麻醉与插管未成年幼鼠以进行心胸外科手术

摘要

小鼠心脏胸外科手术模型 >7日龄小鼠需要进行插管，但对学龄前（8-14日龄）幼鼠实施插管具有挑战性，且目前关于插管麻醉方案的信息十分有限。本文提供了10日龄C57BL/6J幼鼠使用氯胺酮/赛拉嗪/阿托品的给药方案，可在实现气管插管的同时，最大限度降低动物死亡率。

摘要

小鼠外科模型在临床前研究中具有重要作用。通过0至14日龄小鼠的心胸外科手术模型，可深入了解心脏损伤后心肌再生的机制，因为这些小鼠的心肌细胞仍具有增殖能力，而与成年小鼠不同。出生7天内的幼鼠可通过低温实现有效固定，进行心胸外科手术时无需气管插管。然而，青春期前（8至14日龄）的幼鼠则需要气管插管，但该操作具有挑战性，且目前关于促进插管的麻醉方案信息较少。 本文介绍了在10日龄C57BL/6J幼鼠中使用氯胺酮/赛拉嗪/阿托品的剂量方案，该方案可实现气管插管，同时最大限度降低动物死亡率。通过根据体重对氯胺酮/赛拉嗪/阿托品剂量进行经验性滴定，发现不同体重幼鼠对麻醉的反应呈非线性关系：体重在3.15–4.49 g（n = 22）、4.50–5.49 g（n = 20）和5.50–8.10 g（n = 20）的幼鼠分别使用20/4/0.12 mg/kg、30/4/0.12 mg/kg和50/6/0.18 mg/kg的剂量可成功完成插管。体重较低的幼鼠需要更多的插管尝试次数（p < 0.001）。插管后存活率与体重呈正相关（低、中、高体重组分别为59%、70%和80%，R² = 0.995）。在插管后进行心肌梗死手术时，使用100%氧气中4.5%异氟烷诱导外科麻醉深度，并以100%氧气中2%异氟烷维持。三组体重幼鼠术后存活率相似，分别为92%、86%和88%（p = 0.91）。结合优化的插管与手术操作技术，以及术后减少母鼠对幼鼠的食仔行为，整个操作流程（插管加手术）的总体存活率亦与体重相关（低、中、高体重组分别为55%、60%和70%，R² = 0.978）。鉴于10日龄幼鼠插管操作困难且伴随较高死亡率，我们建议仅对体重至少为5.5 g的10日龄幼鼠进行心胸外科手术。

引言

小鼠模型在临床前心胸外科研究中是不可或缺的工具，尤其是因为易于构建基因工程小鼠品系，并且易于通过外科操作建立病理疾病模型，从而可用于研究心脏损伤后心肌的再生能力¹。值得注意的是，与成年小鼠心肌细胞已退出细胞周期不同，出生后0至2天的新生小鼠心脏在心尖切除或心肌梗死诱导后能够实现修复，且瘢痕形成极少^2,3,4 。相比之下，出生7天的小鼠心脏再生能力不完全，瘢痕形成的发生率更高^2,3。由于左心室心尖部位的心肌细胞在出生后长达两周内仍保持增殖能力，因此对出生后0至14天小鼠心脏损伤后再生机制的研究，可能有助于识别促进成年受损心脏再生的治疗靶点⁵。

建立心脏损伤的小鼠模型需要在麻醉下进行外科操作。该过程需打开胸腔以暴露心脏，通常需要气管插管和机械通气。小鼠品系、体重和年龄会影响其对麻醉剂的敏感性⁶。成年小鼠可使用多种麻醉剂，其中常用于插管的方案为每公斤体重给予100/13/0.5 mg的氯胺酮/赛拉嗪/阿托品

方案

所有所述动物实验均经加文医学研究所/圣文森特医院动物伦理委员会批准，符合《澳大利亚科研用途动物护理与使用实践守则》及ARRIVE指南要求，所有实验均由经验丰富的实验动物外科医生（JW）在儿科麻醉师（JJS）的指导下完成。

1. 仪器的准备

1. 手术当天，准备用于10日龄幼鼠插管的专用设备（图1A，B）。包括一个加热灯、插管平台、光纤光源、小型镊子，以及用一段直径0.02 mm、长60 mm的铜丝制成的喉镜（将铜丝末端弯成直径3 mm的圆环，角度为175°； 图1B，以及一个24号塑料静脉留置针，用作气管插管。
2. 确保套管由一段19 mm长的塑料管（外径0.7 mm）连接至一个21 mm塑料雌性鲁尔锁接头组成图1B). 通过插入一段铜丝来增加套管导管的刚性 通过 鲁尔锁接头。对于潮气量约为8 μL/g的小鼠，使用总容积为130 μL的套管^13,14.

2. 10日龄小鼠的麻醉

结果

10日龄小鼠的麻醉。 10日龄幼鼠可在4-5分钟内通过4.5%异氟烷实现麻醉；然而，在气管插管准备过程中，它们会从麻醉状态中恢复。由于体型较小，使用标准鼻罩输送异氟烷进行麻醉时无法完成插管。我们此前曾对15日龄、21日龄幼鼠及成年小鼠的心胸外科手术采用过剂量分别为100/13/0.5 mg/kg的氯胺酮/赛拉嗪/阿托品麻醉方案^4,7。在包括供氧在内的初步实验中发现，文献推荐的注射用麻醉剂量（氯胺酮50-150 mg/kg，赛拉嗪5-10 mg/kg）¹⁰在10日龄幼鼠中导致不可接受的高死亡率。鉴于10日龄幼鼠体重与同窝数量之间存在显著的负相关关系（R² = 0.250，p < 0.0001；图2），我们根据体重分组对麻醉方案进行了滴定调整。将氯胺酮/赛拉嗪/阿托品剂量分别降低至50/6/0.18 mg/kg，可使体重为5.5-8.10 g的自主呼吸幼鼠达.......

讨论

目前尚无针对10日龄小鼠进行心脏胸外科手术的麻醉与插管操作的完善记录方法。为此，我们根据体重调整了氯胺酮/赛拉嗪/阿托品的给药方案，结果表明，对于体重较低（3.15–4.49 g）、中等（4.50–5.49 g）和较高（5.50–8.10 g）的幼鼠，分别采用20/4/0.12 mg/kg、30/4/0.12 mg/kg和50/6/0.18 mg/kg的剂量可有效实现插管。插管后的存活率与体重呈正相关（低体重组、中体重组和高体重组的存活率分别为59%、70%和80%）。鉴于对10日龄幼鼠进行插管操作存在较大难度且伴随较高的死亡率，我们建议仅对体重至少为5.50 g的10日龄幼鼠实施心脏胸外科手术。该插管技术的一个局限性在于其依赖操作者的技能水平和经验，以及学习掌握的速度。然而，预计具备成年小鼠插管经验的操作者，在对10窝每窝7至8只幼鼠进行练习后，即可熟练掌握青春期前幼鼠的插管技术。另一局限性是插管及心肌梗死手术后幼鼠的整体存活率介于55%（最低体重组）至70%（最高体重组）之间。尽管如此，该存活率与报道中无需插管的1日龄幼鼠在冰上固定后接受心肌梗死手术的60%–70%存活率相近⁸。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿替美唑（Antisedan）	Provet (NSW) Pty Ltd	ATIP I
阿托品 600 mcg/mL	Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd	1957699 PFIZER-0143386
聚维酮碘（Betadine）	Livingstone International	BU0520
丁丙诺啡（Temgesic）	Provet (NSW) Pty Ltd	TEMG I
光纤光源	Leica	3011350	CLS 150X
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	版本 9.1.2
插管平台	—	—	任何坚固的盒子（例如塑料吸头盒），尺寸约为 12 (长) × 8.5 (宽) × 7.5 cm (高)
异氟烷	Provet (NSW) Pty Ltd	ISOF 07
氯胺酮 100 mg/mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1
24 号塑料静脉套管 Polywin Safety	BD Insyte	CE0086	一段长度为 19 mm、外径 0.7 mm 的塑料管，连接一个 21 mm 塑料雌性鲁尔锁接头；套管总体积为 130 μL
单腔聚乙烯管	Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW		外径 0.61 mm，内径 0.28 mm
小型镊子	F.S.T.	NO 11051-10
手术显微镜（可选配相机）	Leica	M651（Leica IC80 HD 相机）	10× 和 16× 物镜
7-0 普理灵缝线	Ethicon	8708H
9-0 单丝聚丙烯缝线	Ethicon	2813
V-1 台式带主动废气清除功能的异氟烷麻醉系统	VetEquip	901820
带通风口的 2 升亚克力诱导室	VetQuip Pty Ltd	942102	25 cm (长) × 13 cm (宽) × 11 cm (高)
加热灯	Brilant Lighting	99223
赛拉嗪	Provet (NSW) Pty Ltd	XYLA Z 2