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方法文章

水中抗生素抗性细菌的分离与鉴定及其抗生素抗性基因的分子表征

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DOI：

10.3791/63934

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2023年3月3日

 , 
1Antimicrobial Research (AMR) Lab, Department of Biotechnology, University of Mumbai

本文内容

摘要

本文介绍了一种从水体中分离和鉴定耐药细菌的详细方案，以及对其耐药基因（ARGs）进行分子表征的方法。通过基于培养和非培养依赖性（宏基因组分析）技术的结合，可全面了解印度孟买淡水环境中细菌多样性的总体情况以及存在的各类耐药基因的总库。

摘要

淡水体相关微生物群落中抗生素耐药性（AR）的发展与传播是全球公共卫生的重大关切问题。本研究采集了淡水样本，结合传统基于培养的技术和高通量非培养依赖型宏基因组学方法，对样本中的总细菌多样性及抗生素耐药基因（ARGs）进行了分析。本文提供了一套系统性实验方案，用于定量淡水样本中可培养的总细菌及抗生素耐药性可培养细菌，并对可培养分离株进行表型和基因型耐药性的鉴定。此外，我们还报道了对从淡水样本中提取的总宏基因组DNA进行全宏基因组分析的方法，以鉴定水体中整体细菌多样性（包括不可培养细菌）以及全部不同ARGs（耐药组）的组成。依据这些详细的操作流程，我们观察到淡水样本中抗生素耐药细菌负荷较高，范围达9.6 × 105-1.2 × 109 CFU/mL。大多数分离株对多种测试抗生素具有耐药性，包括头孢噻肟、氨苄西林、左氧氟沙星、氯霉素、头孢曲松、庆大霉素、新霉素、甲氧苄啶和环丙沙星，其多重抗生素耐药（MAR）指数≥0.2，表明分离株具有较高的耐药水平。16S rRNA测序鉴定出潜在的人类病原体，例如 肺炎克雷伯菌, 以及机会性细菌，例如 康氏菌 sp.， 微球菌属 spp. 节杆菌属 种（复数形式）., 和 气单胞菌属 spp。对分离株的分子特征分析显示存在多种ARGs，例如 blaTEM, blaCTX-M （β-内酰胺类） aadA, aac(6')-Ib （氨基糖苷类），以及 dfr1 （甲氧苄啶），这一点也通过全宏基因组DNA分析得到了证实。其他编码抗生素外排泵的抗生素抗性基因（ARGs）也表现出较高的 prevalence。mtrA, macB, mdtA, acrDβ-内酰胺酶-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ 的 氯霉素乙酰转移酶基因 catB10 和 利福平抗性基因 rphB-在宏基因组DNA中也检测到了该基因。通过本研究讨论的实验方案，我们证实了水体中存在具有多种耐药表型和基因型特征的水传播多重耐药细菌。因此，全宏基因组DNA分析可作为传统基于培养技术的补充方法，用于评估水体的整体耐药状况。

引言

抗菌素耐药性（AMR）已被确定为全球最紧迫的问题之一。AMR 的快速演化及其在全球范围内的传播，因其相关的医疗成本，已成为威胁人类健康和全球经济的最大挑战之一1。抗生素的过度使用和不当使用导致了耐药性的增加。这一点在 COVID-19 大流行期间尤为突出，许多患者因存在 AMR，其相关继发性感染的治疗在很大程度上受到严重影响2。除了人类对抗生素的直接使用或滥用外，农业和畜牧业中抗生素的过度使用和不当使用，以及将其不当排放到环境中（包括水体），也是一个重大关切问题3。细菌中新耐药性状和多重耐药性的出现，迫切凸显了深入理解导致耐药性产生及其传播因素的重要性。多种抗生素耐药菌通常在质粒等可移动遗传元件上携带多个耐药基因（ARGs），可将这些耐药基因转移给非耐药微生物，包括潜在的人类病原体，从而导致“超级细菌”的出现，甚至对最后手段的抗生素也无效4。如果这些多重耐药菌存在于水生生态系统中，可通过食用受污染的水产品（如鱼类、螃蟹和软体动物）直接进入人体肠道。via 此途径。先前的研究表明，自然水体系统中耐药菌的传播还可能波及其他水源，包括饮用水，从而进入人类食物链5,6,7。

本研究的目的是提供一套综合方案，结合基于培养和非基于培养（全宏基因组分析）的技术，以全面获取印度孟买某水体中总细菌多样性及各类抗生素抗性基因（ARGs）库的完整信息。传统上，研究水体中细菌多样性主要采用基于培养的技术。由于可培养的微生物仅占任何生境中总微生物群的一小部分，因此为了更全面地了解样本中细菌多样性的整体状况以及普遍存在的各种抗性特征，必须联合使用基于培养和非依赖培养的技术。其中一种强大且可靠的非依赖培养技术即为全宏基因组DNA分析。该高通量方法已在多项关于细菌多样性或各类抗生素抗性基因功能注释的研究中成功应用8,9。该技术以宏基因组（样本中的全部遗传物质）作为多种分析的起始材料，因而无需依赖培养。本研究中的方案可用于水样中全宏基因组DNA分析，以获取有关总细菌多样性及各类抗生素抗性基因（耐药组，resistome）的信息。

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方案

1. 样本采集与处理

  1. 样品采集
    1. 在无菌采样容器中采集适量体积的水样，确保容器填充量不超过其容量的3/4。
    2. 采集后应尽快在无菌条件下将样品运送至实验室，并立即进行处理。
  2. 样品处理
    1. 使用无菌纱布对水样进行无菌过滤，以去除任何颗粒物。
    2. 对过滤后的水样进行适当的系列稀释，用于后续分析。

2. 总细菌载量及耐药细菌数量的估算

  1. 细菌总负荷的测定
    1. 将 18.12 g 改良 R2A 琼脂粉末悬浮于 1,000 mL 双蒸水中，加热溶解。将溶解后的混合物在高压灭菌器中于 121 °C，15 psi 下灭菌 20 分钟。通过将适量高压灭菌后的培养基倒入无菌培养皿中制备改良 R2A 琼脂平板（例如，向一个 90 mm 的无菌培养皿中加入约 20 mL 高压灭菌后的无菌培养基）。
    2. 均匀铺展 100 µL 将过滤后的水样适当稀释后，涂布于已凝固的改良R2A琼脂平板上。实验重复一次。
    3. 将上述所有平板置于35-37 °C 孵育48小时（根据所用分离培养基的不同，调整温度和孵育时间）。
    4. 以每毫升菌落形成单位（CFU/mL）表示总细菌负荷，使用公式（1):
      figure-protocol-1   (1)
  2. AR细菌数量的测定
    1. 按照步骤 2.1.1–2.1.4 操作。但与使用改良 R2A 琼脂平板不同，应分别使用添加了五种不同抗生素的改良 R2A 琼脂平板，即头孢噻肟（cefotaxime）3 µg/mL），环丙沙星（0.5 µg/mL），红霉素（20 µg/mL），卡那霉素（15 µg/mL），以及万古霉素（vancomycin）3 µg/mL).
    2. 将抗生素分别加入含有20 mL无菌熔融改良R2A琼脂的试管中（改良R2A琼脂的熔融温度应≤40 °C）以达到步骤 2.2.1 中所述的最终抗生素浓度。
    3. 轻轻混匀，趁琼脂未凝固前倒入无菌培养皿中。实验重复两次。
    4. 将上述所有平板置于35-37 °C 孵育48小时（若使用不同的培养基，温度和孵育时间可能有所不同）。
    5. 为进行质量控制并检测抗生素的有效性，涂布 100 µL 细菌悬液的 大肠杆菌 ATCC 25922 和 Staphylococcus aureus 将ATCC 29213菌株接种至各自含抗生素的改良R2A琼脂平板上（确保用于接种的新鲜培养物浓度为OD600 = 0.5）。
    6. 按照步骤 2.1.4 中所述，以 CFU/mL 为单位测定耐药细菌数量。
  3. 分离株的甘油菌种
    1. 挑选形态上不同的 AR 菌落。
    2. 将单个分离的菌落悬浮于2 mL含相应抗生素的无菌Luria-Bertani肉汤中（例如，若菌落选自含有头孢噻肟的平板，则将2.3.1步骤中的菌落接种至含相应浓度头孢噻肟的无菌Luria-Bertani肉汤中）。
    3. 将接种后的试管置于 37 °C 80 rpm 下直至 OD600 达到 0.5。
    4. 通过混合制备分离株的甘油菌种 750 µL 步骤 2.3.3 中的培养悬液 250 µL 在无菌条件下，加入无菌的100%甘油。
    5. 将甘油菌种保存于 −80 °C 直至进一步分析。
      注意：复苏甘油冻存菌种时，需将甘油冻存管在 4 °C将一环该菌种接种于含有相应抗生素的2 mL无菌LB肉汤培养基中，静置培养。

3. 通过16S rRNA基因测序鉴定可培养细菌

  1. PCR用DNA模板的制备
    注意：本实验中用于从细菌中提取粗DNA作为PCR模板的方案由Carlson等人10提供。
    1. 使用无菌牙签挑取培养在培养皿上的单个、分离且纯的菌落，将其悬浮于无菌微量离心管中含100 µL无菌双蒸水的溶液中，煮沸10分钟。
    2. 将悬浮液在10,000 × g 条件下离心2分钟以沉淀细胞碎片，将上清液转移至新的无菌微量离心管中，作为粗DNA模板使用。
  2. 16S rRNA基因V3区的靶向PCR扩增及测序
    1. 在PCR管中配制40 µL反应体系进行PCR扩增，具体组分见表1。
      注意：DNA制备过程应在冰上操作，尽量避免污染（操作试剂时应佩戴手套，并用70%乙醇彻底清洁工作台面）。
    2. 将PCR管放入热循环仪的加热模块中，运行相应的程序。标准化的PCR扩增循环条件及用于扩增16S rRNA基因V3区的引物信息见表2。
    3. 为分离和观察扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳（AGE）。取10 µL PCR扩增产物与2 µL 6x上样缓冲液（表3）混合，加样至1.5%琼脂糖凝胶的加样孔中（将1.5 g琼脂糖粉末溶于100 mL 1x TAE缓冲液中 [表3]），并在凝胶中加入5 µL 10 mg/mL溴化乙锭（EtBr），使溴化乙锭终浓度为0.5 µg/mL（100 mL凝胶中）。
      警告：EtBr为强致癌物，操作含EtBr的试剂及凝胶时必须始终佩戴手套。
    4. 加入DNA Marker以估算扩增片段的大小。
    5. 在TAE电泳缓冲液中以80–100 V电压进行凝胶电泳。
    6. 当示踪染料迁移至凝胶约3/4位置时，停止电泳，并在紫外透射仪下观察扩增条带。
    7. 将PCR扩增产物（扩增子）用于16S rRNA基因测序，以鉴定菌株。
    8. 通过分光光度法分析并使用公式（2）对扩增子进行定量。
      figure-protocol-2   (2)
    9. 为检测DNA纯度，计算A260/A280比值。
      注意：理想情况下，该数值应高于1.5，最好介于1.8至2.0之间。
    10. 通过使用适当的序列比对搜索工具，将所获得的序列与数据库中的序列进行比对，以鉴定菌株。

4. 采用抗生素药敏试验检测分离株的抗生素耐药性

注意：本方案描述了通过纸片扩散法进行抗生素敏感性试验（AST）的方法。所使用的抗生素纸片如下：头孢噻肟（5 µg）、氨苄西林（10 µg）、左氧氟沙星（5 µg）、氯霉素（30 µg）、替加环素（15 µg）、头孢曲松（30 µg）、亚胺培南（10 µg）、庆大霉素（10 µg）、新霉素（10 µg）、甲氧苄啶（5 µg）和环丙沙星（5 µg）。

  1. 药敏试验（AST）接种物的制备
    1. 使用无菌接种环，将单个、分离且纯化的耐药菌（AR）菌落无菌接种至2 mL无菌非选择性培养基（如不含任何抗生素的LB肉汤）中，在37 °C、80 rpm条件下过夜培养。
    2. 取100–150 µL过夜培养的菌液（约OD600 = 1.8–2.0）重悬于2 mL新鲜的非选择性LB肉汤培养基中，继续培养2–4小时（直至OD600达到0.4–0.5）。
    3. 用无菌0.85%生理盐水稀释该新鲜培养的菌悬液，使菌液浓度相当于0.5麦氏比浊标准（约OD600 = 0.1），相当于菌密度约为1–2 × 108 个细胞/mL。
    4. 轻轻混匀细菌悬液，确保细胞分布均匀。
    5. 稀释后15分钟内使用上述菌悬液。
  2. 琼脂平板的接种
    1. 通过将38 g Mueller-Hinton琼脂（MHA）溶于1,000 mL双蒸水中并加热溶解，制备用于药敏试验的MHA平板，121 °C、15 psi条件下高压灭菌15分钟。
    2. 确保平板中MHA的厚度为4 mm（每板25 mL培养基）。
    3. 同时，将抗生素纸片从冰箱中取出，并使其升至室温。
      注：为避免纸片表面冷凝水影响抑菌圈（ZOI）结果，应先将纸片在4 °C缓慢解冻，再转移至室温。
    4. 在无菌条件下，将无菌棉签浸入步骤4.1制备的接种物中，轻轻挤去多余液体，避免平板接种过量。
    5. 从MHA平板顶部开始，来回均匀涂布菌液至边缘，并在涂布过程中每涂布约60°旋转平板一次。
  3. 抗生素纸片的放置
    1. 使用火焰灭菌的镊子，在无菌条件下将抗生素纸片转移至已接种的MHA平板上，并轻轻按压纸片，确保其与琼脂表面完全、平整接触。
      注：此操作必须在平板接种后15分钟内完成。
    2. 根据待测菌种、所用抗生素及平板大小，合理放置适量抗生素纸片，避免抑菌圈重叠。
      注：直径90 mm的圆形平板可放置4至5个纸片。
  4. 平板的培养
    1. 在抗生素纸片放置后15分钟内，将平板倒置，在37 °C条件下过夜培养。
  5. 结果判读
    1. 测量抑菌圈（ZOI）直径（单位：mm），并依据EUCAST11提供的折点值进行判读。参见以下两个示例：
      1. 针对Enterobacterales，环丙沙星（5 µg）抗生素纸片的抑菌圈直径折点（mm）为S ≥ 25，R < 22，即当ZOI ≥ 25 mm时判定为敏感（S），ZOI < 22 mm时为耐药（R）。若ZOI直径介于22至25 mm之间，则该分离株判定为中介（I）。
      2. 针对Staphylococcus spp.，氯霉素（30 µg）抗生素纸片的抑菌圈直径折点（mm）为S ≥ 18，R < 18，即当ZOI ≥ 18 mm时为敏感，ZOI < 18 mm时为耐药。
    2. 通过计算分离株对所测试抗生素中耐药抗生素种类数与总测试抗生素种类数的比值，确定多重耐药指数（MAR指数）。
      ​注：质量控制中，按照步骤4的方案，使用E. coli ATCC 25922和S. aureus ATCC 29213作为标准参考菌株。

5. 通过PCR检测分离株中的抗生素抗性基因

  1. 采用标准PCR方案对分离株中的耐药基因（ARGs）进行鉴定。使用步骤3.1中所述的方案制备DNA模板。
    注意：本研究中使用的PCR扩增条件为：94 °C 预变性10 min，随后进行35个循环（94 °C 变性30 s，退火温度根据各引物对优化条件确定，退火30 s，72 °C 延伸40 s），最后在72 °C 延伸5 min。反应体系组成见表4。耐药基因（ARGs）、引物序列及退火温度列表见表5。
  2. 为分离、观察并检测扩增产物的纯度，请执行步骤3.2.3–3.2.10。

6. 宏基因组DNA分析，用于鉴定总细菌多样性及检测宏基因组中的抗生素抗性基因（ARGs）

  1. 从水样中提取总DNA（宏基因组）
    1. 从过滤后的水样中提取宏基因组DNA。
      注意：在本研究中，使用参考的DNA提取试剂盒并按照制造商提供的方案，从过滤后的水样中提取宏基因组DNA（总DNA）（见材料表）。
    2. 取3 µL提取的宏基因组DNA上样至0.8%琼脂糖凝胶，在80–110 V电压下电泳约30分钟，以检测DNA质量。
    3. 检查是否出现单一完整条带。
    4. 使用荧光计测定DNA浓度。
  2. 利用全宏基因组DNA测序分析细菌多样性及耐药基因（ARGs）的检测
    1. 文库制备与PCR扩增：
      1. 使用参考的DNA文库制备试剂盒制备双端测序文库（见材料表）。
      2. 取200 ng DNA，通过机械剪切将其打断为较小片段，随后进行末端修复，并在3'端添加一个“A”碱基，以准备接头连接。
      3. 根据所使用的测序平台，在DNA片段两端连接特定的接头。
        注意：这些接头中含有对双索引文库结合至流动池进行测序至关重要的序列，可实现接头连接片段的PCR扩增，并允许标准测序引物结合。
      4. 按照制造商说明，使用高灵敏度DNA芯片分析扩增后的文库，以检测其质量与数量。
    2. 簇生成与测序：
      1. 将扩增后的文库加载至相应的测序平台，进行簇生成及后续测序。
        注意：文库分子会结合到双端流动池上互补的接头寡核苷酸上。在测序过程中，逆转录链重新合成后，正向链被选择性切割，随后从片段的另一端对复制出的逆转录链进行测序。
    3. 生物信息学分析：
      1. 利用适当的平台对高质量数据进行拼接，生成支架序列（scaffolds）。
      2. 对这些支架序列进行生物信息学分析，以实现分类学注释及耐药基因（ARGs）的鉴定。
        注意：用于鉴定宏基因组中全部细菌多样性及检测耐药基因（ARGs）的全宏基因组DNA分析流程见图1。本文所述完整方法的流程图见图2。

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结果

总细菌负荷量与抗生素耐药性（AR）细菌计数
通过将水样稀释 10−4 至 10−6 倍后涂布于改良 R2A 琼脂培养基上，对总细菌负荷量进行计数。为测定 AR 细菌数量，将稀释 10−3 至 10−6 倍的样品涂布于含有抗生素的培养基平板上（图 3）。总细菌和 AR 细菌数量均以 CFU/mL 表示，所有涂板实验均设两个重复。根据上述实验方案，本研究测得总细菌数量为 3.0 × 109 CFU/mL。AR 细菌负荷量较高，范围为 9.6 × 105–1.2 × 109 CFU/mL（表 6）。

通过16S rRNA基因测序鉴定可培养细菌
每个分离株的粗提DNA均用作模板，进行16S rRNA基因特异性PCR扩增。在总共测序的15株抗性（AR）分离株...

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讨论

样本的采集与处理具有重要意义，可能影响研究结果及其解释。因此，为了排除样本间的变异性，应在所研究的淡水体多个不同位置进行采样。在处理此类样本时，维持适当的无菌环境条件可防止污染。此外，为避免细菌组成发生变化而影响提取核酸的质量和数量，样本从采集到后续处理的运输过程应保持在4 °C条件下，并尽量缩短时间间隔。已有多个研究指出，若未谨慎控制样本采集与处理之间的这一过渡期，可能在后续分析阶段导致结果出现差异12,13。

使用不同稀释度进行涂布可确保菌落既不会重叠成团，也不会因数量过少而难以计数。实验需设置重复组，以消除因移液或操作误差导致的CFU/mL结果差异。此外，每次实验均需设置对照组平板，以确认所用抗生素有效，并排除假阳性结果。因此，对照组平板上应无可见菌落生长，这表明所用抗生素具有抑菌效果。

在进行药敏试验（AST）时，接种菌液的浓度和琼脂平板的厚度可能影响抑菌圈（ZOI）的直径，从而影响结果的判读。因此，在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了孟买大学科学技术部—促进大学研究与科学卓越计划（DST-PURSE）项目资金的资助。Devika Ghadigaonkar 在该计划下担任项目研究员。特此致谢科学技术部—科学与工程研究委员会（DST-SERB）项目（编号：CRG/2018/003624）的高级研究员 Harshali Shinde 提供的技术协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 bp DNA 标准分子量标记HimediaMBT049-50LN用于估计扩增片段的大小
2x PCR Taq 预混液HiMediaMBT061-50R用于配制 PCR 反应体系
37 °C 培养箱GS-192, Gayatri ScientificNA用于细菌培养
6x 上样缓冲液HiMediaML015-1ML上样和示踪染料，有助于增加 DNA 样品比重并监测电泳进程
琼脂糖粉末HimediaMB229-50G用于琼脂糖凝胶电泳（AGE）中分离扩增产物
氨苄西林抗生素纸片HiMediaSD002用于进行抗生素敏感性试验（AST）
高压灭菌器EquitronNA用于培养基、玻璃平板、试管等物品的灭菌
Bioanalyzer 2100Agilent TechnologiesNA用于检测扩增文库的质量和数量
生物安全二级 B2 型柜IMSETIMSET BSC-Class II Type B2用于细菌培养、抗生素敏感性试验（AST）等微生物学操作
头孢噻肟抗生素纸片HiMediaSD295E-5VL用于进行抗生素敏感性试验（AST）
头孢噻肟抗生素粉末HiMediaTC352-5G用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
头孢曲松抗生素纸片HiMediaSD065用于进行抗生素敏感性试验（AST）
微量离心机 MinispinEppendorfMinispin Plus-5453用于粗提 DNA 过程中沉淀杂质
氯霉素抗生素纸片HiMediaSD006-5x50DS用于进行抗生素敏感性试验（AST）
环丙沙星抗生素纸片HiMediaSD060-5x50DS用于进行抗生素敏感性试验（AST）
环丙沙星抗生素粉末HiMediaTC447-5G用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
比色计QuestNA用于测定菌液悬浮液的光密度（OD）
综合性抗生素耐药基因数据库（CARD）用于抗生素耐药基因（ARGs）的功能注释；https://card.mcmaster.ca/
冷却摇床培养箱BTL41 Allied ScientificNA用于培养细菌的培养基平板的孵育
超低温冰箱（-40 °C） HaierDW40L, Haier Biomedicals用于甘油菌种的保存
DNA 文库构建试剂盒NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for IlluminaNA用于双端测序文库的制备
EDTAHiMediaGRM1195-100G用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液
电泳装置TechResource15 cm 凝胶制胶托盘用于制备琼脂糖凝胶 并进行电泳 
带电极的电泳电源GeneiNA用于运行琼脂糖凝胶电泳（AGE） 
红霉素抗生素纸片HiMediaSD222-5VL用于进行抗生素敏感性试验（AST）
红霉素抗生素粉末HiMediaCMS528-1G用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
红霉素抗生素粉末HiMediaTC024-5G用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
Escherichia coli ATCC 25922    HiMedia0335X-1在进行抗生素敏感性试验（AST）时作为对照菌株
溴化乙锭HiMediaMB071-1G用于电泳后在凝胶成像系统下对 DNA 进行嵌入染色和可视化
荧光计Qubit 2.0NA用于测定提取的宏基因组 DNA 的浓度
凝胶成像系统BioRad用于电泳后观察 PCR 扩增产物
庆大霉素抗生素纸片HiMediaSD170-5x50DS用于进行抗生素敏感性试验（AST）
冰乙酸HiMediaAS119-500ML用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液
甘油HiMediaGRM1027-500ML用于制备甘油菌种保存液
亚胺培南抗生素纸片HiMediaSD073用于进行抗生素敏感性试验（AST）
Kaiju 数据库NANA用于测序读段的分类学归属分析；https://kaiju.binf.ku.dk/
卡那霉素抗生素纸片HiMediaSD017-5x50DS用于进行抗生素敏感性试验（AST）
卡那霉素抗生素粉末HiMediaMB105-5G用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
左氧氟沙星抗生素纸片HiMediaSD216-5VL用于进行抗生素敏感性试验（AST）
LB 肉汤培养基HimediaM1245-500G用于菌液的富集培养
麦氏比浊标准HimediaR092-1No用于比较菌液悬浮液的浓度
分子生物学用水HiMediaTCL018-500ML用于配制 PCR 反应体系
穆勒-欣顿琼脂（MHA） HiMediaM173-500G用于进行抗生素敏感性试验（AST）
新霉素抗生素纸片HiMediaSD731-5x50DS用于进行抗生素敏感性试验（AST）
PCR 梯度热循环仪EppendorfMastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz 用于扩增 16S rRNA 区域及多种抗生素耐药基因的 PCR 反应
引物 XcelrisNA用于 PCR 扩增 
改良 R2A 琼脂HiMediaM1743用于制备培养基平板，以分离总细菌和抗生素耐药菌（AR）
支架序列生成CLC Genomics Workbench 6.0NA用于生成支架序列
测序仪Illumina 平台（2 x 150 bp 化学体系）NA用于扩增文库的测序
氯化钠 HiMediaTC046-500G用于配制 0.85% 生理盐水，以对水样进行系列稀释
土壤 DNA 提取试剂盒XcelgenNA用于从过滤后的水样中提取完整的宏基因组 DNA 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213HiMedia0365P在进行抗生素敏感性试验（AST）时作为对照菌株
分类学归属分析Kaiju 生物信息学工具NA用于将测序读段分类至从门到属的不同分类学层级 
综合性抗生素耐药基因数据库（CARD）NANA用于抗生素耐药基因（ARGs）的功能注释
替加环素抗生素纸片HiMediaSD278用于进行抗生素敏感性试验（AST）
甲氧苄啶抗生素纸片HiMediaSD039-5x50DS用于进行抗生素敏感性试验（AST）
Tris 碱HiMediaTC072-500G用于配制琼脂糖凝胶电泳（AGE）的凝胶运行缓冲液
万古霉素抗生素粉末HiMediaCMS217用于制备分离耐药菌过程中所需的抗生素储备液
电子天平Mettler ToledoME204 Mettler Toledo用于称量培养基粉末、试剂粉末等
NA - 不适用

参考文献

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