方法文章

由微凝胶棒制备的互连大孔三维支架

DOI：

10.3791/64010

⸱

2022年6月16日

 ,  ,  , 
1DWI - Leibniz Institute for Interactive Materials, 2Institute for Technical and Macromolecular Chemistry, RWTH Aachen University, 3Institute of Applied Medical Engineering, Department of Advanced Materials for Biomedicine, RWTH Aachen University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

通过微流控技术制备具有互补反应性基团的微凝胶棒，可在水溶液中相互连接。这些各向异性的微凝胶会堆积并相互连接，形成比基于球形系统的结构具有更大孔径的稳定构造。经GRGDS-PC修饰的微凝胶可形成可用于细胞培养的大孔三维结构。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

一种基于微流控技术的功能化微凝胶双组分系统，可在水溶液中快速交联形成三维大孔结构，且无需额外添加试剂。通过连续的片上光引发凝胶化过程，可调控微凝胶的长径比，从而决定所获结构的构建单元特性。基于聚乙二醇（PEG）星形聚合物网络，将缩水甘油甲基丙烯酸酯（GMA）或2-氨基乙基甲基丙烯酸酯（AMA）单体共聚入微凝胶网络，以实现环氧或氨基功能化。在微流控出口结构中引入聚焦油相流动，以确保功能化微凝胶棒的连续收集。根据近期发表的研究，基于微凝胶棒构建的结构可形成数百微米尺度的大孔，同时相较于球形模型具有更高的整体支架稳定性。该方法可制备体积更大、自由空间更多的结构，同时减少所需材料用量。交联后的大孔支架可被拾取和转移而不会损坏或解体。未参与交联的氨基和环氧基团仍保持活性，可独立用于后续修饰。本实验方案描述了一种优化的微凝胶棒制备方法，用于构建可进一步应用于细胞实验的大孔交联支架。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

为了研究三维结构中复杂的细胞协同行为，支架平台需要在可重复性方面表现出稳定性能，具备适合细胞迁移的几何结构，同时在参数调整方面具有一定的灵活性，以探究这些参数对活体组织的影响1。近年来，由Segura等人首次提出的宏孔退火颗粒（macroporous annealed particles, MAP）概念，已发展成为一种高效且多功能的三维支架制备平台2。作为最终三维支架构建单元的微凝胶，其定制化的组成预先决定了支架的刚度、凝胶网络的选择性化学反应性以及支架最终的孔径大小2,3,4,5,6。可将细胞黏附肽作为支架与细胞相互作用的信号分子引入微凝胶的聚合物网络中，以促进细胞附着，并可通过改变其种类来研究其对培养细胞的特定影响。三维支架通过退火后的可注射微凝胶之间形成共价键或超分子键而实现交联稳定，从而获得坚固且结构明确的细胞培养体系2,3,5,7,8。

微流控技术已成为制备特定颗粒状水凝胶最精确且适应性最强的方法之一9。该方法能够在连续过程中生产大量所需构建单元，同时保持其化学、机械和物理性质的单分散性，从而显著提升该工艺的适用性。此外，所制备微凝胶的尺寸和形状可通过多种方法进行调控，例如批量乳化、微流控、光刻、电动力喷雾或机械破碎，这些方法决定了构建单元的几何形态，进而影响最终支架的三维结构1,10。

最近，有研究报道了一种由功能化微凝胶棒组成的宏观多孔三维支架，该支架可在水溶液中快速自交联，无需额外添加试剂11。与本研究中使用球形微凝胶相比，微凝胶棒的各向异性导致更高的孔隙率以及更大孔径的孔结构分布11。因此，在维持三维支架稳定性的前提下，使用更少的材料即可形成具有多种不同孔几何结构的大孔。该系统包含两种微凝胶棒，分别带有互补的伯胺和环氧功能基团，当两者接触时，通过交联反应消耗这些基团。未参与交联反应的功能基团仍保持活性，可用于后续选择性修饰，例如接合细胞黏附肽或其他生物活性因子。成纤维细胞在三维支架内部培养时能够黏附、铺展并增殖，最初在微凝胶表面生长，并在5天后填充大部分大孔。一项初步的共培养研究表明，人成纤维细胞与人脐静脉内皮细胞（HUVECs）在交联形成的三维支架内可形成类似血管的结构，结果令人鼓舞11。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 微流控所需的材料和准备工作

  1. 进行所述微流控操作时，使用1 mL和5 mL玻璃注射器及注射泵。通过配备高速相机的倒置显微镜观察芯片上的液滴形成过程。
  2. 使用计算机辅助设计软件创建微流控芯片设计（图1B），并按照已有报道的方法制备母模模板12。
  3. 利用自制的紫外LED（λ = 365 nm，光斑直径约4.7 mm）实现可控的紫外照射，通过厚度为0.13 mm的盖玻片提供957 mW/cm2的辐照度。
    注意：需考虑紫外LED在照射过程中可能产生的局部热量。若存在此情况，应通过外部气流确保充分冷却。

2. 微流控装置的制备

注意：微流控装置的制备基于先前发表的研究13。

  1. 准备 20 g 质量比为 10:1 的聚二甲基硅氧烷（PDMS）与固化剂的混合物。剧烈混合 3 分钟。
  2. 将 60 mg 油红 O 溶解于 2.0 g 甲苯中。取 50 µL 油红 O 甲苯溶液加入 PDMS 混合物中，混合至颜色均匀，以减少不必要的光散射，并在芯片内凝胶过程中保持光斑尺寸聚焦。
  3. 将混合物置于配备真空泵的干燥器中，去除气泡。
  4. 将 PDMS 混合物浇注至母模模板中，高度为 5–5.5 mm，并再次脱气。
  5. 在室温下使 PDMS 固化 18 小时，以避免偶氮染料降解。
  6. 切下 PDMS 结构，并使用线性取芯工具（内径 0.77 mm，外径 1.07 mm）在结构上打出入孔和出孔。
  7. 用异丙醇和去离子水反复清洗 PDMS 和盖玻片 5 次，每次清洗后通过加压空气或氮气流去除液体。
  8. 将干燥的玻璃片和 PDMS 一同放入等离子体炉中，在 0.2 mbar 条件下，以 20 mL/min 的氧气流速、100 W 功率处理 60 秒，随后立即贴合，使玻璃与 PDMS 键合形成微流控装置。
    注意：在键合过程中避免弯曲 PDMS 结构，以最小化通道结构的形变。
  9. 为使微流控芯片的通道具有疏水性，将装置与 50 µL 三氯-(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)-硅烷一同置于真空干燥器中过夜（在降低蒸气压力后关闭与泵的连接）。用氢氟醚冲洗装置外部。
    警告：这些操作应在通风橱中进行，避免与全氟硅烷接触。使用涂抹了真空脂的玻璃真空干燥器。在用于其他用途前应彻底清洁干燥器。

3. 微流控溶液的配制

  1. 对于连续油相，将石蜡油与十六烷按体积比1:1混合，并加入8%（w/w）的非离子型表面活性剂。分别用1 mL（第一油相，图1）和5 mL（第二油相，图1）玻璃注射器盛装。
  2. 在棕色玻璃瓶中配制分散相的预聚物溶液，以防止光引发剂分解和意外凝胶化。
    1. 含GRGDS-PC的胺组分预聚物溶液
      1. 配制300 µL溶液时，称取33.3 mg星形聚乙二醇丙烯酸酯（sPEG-AC）和3.03 mg苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂（LAP）。
      2. 将18.74 mg 2-氨基乙基甲基丙烯酸盐酸盐（AMA）溶于1.5 mL去离子水中，并通过注射器滤器（孔径0.20 µm）过滤。
        注意：AMA具有吸湿性，一旦储存容器中出现结块应立即丢弃。
      3. 将GRGDS-PC以36 mM浓度分装为无菌水溶液，于−20 °C保存直至使用。
      4. 取291.7 µL AMA溶液溶解sPEG-AC和LAP，再加入8.3 µL GRGDS-PC溶液。用1 mL玻璃注射器吸取该溶液，并用铝箔包裹避光。
    2. 环氧组分预聚物溶液
      1. 配制300 µL溶液时，称取33.3 mg星形聚乙二醇丙烯酸酯（sPEG-AC）和3.03 mg LAP，溶于300 µL去离子水中，再加入2.4 mg甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）。
        注意：剧烈振荡可加速GMA溶解。用1 mL玻璃注射器吸取该溶液，并用铝箔包裹避光。

4. 胺基和环氧基功能化微凝胶棒的制备与纯化

静态平衡图；标注的组件；机械系统分析。
图 1：片上凝胶化微流控装置的结构示意图。（A）微流控过程中组件排列的前视图与斜视图。（B）用于微凝胶棒片上凝胶化的微流控芯片设计。（1）通向第一油相入口的PE管。（2）避光PE管，连接分散相入口。（3）通向第二油相入口的PE管。（4）从出口通向产物收集容器的PE管。（5）紫外灯及其在出口附近直行80 µm通道处的照射位置。（6）显微镜物镜/观察位置。（7）微流控装置中着色的PDMS部件。（8）与PDMS键合的盖玻片。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将针头插入PE管中，并排出注射器和管路中的气体。
  2. 将一根PE管插入产物收集出口。
  3. 将所有玻璃注射器放入注射泵中，并将每根管路末端插入相应的入口（图1）。
    注意：使用铝箔或黑色套管保护预聚物管路免受光照，以避免发生非预期的凝胶化。
  4. 将显微镜对焦于油-水相交界面。
  5. 启动第一个油相注射泵（流速 = 100–200 µL/h），先用油相填充通道，以防止分散相润湿通道。
  6. 将第一个油相流速降低至30 µL/h，并启动预聚物注射泵（流速 = 100–200 µL/h），直至在交界面处观察到分散的水相。
  7. 将预聚物流速设定为30 µL/h，并将显微镜对焦于出口处。
  8. 启动第二个油相注射泵（流速为300 µL/h），并等待流动状态稳定。
  9. 将出口管置于收集容器中。
    注意：将管路末端置于容器上部，以避免因产物随时间积累而造成压力升高。
  10. 调节紫外光照射系统，使辐照强度处于900–1000 mW/cm2范围内（所用辐照强度 = 957 mW/cm2），且照射区域位于出口前的直通道部分（图1B）。
    注意：确保不在油-水相交界面附近进行照射，以避免通道堵塞。为提供额外保护，可在装置顶部覆盖照射点之前的通道结构。
  11. 在紫外光照射前，调节预聚物和第一股油相的流速，以获得目标长径比（3.0–4.5范围），并根据照射区域大小将分散相的照射时间设定为约2.3秒。
  12. 开始紫外光照射，并在必要时根据前述步骤再次调节流速。
    注意：初始阶段应观察产物生成情况，监测出口处流动状态的稳定性以及微凝胶棒的均匀性。可调节第二股油相流速以优化产物在出口通道内的输送。
  13. 更换收集容器，并记录产物收集开始时间及各流速。
    注意：防止产物受到灰尘污染。在任一注射器内溶液即将耗尽前停止收集。
  14. 结束收集时，移除收集容器并记录时间，停止紫外光照射及所有注射泵。
  15. 依次用正己烷、异丙醇和去离子水分别洗涤产物5次。在微凝胶棒沉降后移除上清液。
    注意：每次加入溶液后，需小心分散产物，并等待10分钟再更换溶剂，以考虑分子扩散效应。应逐步用去离子水替换异丙醇，防止微凝胶棒浮至液面。增加额外的水洗步骤可进一步减少残留的异丙醇痕迹。

5. 大孔支架的形成

  1. 测定环氧基和氨基功能化样品在分散液中的微凝胶棒数量。
  2. 通过稀释或浓缩调节环氧基和氨基功能化样品的数量，使其达到相近的数值，介于 1,000–5,000 根/100 µL 之间。
    注意：可使用离心机在约 2,000 × g 条件下离心 5–10 秒，以加速微凝胶棒的沉降。若单位体积内微凝胶棒数量过低，可能导致微凝胶棒之间交联形成较小的聚集体，而非一个稳定的结构体。若单位体积内微凝胶棒数量过高，则两种组分的混合质量将受到影响。
  3. 将第一种组分（约 1,200 根）的分散液转移至一个锥形透明 1.5 mL 或 2 mL 样品瓶中。
  4. 以受控方式连续加入第二种组分（使用 100 µL 移液枪）。加样后，立即用移液枪直接混合液体，反复吸取并重新加入。交联结构在混合过程中数秒内形成。
    注意：若形成多个聚集体而非一个完整结构，应重新检查单位体积内的微凝胶棒数量，或改进两种组分的混合控制。

6. 细胞黏附性后修饰

  1. 根据分散聚合相的流速、特定时间内收集的微凝胶数量以及用于支架形成的微凝胶分散液的稀释倍数，计算交联结构中环氧基团的理论数量。
    注意：通过以下公式估算每个支架中环氧基团的理论数量。
    计算环氧基团的公式；显示物质的量、体积流速和时间变量的方程。
    环氧基团计算方程，用于化学分析中估算支架环氧基团的公式。
    nth：环氧基团的理论物质的量
    cGMA：预聚物溶液中GMA的浓度
    Q：预聚物溶液的流速
  2. 将GRGDS-PC溶液加入交联结构中，以含有游离氨基和巯基的细胞黏附肽修饰所有剩余的环氧基团（理论环氧基团数/GRGDS-PC数 = 1）。室温下静置过夜。
  3. 用去离子水洗涤以去除未反应的分子，并移除上清液。

7. 灭菌及转移至细胞培养基

  1. 降低水位至刚好浸没相互连接的支架。
  2. 打开小瓶，并用紫外光照射 λ 250–300 nm。盖紧瓶盖，将瓶子转移至洁净台。用无菌水洗涤1次。
  3. 将小瓶中的水替换为细胞培养基，平衡5分钟。用新鲜的细胞培养基重复此步骤2次。
  4. 将大孔支架通过倾倒或使用刮铲转移至细胞培养板的孔中用于实验。

  

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结果

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显微结晶结构、三维断层成像图和冷冻图像用于结构分析。
图 2：大孔交联支架结构。（A）相互连接的大孔支架的共聚焦显微镜Z轴堆叠图像（500 µm）的三维投影。比例尺为 500 µm。（B）由约 10,000 个微凝胶棒组成的相互连接的支架，样品为直接从水中取出的盖玻片。比例尺为 5 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

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讨论

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本方案中的一个关键步骤是用作共聚单体以实现伯胺官能化的2-氨基乙基甲基丙烯酸酯（AMA）的质量。AMA应为细颗粒状、 preferably 无色的粉末，并以气密棕色玻璃容器封装。应避免使用呈绿色且结块的材料，因其会显著影响凝胶化反应，并对实验结果的可重复性产生不利影响。若出现凝胶效果差或微凝胶棒不稳定的情况，可考虑更换供应商。

如果胺基和环氧微凝胶棒的混合导致形成多个相互连接的团簇，而非一个稳定的结构，则需检查每种储备分散液中的微凝胶棒数量，并将两种样品中的数量调整至相近值，范围控制在每100 µL含1,000–5,000根微凝胶棒。若微凝胶的尺寸与本文所述数值存在显著差异，应根据体积分数调整微凝胶棒的数量：当凝胶尺寸较小时，增加单位体积内的数量；反之则减少。

该方法未着重优化混合过程，以实现对两种互补功能化混合组分更精确的组装控制。由于交联反应在数秒内即发生，通过简单地依次移取两种组分，即可通过调节形成单个交联结构所需的分散液体积以及所用微凝胶的体积分数，获得稳定的宏观多孔结构。未来，若能分析微凝胶棒状分散液的流动与混合特性...

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披露

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作者保证不存在利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢之前研究工作的共同作者，本方法学基于他们的工作，他们是Céline Bastard、Luis P. B. Guerzoni、Yonca Kittel、Rostislav Vinokur、Nikolai Born和Tamás Haraszti。我们衷心感谢德国研究基金会（DFG）在项目B5和C3 SFB 985"功能性微凝胶与微凝胶系统"中的资助。我们感谢莱布尼茨参议院竞赛委员会（SAW）在教授职位计划（SAW-2017-PB62：BioMat）下的资助。我们诚挚感谢欧洲委员会（EUSMI，731019）提供的资金支持。本研究部分在化学聚合物技术中心（CPT）完成，该中心得到了欧盟和德国北莱茵-威斯特法伦州的资助（资助号EFRE 30 00 883 02）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABIL EM 90Evonik144243-53-8非离子表面活性剂
2-氨基乙基甲基丙烯酸酯盐酸盐TCI ChemicalsA3413>98.0%(T)(HPLC)
8臂PEG-丙烯酸酯 20 kDaBiochempeg Scientific Inc.A88009-20K≥ 95 %
AutoCAD 2019Autodesk计算机辅助设计（CAD）软件；微流控结构建模
CHROMAFIL MV A-20/25 注射器滤器CHROMAFILCarl Roth GmbH+Co.KGXH49.1孔径 0.20 µm；混合纤维素酯（MV）
盖玻片Marienfeld-Superior1号类型
EMS Swiss line 0.75 mm 芯取样工具Electron Microscopy Sciences内径 0.77 mm，外径 1.07 mm
无水乙醇VWR Chemicals
FL3-U3-13Y3M 150 FPS 系列高速相机FLIR Systems
荧光胺异构体 ISigma-Aldrich201626
异硫氰酸荧光素Thermo Fisher Scientific46424
25G x 5/8’’ 0.50 x 16 mm 针头BD Microlance 3
甲基丙烯酸缩水甘油酯Sigma-Aldrich779342≥97.0% (GC)
GRGDS-PCCPC ScientificFIBN-015A
Hamilton 1000 系列气密注射器Thermo Fisher Scientific10772361/10500052PTFE 鲁尔锁
己烷Sigma-Aldrich1,04,367
苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂Sigma-Aldrich900889≥95 %
Motic AE2000 三目显微镜Ted Pella, Inc.22443-12
Novec 7100Sigma-AldrichSHH0002
油红OSigma-AldrichO9755
石蜡VWR Chemicals24679320
Pavone 纳米压痕平台Optics11Life
磷酸盐缓冲液Thermo Fisher ScientificAM9624
聚乙烯管 0.38×1.09 mm 医用级dropletex内径 0.38 mm，外径 1.09 mm
2-丙醇Sigma-Aldrich190764ACS 试剂，≥99.5%
蛋白低吸附管Eppendorf30108132
Pump 11 Pico Plus Elite 可编程注射泵Harvard Apparatus
RPMI 1640 培养基Gibco11530586
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体试剂盒Dow SYLGARD634165S
三氯-(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)-硅烷Sigma-Aldrich448931
UVC LED 消毒箱UVLED Optical Technology Co., Ltd.9S SZH8-S2

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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