	HiMedia	CMS217	用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
电子天平	Mettler Toledo	ME204 Mettler Toledo	用于称量培养基粉末、试剂粉末等
NA - 不适用