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方法文章

麻醉与插管未成年幼鼠以进行心胸外科手术

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DOI：

10.3791/64004

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2022年6月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Cardiology and Biophysics Division, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent’s Clinical School, University of New South Wales Sydney, 3Department of Anaesthesia, The Children’s Hospital at Westmead, 4School of Child and Adolescent Health, University of Sydney

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

小鼠心脏胸外科手术模型 >7日龄小鼠需要进行插管，但对学龄前（8-14日龄）幼鼠实施插管具有挑战性，且目前关于插管麻醉方案的信息十分有限。本文提供了10日龄C57BL/6J幼鼠使用氯胺酮/赛拉嗪/阿托品的给药方案，可在实现气管插管的同时，最大限度降低动物死亡率。

摘要

小鼠外科模型在临床前研究中具有重要作用。通过0至14日龄小鼠的心胸外科手术模型，可深入了解心脏损伤后心肌再生的机制，因为这些小鼠的心肌细胞仍具有增殖能力，而与成年小鼠不同。出生7天内的幼鼠可通过低温实现有效固定，进行心胸外科手术时无需气管插管。然而，青春期前（8至14日龄）的幼鼠则需要气管插管，但该操作具有挑战性，且目前关于促进插管的麻醉方案信息较少。 本文介绍了在10日龄C57BL/6J幼鼠中使用氯胺酮/赛拉嗪/阿托品的剂量方案，该方案可实现气管插管，同时最大限度降低动物死亡率。通过根据体重对氯胺酮/赛拉嗪/阿托品剂量进行经验性滴定，发现不同体重幼鼠对麻醉的反应呈非线性关系：体重在3.15–4.49 g（n = 22）、4.50–5.49 g（n = 20）和5.50–8.10 g（n = 20）的幼鼠分别使用20/4/0.12 mg/kg、30/4/0.12 mg/kg和50/6/0.18 mg/kg的剂量可成功完成插管。体重较低的幼鼠需要更多的插管尝试次数（p < 0.001）。插管后存活率与体重呈正相关（低、中、高体重组分别为59%、70%和80%，R2 = 0.995）。在插管后进行心肌梗死手术时，使用100%氧气中4.5%异氟烷诱导外科麻醉深度，并以100%氧气中2%异氟烷维持。三组体重幼鼠术后存活率相似，分别为92%、86%和88%（p = 0.91）。结合优化的插管与手术操作技术，以及术后减少母鼠对幼鼠的食仔行为，整个操作流程（插管加手术）的总体存活率亦与体重相关（低、中、高体重组分别为55%、60%和70%，R2 = 0.978）。鉴于10日龄幼鼠插管操作困难且伴随较高死亡率，我们建议仅对体重至少为5.5 g的10日龄幼鼠进行心胸外科手术。

引言

小鼠模型在临床前心胸外科研究中是不可或缺的工具，尤其是因为易于构建基因工程小鼠品系，并且易于通过外科操作建立病理疾病模型，从而可用于研究心脏损伤后心肌的再生能力1。值得注意的是，与成年小鼠心肌细胞已退出细胞周期不同，出生后0至2天的新生小鼠心脏在心尖切除或心肌梗死诱导后能够实现修复，且瘢痕形成极少2,3,4 。相比之下，出生7天的小鼠心脏再生能力不完全，瘢痕形成的发生率更高2,3。由于左心室心尖部位的心肌细胞在出生后长达两周内仍保持增殖能力，因此对出生后0至14天小鼠心脏损伤后再生机制的研究，可能有助于识别促进成年受损心脏再生的治疗靶点5。

建立心脏损伤的小鼠模型需要在麻醉下进行外科操作。该过程需打开胸腔以暴露心脏，通常需要气管插管和机械通气。小鼠品系、体重和年龄会影响其对麻醉剂的敏感性6。成年小鼠可使用多种麻醉剂，其中常用于插管的方案为每公斤体重给予100/13/0.5 mg的氯胺酮/赛拉嗪/阿托品6,7。新生小鼠（0–7日龄）缺乏中枢性疼痛反射，可通过冰上麻醉实现有效固定，手术过程中无需气管插管6,8,9。而幼年前期小鼠（8–14日龄）无法通过低温实现有效麻醉9,10，进行心胸外科手术时必须实施气管插管。目前尚无针对14日龄以下幼年前期小鼠开展心胸外科手术的既往研究。根据我们的经验，在14日龄以下的幼年前期小鼠中，使用异氟烷麻醉后进行气管插管操作较为困难。文献报道，适用于7日龄以上小鼠的推荐注射用麻醉方案为每公斤体重50–150 mg氯胺酮和5–10 mg赛拉嗪10。幼年前期小鼠神经系统仍在发育中，其药物反应及药物代谢能力与成年动物存在显著差异6。这使其更容易出现体液、电解质和酸碱平衡紊乱，以及低血糖和低体温，原因不仅在于其高代谢率会迅速耗尽有限的能量储备，还在于其体温调节机制尚未发育成熟6,11,12。因此，目前关于既能便于插管又能最大程度提高幼年前期小鼠存活率的麻醉方案的信息仍十分有限。

本研究对体重在3-8 g之间的10日龄C57BL/6J小鼠幼崽，通过实验性滴定确定氯胺酮/赛拉嗪/阿托品的给药方案，旨在达到足以实施气管插管以进行后续心胸外科手术的麻醉深度，同时尽量降低动物死亡率。此外，我们优化了动物操作技术，以减少因插管、手术及术后母鼠食仔所导致的死亡率。

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方案

所有所述动物实验均经加文医学研究所/圣文森特医院动物伦理委员会批准，符合《澳大利亚科研用途动物护理与使用实践守则》及ARRIVE指南要求，所有实验均由经验丰富的实验动物外科医生（JW）在儿科麻醉师（JJS）的指导下完成。

1. 仪器的准备

  1. 手术当天，准备用于10日龄幼鼠插管的专用设备（图1A，B）。包括一个加热灯、插管平台、光纤光源、小型镊子，以及用一段直径0.02 mm、长60 mm的铜丝制成的喉镜（将铜丝末端弯成直径3 mm的圆环，角度为175°； 图1B，以及一个24号塑料静脉留置针，用作气管插管。
  2. 确保套管由一段19 mm长的塑料管（外径0.7 mm）连接至一个21 mm塑料雌性鲁尔锁接头组成图1B). 通过插入一段铜丝来增加套管导管的刚性 通过 鲁尔锁接头。对于潮气量约为8 μL/g的小鼠，使用总容积为130 μL的套管13,14.

2. 10日龄小鼠的麻醉

  1. 手术当天，从一窝出生10天的C57BL/6J幼鼠的笼子中移除隔板，并将笼子置于预热至37 °C的加热垫上。
  2. 使用0.5 mL胰岛素注射器和29 G针头，按照表1中不同体重分组所列的比例，以每克体重10 μL的剂量，通过腹腔注射给予幼鼠氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品进行麻醉。
  3. 注射后立即把幼鼠放入已预先充入100%氧气的聚甲基丙烯酸甲酯（有机玻璃）腔室中，腔室温度保持在37 °C。

3. 10日龄小鼠的插管

  1. 经过 3-4 分钟的氧合后，将幼鼠转移至插管平台，基本操作与成年小鼠相同。将幼鼠保持仰卧位（图 1C）或以 45° 角悬挂15，并使用加热灯维持体温。
    1. 在插管前，通过足垫夹捏反射评估麻醉深度。为获得最佳插管条件，足垫夹捏反射应仍然存在，但与清醒动物相比明显减弱。
  2. 将麻醉后的幼鼠仰卧固定于插管平台（图 1C）后，用小镊子夹住舌头，并使用一段铜丝制成的喉镜（图 1B）暴露声门和声带。通过柔性光纤光源进行透照，以辅助观察声带（图 1D）。
  3. 使用已加固的套管，倾斜套管使其鲁尔锁端略低于尖端（约 10°），一旦声带分开，立即插入套管并推进，直至鲁尔锁接头刚好位于口腔外。插管完成后立即移除铜丝。
    注意：此年龄段小鼠插管时不应感到明显阻力，除非套管插入过深而触及气管隆嵴。
    1. 插管后通过动物是否能够自主呼吸来评估麻醉深度。通过短暂阻塞插管导管，观察是否随之停止胸廓运动，以确认自主呼吸幼鼠的气管插管成功。
  4. 立即将插管后的幼鼠转移至预热垫（37 °C），并将气管内套管连接至呼吸机，以 1 L/min 的流速输送 100% 氧气，潮气量根据幼鼠体重分别设置为：3.15–4.59 g 幼鼠使用 30 μL/次，4.50–5.49 g 幼鼠使用 40 μL/次，5.50–8.10 g 幼鼠使用 50 μL/次，呼吸频率为 150 次/分钟。
  5. 应迅速完成上述操作，全程在 <15 秒内完成，以尽量减少重复呼吸。

4. 10日龄小鼠心肌梗死手术

  1. 为手术诱导外科麻醉平面，将流入呼吸机的气体从100%氧气切换至含4.5%异氟烷的氧气（异氟烷浓度由蒸发器控制），持续4–5分钟。
    1. 切换至异氟烷后，通过观察胸壁运动频率是否与呼吸机频率一致，再次确认气管插管位置正确。自主呼吸消失，且尾部或足垫夹捏反射消失，表明已达到外科麻醉平面（通常在4–5分钟后）。
  2. 以2%异氟烷在氧气中维持麻醉。
  3. 在手术显微镜（10倍和16倍物镜）下进行心肌梗死手术，步骤如文献16所述。
    1. 使用碘伏或氯己定消毒液与70%酒精交替多次环形擦拭皮肤进行消毒。使用精细剪刀在左侧胸壁第三与第四肋骨之间（第四肋间隙）做一横向皮肤切口。使用精细镊子钝性分离肋间组织以打开胸腔，并使用牵开器保持切口开放。
    2. 在左心耳远端处，使用9-0单丝聚丙烯缝线结扎左冠状动脉以诱导心肌梗死。心肌梗死手术过程约持续10分钟，术后使用7-0 Prolene缝线缝合皮肤，并用碘伏消毒切口。用70%乙醇或生理盐水清洁幼崽体表血液。
      注：在未成年幼崽中结扎左冠状动脉几乎无出血，与成年动物结扎情况相似。
    3. 使用0.5 mL胰岛素注射器和29 G针头依次给予以下药物：阿替美唑（1–5 mg/kg，10 μL，腹腔注射），用于快速逆转镇静；镇痛药（布托啡诺，0.075 mg/kg，10 μL，皮下注射）；以及生理盐水（50 μL，腹腔注射）。
  4. 通过停止异氟烷供应使动物恢复，确保几分钟内自主呼吸恢复。
    1. 将幼崽放回预热并预先充氧的恢复舱内，持续监测直至翻正反射恢复，此时可拔除气管插管。
    2. 用母鼠笼内垫料轻轻擦拭幼崽，保持其体温，检查呼吸是否规律，并确认幼崽具备自主活动能力。此举可减少母鼠术后食仔行为的发生。
  5. 当所有幼崽完全从麻醉中恢复后，将母鼠放回笼中。
    注：单只幼崽的准备、麻醉、插管、手术及恢复全过程耗时通常为40–60分钟。
  6. 将母鼠与幼崽共同饲养于笼中，笼子一半置于37 °C加热垫上，另一半不加热，过夜饲养。

5. 手术后梗死面积的评估

  1. 第3天rd 术后第1天，将幼鼠置于已预先平衡的亚克力玻璃舱内，以1 mL/min的流速吸入4.5%异氟烷（溶于氧气中）进行麻醉。
  2. 当达到外科麻醉平面（通过足垫夹捏反射评估，约4-5分钟后），将幼鼠从麻醉舱中取出，用胶带固定尾巴，使其仰卧于加热垫上。
  3. 将一根线置于门齿上方并用胶带固定，以保持头部伸展，随后将头部放入与呼吸机相连的鼻罩中，呼吸机以200 µL/次、150次/分钟的频率输送含4.5%异氟烷的氧气。以2%异氟烷维持手术麻醉深度。
  4. 用70%乙醇对皮肤进行消毒。使用精细剪刀沿气管方向在右侧颈总动脉上方的皮肤做1 cm切口，暴露血管后用单腔聚乙烯管（外径0.61 mm，内径0.28 mm）插管，注入0.2 mL肝素化生理盐水（200 U），持续1分钟，以防止血液凝固。
  5. 在1分钟内将异氟烷浓度提高至4.5%（以氧气为载体），随后在2秒内快速注入0.2 mL 3.3 M KCl，使心脏停搏于舒张期。
  6. 解剖右侧颈静脉 通过 同一处切口进行灌注。用0.2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）灌注心脏，随后用0.1 mL的0.2%阿尔新蓝（Alcian Blue）灌注以染色非梗死的远端心肌。检查灌注是否成功，成功标志为血液、PBS以及随后的阿尔新蓝被充分冲洗出来。 通过 颈静脉
  7. 打开胸腔，通过解剖周围结缔组织和血管分离心脏。用 PBS 冲洗心脏，根据需要去除心房，并使用安装在手术显微镜上的相机（物镜倍数为 10x）拍摄心脏照片。

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结果

10日龄小鼠的麻醉。 10日龄幼鼠可在4-5分钟内通过4.5%异氟烷实现麻醉；然而，在气管插管准备过程中，它们会从麻醉状态中恢复。由于体型较小，使用标准鼻罩输送异氟烷进行麻醉时无法完成插管。我们此前曾对15日龄、21日龄幼鼠及成年小鼠的心胸外科手术采用过剂量分别为100/13/0.5 mg/kg的氯胺酮/赛拉嗪/阿托品麻醉方案4,7。在包括供氧在内的初步实验中发现，文献推荐的注射用麻醉剂量（氯胺酮50-150 mg/kg，赛拉嗪5-10 mg/kg）10在10日龄幼鼠中导致不可接受的高死亡率。鉴于10日龄幼鼠体重与同窝数量之间存在显著的负相关关系（R2 = 0.250，p < 0.0001；图2），我们根据体重分组对麻醉方案进行了滴定调整。将氯胺酮/赛拉嗪/阿托品剂量分别降低至50/6/0.18 mg/kg，可使体重为5.5-8.10 g的自主呼吸幼鼠达...

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讨论

目前尚无针对10日龄小鼠进行心脏胸外科手术的麻醉与插管操作的完善记录方法。为此，我们根据体重调整了氯胺酮/赛拉嗪/阿托品的给药方案，结果表明，对于体重较低（3.15–4.49 g）、中等（4.50–5.49 g）和较高（5.50–8.10 g）的幼鼠，分别采用20/4/0.12 mg/kg、30/4/0.12 mg/kg和50/6/0.18 mg/kg的剂量可有效实现插管。插管后的存活率与体重呈正相关（低体重组、中体重组和高体重组的存活率分别为59%、70%和80%）。鉴于对10日龄幼鼠进行插管操作存在较大难度且伴随较高的死亡率，我们建议仅对体重至少为5.50 g的10日龄幼鼠实施心脏胸外科手术。该插管技术的一个局限性在于其依赖操作者的技能水平和经验，以及学习掌握的速度。然而，预计具备成年小鼠插管经验的操作者，在对10窝每窝7至8只幼鼠进行练习后，即可熟练掌握青春期前幼鼠的插管技术。另一局限性是插管及心肌梗死手术后幼鼠的整体存活率介于55%（最低体重组）至70%（最高体重组）之间。尽管如此，该存活率与报道中无需插管的1日龄幼鼠在冰上固定后接受心肌梗死手术的60%–70%存活率相近8。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由澳大利亚国家健康与医学研究理事会项目资助 [ID 1074386]、心血管研究勒杜克跨大西洋卓越网络资助 [RMG] 以及 RT Hall 信托基金资助 [RMG & SEI] 提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿替美唑（Antisedan）Provet (NSW) Pty LtdATIP I
阿托品 600 mcg/mLClifford Hallam Healthcare Pty Ptd1957699 PFIZER-0143386
聚维酮碘（Betadine）Livingstone InternationalBU0520
丁丙诺啡（Temgesic）Provet (NSW) Pty LtdTEMG I
光纤光源Leica 3011350CLS 150X
GraphPad PrismGraphPad Software, LLC版本 9.1.2
插管平台 ——任何坚固的盒子（例如塑料吸头盒），尺寸约为 12 (长) × 8.5 (宽) × 7.5 cm (高)
异氟烷Provet (NSW) Pty LtdISOF 07
氯胺酮 100 mg/mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1
24 号塑料静脉套管 Polywin Safety BD Insyte CE0086一段长度为 19 mm、外径 0.7 mm 的塑料管，连接一个 21 mm 塑料雌性鲁尔锁接头；套管总体积为 130 μL
单腔聚乙烯管Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW外径 0.61 mm，内径 0.28 mm
小型镊子F.S.T.NO 11051-10
手术显微镜（可选配相机）Leica M651（Leica IC80 HD 相机）10× 和 16× 物镜
7-0 普理灵缝线Ethicon8708H
9-0 单丝聚丙烯缝线Ethicon2813
V-1 台式带主动废气清除功能的异氟烷麻醉系统VetEquip901820
带通风口的 2 升亚克力诱导室VetQuip Pty Ltd94210225 cm (长) × 13 cm (宽) × 11 cm (高)
加热灯Brilant Lighting99223
赛拉嗪Provet (NSW) Pty LtdXYLA Z 2

参考文献

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