急性肾损伤研究中双侧肾缺血-再灌注小鼠模型的技术优化

摘要

本研究建立了一种针对双侧肾缺血-再灌注小鼠模型的技术优化方案，用于急性肾损伤研究。

摘要

心脏骤停对公共卫生构成了重大负担。急性肾损伤（AKI）是心肺复苏成功、自主循环恢复（ROSC）后心脏骤停幸存者中的不良预后标志。相反，AKI后肾功能的恢复是神经功能良好预后和出院的预测指标。然而，目前尚缺乏有效干预措施以预防心脏骤停ROSC后所致的肾脏损伤，提示需要开发额外的治疗策略。肾灌注不足和再灌注是导致心脏骤停后发生AKI的两个病理生理机制。双侧肾脏缺血-再灌注诱导的急性肾损伤（IR-AKI）动物模型在临床环境中与ROSC后发生AKI的患者具有可比性。然而，由于该模型具有高死亡率以及肾损伤程度变异较大，双侧肾脏IR-AKI在技术上难以进行分析，可能影响实验结果的解读。通过选择体重较轻的小鼠，在异氟烷全身麻醉下采用背外侧手术入路，并在术中维持体温，可减少组织损伤，从而建立一种可重复的急性肾IR-AKI研究方案。

引言

心脏骤停在美国每年发生超过8万例^1,2。心脏骤停的死亡率极高^3,4,5,6。急性肾损伤（AKI）是与心脏骤停患者在自主循环恢复（ROSC）后高死亡率及不良神经功能预后密切相关的重要危险因素^{7,8,9,10,11,12,13}。AKI的恢复是患者良好神经功能预后及顺利出院的有效预测指标^14,15,16。然而，目前仍缺乏针对缺血-再灌注所致急性肾损伤（IR-AKI）的有效治疗手段^{15,16,17,18,19}。需要开发更多治疗策略，以进一步改善该疾病的临床预后。

采用双侧肾缺血方法的肾缺血-再灌注急性肾损伤（IR-AKI）是急性肾损伤（AKI）研究中常用的动物模型之一^{20,21,22,23,24,25,26}。与用于研究心肺复苏后自主循环恢复（ROSC）患者发生AKI的全身性缺血-再灌注损伤模型相比，肾IR-AKI动物模型更为简单^{6,27,28,29,30}。这意味着由于实验中混杂因素较少，肾IR-AKI动物模型更容易获得一致的结果。此外，肾IR-AKI实验方案通常包括单侧或双侧肾蒂阻断。双侧肾IR-AKI实验条件与成功心肺复苏后发生心脏骤停的患者在ROSC后出现AKI的临床情况具有可比性。尽管两种模型的肾脏病理特征均能反映人类肾缺血-再灌注损伤的病理特征^31,32,33，但双侧肾缺血方法更贴近人类病理状态下（如心力衰竭、血管收缩和脓毒性休克）的AKI情况³⁵。因此，双侧肾IR-AKI动物模型适用于研究心脏骤停后ROSC阶段的肾缺血-再灌注损伤。

双侧肾缺血-再灌注急性肾损伤（IR-AKI）模型存在技术难度高、实验复杂以及手术时间长等问题^{23,26,32,33,35,36}。为克服这些技术难题，本研究通过若干技术改进，建立了一种可靠的小鼠双侧IR-AKI研究方案。该方案可显著减少手术并发症、减轻组织损伤，并降低术中死亡率。因此，该模型可用于研究心肺复苏后急性肾损伤的病理生理过程，进而开发针对肾脏低灌注及再灌注损伤的新型治疗策略^37,38,39。

方案

所有动物实验均按照 实验动物护理和使用的指南，由美国国立卫生研究院（NIH出版物编号85-23，1996年修订版）发布。本研究方案经辅仁天主教大学机构动物照护与使用委员会批准，并遵循其指导方针。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料和仪器的详细信息。

1. 小鼠的准备

1. 选取8周龄的C57BL/6雄性小鼠，体重为21–23 g。
2. 将小鼠饲养在温度受控（21 ± 2 °C）、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中，可自由摄取食物、标准小鼠饲料颗粒和自来水。

2. 麻醉

1. 戴上外科口罩和无菌手套。
2. 在诱导室中使用2%异氟烷与氧气以1 L/min的流速混合，使小鼠进入麻醉状态。
3. 通过足底反射评估麻醉深度。
   ​注意：足底反射是指用力捏压后肢脚趾时后肢足部的回缩反应。当足底反射消失时，表明麻醉已完全生效。
4. 待麻醉完全后，将每只小鼠移至带有电热毯的手术平台，使其呈俯卧位，以维持体温。术前应稳定体温，并使用直肠温度探头进行监测。 在双眼涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
5. 用胶带将小鼠的四肢固定在手术板上。
6. 将麻醉面罩固定于小鼠面部，持续供给1%异氟烷和1 L/min氧气。
7. 在手术过程中定期通过足底反射评估麻醉深度，并根据情况调整麻醉剂的供给。

3. 双侧肾缺血-再灌注急性肾损伤手术

1. 用手触摸小鼠背部，手动定位其腰椎。沿脊柱向头部方向移动，寻找位于小鼠最后一根肋骨两侧下方的肋椎角。
2. 在双侧肋脊角区域涂抹脱毛乳液，约30秒后用生理盐水清除毛发。
3. 消毒剃毛后的皮肤 经过三轮 聚维酮碘溶液和75%酒精，使用棉球。
   注意：在整个手术过程中保持无菌区域至关重要。使用手术巾覆盖并采用无菌器械。
4. 使用精细尖头镊子轻轻提起左侧肋脊角下方的皮肤，然后使用剪刀 沿左侧腰部脊柱中线处的皮肤张力线做一条1 cm长的斜向背外侧切口。使用剪刀切开左侧腰部的肌壁，以暴露左肾。
5. 重复上述手术步骤以暴露右侧肾脏。使用无菌棉签清除手术过程中产生的少量血液。
6. 用镊子小心地将左肾从周围组织中推开并分离。暴露左肾后，辨认肾蒂。
   注意：务必小心，避免损伤肾上腺及其周围血管。
7. 用微血管夹夹闭左侧肾蒂25分钟。通过观察肾脏颜色由粉红色变为暗红色来确认缺血。
8. 用无菌生理盐水浸湿的棉球覆盖夹闭的肾脏，以避免左肾蒂夹闭期间肾脏干燥。
9. 重复上述手术操作，使用微血管夹夹闭右侧肾蒂25分钟。
10. 用无菌生理盐水浸湿的棉球覆盖已夹闭的肾脏，以防止在右肾蒂夹闭期间肾脏干燥。
11. 定期监测麻醉深度及无菌生理盐水浸湿的棉球的湿度。
12. 打开左侧微血管夹，开始左肾再灌注。通过观察左肾颜色由暗红色变为粉红色来确认再灌注成功。
13. 打开右侧微血管夹，以启动右肾的再灌注。
14. 确认肾脏颜色变化后，将肾脏放回腹腔。
15. 使用6-0可吸收缝合线缝合腹腔和皮肤。
16. 使用棉球蘸取碘伏溶液和75%酒精擦拭伤口以进行消毒。
17. 仔细观察动物，直到它开始自由活动并进食。
    注意：需密切观察动物，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。
18. 皮下注射卡洛芬（5 mg/kg，0.2 mL）以预防术后疼痛，持续给药2-3天。

结果

在进行进一步的显微或分子分析之前，应评估双侧肾缺血-再灌注急性肾损伤（IR-AKI）手术的质量。手术过程中，当使用微血管夹夹闭肾蒂后，若肾脏颜色由粉红色迅速变为深红色，则可确认肾缺血已成功诱导（图1）。术后可通过下颌下采血获取少量血清进行生化分析，以进一步验证IR-AKI手术所致的肾损伤；分析结果应显示血尿素氮和肌酐水平较基线显著升高（图2）。

图1：肾蒂夹闭后的肾缺血。 肾脏颜色由粉红...

讨论

所提出的双侧IR-AKI方案适用于研究双肾低灌注及再灌注损伤的机制。该方案建议使用体重较轻的小鼠，采用异氟烷进行全身麻醉，通过背外侧入路实施手术，并在术中维持体温，这些措施有助于减轻相关技术难度，缩短手术时间，并提高急性双侧肾IR-AKI研究中操作的一致性。

技术难度会影响双侧肾缺血-再灌注急性肾损伤（IR-AKI）手术中肾损伤的严重程度³³。除了小鼠品系、性别、年龄和加热系统^{36,40,41,42,43,44}外，血管夹的正确放置对于获得一致的结果至关重要。已有研究建议仔细分离周围脂肪组织，以充分暴露肾脏及其肾蒂或肾动脉

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可吸收缝合线，6-0	Ethicon	J510G-BX
聚维酮碘溶液	Shineteh Istrument
卡洛芬	Sigma	PHR1452
棉球	Shineteh Istrument
格雷夫镊	Fine Science Tools	11051-10
加热垫	Shineteh Istrument
异氟烷	Piramal Critical Care Inc.	26675-46-7
莫里亚血管钳	Fine Science Tools	18320-11
Olsen-Hegar 持针器	Fine Science Tools	12002 - 12
生理盐水	Shineteh Istrument
手术刀片	Shinva	s2646
小动物麻醉机	Sheng-Cing Instruments Co.	STEP AS-01
组织剪	Fine Science Tools	14072 - 10